quantitativa degli estrogeni e dei progestinici

Paolo Del Monte - Dello Socrate Fornaciari
Massimo Pittano - Marzio Monari
Dosaggi immunoenzimatici: determinazione
quantitativa degli estrogeni e dei progestinici
CUPA.
centro
ricerche,
produzioni
animali
r/ggìo finilio
Dosaggi immunoenzimatici:
determinazione quantitativa
degli estrogeni e deiprogestinicf
Paolo Del Monte
Ist. di Allevamenti Zootecnici (Direttore: prof. Vincenzo Russo) - Facoltà di Agraria - Università di Bologna - Corso di Laurea in Scienze della
Produzione Animale - Reggio Emilia
Dello Socrate Fornaciari - Massimo Pittano - Marzio Monari
Centro Ricerche Produzioni animali - Reggio Emilia
OBIETTIVO - La recente disponibi
lità
di
metodi
immunoenzimatici
permette di dosare con precisione e
rapidità antigeni, apteni o anticorpi.
Tra i composti ad azione aptenica vi
sono anche gli ormoni steroidei ed in
particolare quelli estrogeni e progestinici. Scopo della rassegna è di for
nire un quadro critico del dosaggio
immunoenzimatico degli ormoni
estrogeni e progestinici, mettendone
in risalto gli aspetti favorevoli.
PAROLE
CHIAVE:
Immunoenzi-
mologia, E.L.I.S.A., estrogeni, proge
stinici, ormoni, laboratorio clinico,
apteni steroidei, proteine di trasporto.
Premesse
L'uso analitico delle reazioni anti
gene-anticorpo ha recentemente tro
vato una nuova linea di sviluppo con
l'adozione di antigeni e anticorpi
marcati. Le sostanze usate per mar
care i reagenti immunologici posso
genti in preparazioni istologiche e di
bande di precipitazione nelle tecni
no essere di vario tipo; tra esse si
che di immunodiffusione ed immu-
possono ricordare:
A) i coloranti fluorescenti, come
noelettroforesi. Vengono anche usati
per marcare antigeni, apteni e anti
corpi e utilizzati nei dosaggi immu
fluorescina e rodanina legati ad an
tigeni, ma soprattutto ad anticorpi,
vengono usati in lavori di istologia e
citologia e anche per analisi di tipo
quantitativo;
B) i radioisotopi possono essere
accoppiati sia al composto ad attività
antigenica che all'anticorpo. Questa
tecnica è alla base dei dosaggi radio
immunologici (radio-immunoassay:
R.I.A.) che uniscono una elevata
sensibilità ad una notevole specifi
cità permettendo il dosaggio di molti
composti biologicamente importanti
e presenti a concentrazioni molto
basse (15-16-24-25). Un campo no
tevole di applicazione di questo tipo
di dosaggio è la determinazione degli
ormoni effettuabile, un tempo, con
metodiche di tipo biologico relativa
mente difficoltose, lunghe e caratte
(') Ricerca promossa dal Centro Ricerche
Produzioni Animali di Reggio Emilia con fi
nanziamento della Regione Emilia-Romagna
- II Dipartimento Agricoltura e Alimentazio
ne.
OBIETTIVI VETERINARI
rizzate da un'alta imprecisione;
C) gli enzimi sono stati usati come
agenti marcanti per l'identificazione
e la localizzazione di immunorea-
noenzimatici (27). Le determinazioni
immunoenzimatiche
(Enzyme-im-
munoassays: E.I.A.) sono metodi
analitici per identificare e/o quanti
ficare antigeni, apteni o anticorpi in
fluidi biologici, facendo uso di mar
canti enzimatici e usando appunto la
misura dell'attività enzimatica come
amplificatore di reazione. Infatti una
mole di enzima è in grado di avere
una resa in prodotto idrolizzato su
periore a IO5 molecole per minuto(18). L'E.I.A. può essere di due ti
pi:
C-I) E.I.A. omogeneo. L'enzima,
una volta legato all'immunoreagente
da dosare, rimane attivo se il com
posto da esso marcato è libero; viene
al contrario inattivato dall'avvenuta
unione tra composto marcato e con
troparte immunitaria (vedi fig. 1).
Si può in questo caso misurare
l'attività
enzimatica
dell'enzima
marcante direttamente sulla miscela
X/19
m
Fig. 1 - Principio dell'I- .1.A. omogeneo; A, an
ticorpo; Ea, enzima attivo; Ei, enzima inibito;
H, aptene.
tica sull'uso del dosaggio immunoenzimatico per la determinazione
di una particolare classe di composti
ad azione aptenica: gli ormoni ste
roidei con particolare riferimento
agli estrogeni e progestenici( 19-26).
A questo proposito si premette che
verranno considerati solo i dosaggi
indicati con una linea continua. I le
gami disposti sotto il piano del foglio
sono invece di tipo a, e vengono in
dicati con una linea tratteggiata.
Prendiamo per esempio la seguente
struttura parziale:
immunoenzimatici di tipo eteroge
di reazione(31). L'E.I.A. omogeneo
viene anche denominato dosaggio
immunologico a inibizione d'enzima
e lo si può trovare indicato con la
sigla E.M.I.T. (Enzyme Multiplied
Immunoassay Technique).
C-2) E.I.A. eterogeneo. L'enzima
in questo caso rimane attivo sia che il
composto da esso marcato resti libe
ro, sia che venga fissato dalla sua
controparte immunitaria (Fig. 2).
neo a causa della loro sensibilità e
precisione notevolmente più elevate
rispetto ai dosaggi immunoenzima
tici in fase omogenea (vedi tabella n.
l)(3-27).
Struttura e caratteristiche
Fig. 4
antigeniche degli Steroidi
essa rappresenta unvdiolo 3/?, 6a.
Inoltre si avrà che i gruppi -H e -OH
nelle posizioni 5 e 6 sono cis tra loro.
Gli steroidi hanno la seguente
formula generale:
Per determinare l'attività enzimatica
è allora necessario separare fisica
mente la parte di molecole enzima
.. *"«'
tiche unite, tramite l'immunorea-
gente da dosare, all'anticorpo (fra
zione legata) dalle molecole di enzi
ma non legate (frazione libera)
(3-20-22-27- 31-32).
«■♦le
;r M *Y
4
?
i.
A»
15
jTt)>*
C
/
A
>ì
^d\
^n - \
'—-—!£-
i
j
s
y$'——-
B 9
R*Mt.
•u
»
<
Fig. 3
ma trans rispetto all'-OH in 3. A
causa della struttura molto rigida,
Lco*T*
<^L*0*lEr-()<g)
^fcD*ra*fiH>3
negli steroidi gli effetti conformazio-
nali sono particolarmente marcati,
permettendo una individuazione
ben definita dei vari derivati della
struttura base. Il peso molecolare è
comunque troppo basso perché gli
ormoni steroidei possano avere pro
prietà immunogene( 14-20).
Immunogeno è quel composto
che, se iniettato in un animale, pro
voca una risposta immunitaria. An
tigene è qualsiasi sostanza capace di
legarsi specificamente agli anticorpi.
Tutti gli immunogeni sono perciò
antigeni. Gli ormoni steroidei liberi
o
non provocano la formazione di an
ticorpi quando vengono iniettati, ma
si legano in modo altamente specifi
co agli anticorpi formati contro i co
niugati dello steroide con una pro
teina. Lo steroide libero è perciò un
Fig. 2 - Principio dell'I' .1.A. eterogeneo con doppio anticorpo in fase solida: a, primo anticorpo;
antigene, ma non un immunogeno, e
SA', secondo anticorpo in fase solida; E, enzima, H, aptene.
si comporta come aptene, è infatti in
grado di provocare una risposta im
L'esempio riportato in fig. 2 può gli anelli sono di solito alifatici e in munitaria specifica per la sua strut
essere anche denominato con la sigla posizione 18 e 19 si trovano gruppi tura una volta che sia stato coniugato
E.L.I.S.A. (Enzyme Linked Immuno- metilici angolari. Per quanto riguar
ad un carrier proteico(28-29). I carsorbent Assay).
da la stereochimica, i legami disposti riers proteici o proteine di trasporto
La presente ricerca di tipo compi
sopra il piano del foglio (verso l'os possono essere frazioni globuliniche,
lativo vuole essere una rassegna cri- servatore) sono di tipo /?, e vengono siero albumine di varie specie,
X/20
OBIETTIVI VETERINARI
ovoalbumina, ureoglobulina, fibri
nogeno e anche polipeptidi sintetici.
Come proteina -di trasporto per gli
ormoni steroidei una delle più usate
è la siero-albumina bovina (B.S.A.).
Infatti essa resiste bene alla dena
turazione da parte dei solventi orga
nici necessari per le reazioni di co
medi e che dà come risultato un co
diimide meto-p-toluensolfonato, la
aptenici per molecola di B.S.A. Ri
luzione acquosa per semplice agita
zione (21). Tuttavia i risultati di que
niugato contenente da 15 a 25 gruppi reazione può essere effettuata in so
portiamo come esempio la forma
zione dell'I 1-a-idrossiprogestero-
sto metodo non sono costanti inoltre
ne-11-emisuccinato e la sua coniu
possono causare alterazioni alla pro
teina di trasporto.
L'avvenuta unione tra proteina e
gazione con un aminogruppo protei
co (Fig. 5).
niugazione, inoltre i coniugati otte
!
nuti sono caratterizzati da una ele
vata solubilità e si possono ottenere
più facilmente per l'abbondanza de
CH,
I 3
gli aminogruppi dei residui lisinici
disponibili, e infine la B.S.A. è facil
mente
CH,
C-0
MOOC-[CHj-C-(X
reperibile a relativamente
basso costo sul mercato(ll). La re
lativa abbondanza di aminogruppi
disponibili che caratterizza la B.S.A.,
come detto sopra, permette di otte
nere anche una buona densità epito-
pìca. La densità epitopica, cioè il
| O
numero di residui aptenici uniti alla
oo
HN-6-(CHa)2-C-0.
molecola proteica, condiziona l'otti
mizzazione della risposta anticorpa-
RO-C-0-C-(Cr^-C-Q
le(7-30). Tale numero deve essere né
troppo basso né troppo elevato e nel
caso dei coniugati tra steroidi e
B.S.A. è compreso tra 8 e 25
>H 9-9.5
(9-10-11-21).
1 1 l-or-Idrossiprogesierone.
2)Anidridesuccinica.
Per la preparazione del coniugato
3) 1l-n-Idrossiprogesterone-11-F.misuccinato.
si sceglie sulla molecola ormonale un
punto di attacco tale da evitare im
pedimenti sterici con i gruppi fun
♦
ROH+CO^
4) Isobutile cloroformiato.
5) Derivato acilico intermedio
dena reazione tra 3 e 4.
6) Coniugato proteina progesterone.
Fig. 5.
zionali che individualizzano l'ormo
ne e in quel punto si attacca un radi
cale contenente un gruppo carbossilico per reazione con anidride succinica. La successiva unione con la
proteina viene realizzata con il me
todo dell'anidride mista (9-10). Que
sta è una procedura semplice e di
retta che non richiede la preparazio
ne e l'isolamento di derivati inter
Un altro metodo di coniugazione aptene è controllabile grazie al fatto
semplice e diretta aptene-proteina è che generalmente il gruppoaptenico
quello che utilizza la carbodiimmide. ha uno spettro di assorbimento di
Con l'aiuto di questi composti orga verso da quello della proteina di tra
nici idrosolubili, ad esempio la sporto si procede cioè a comparare
1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) car- tra di loro per via spettrofotometrica
bodiimide cloridrato, oppure la 1-ci- il coniugato aptene-proteina e la
cloesil-3-(2-morfolinil-4-etil) carbo- proteina libera(9-10).
Tabella 1• Confronto fra E.I.A. omogeneo edeterogeneo, R.I.A. e Immunofluorescenza.
Scelta del marcante enzimatico
Premesso che, per l'uso in ogni ti
po concepibile di dosaggio enzima
tico, non esiste un enzima che si
Sensibilità
Specificità
••
"
Precisione
comporti in maniera ideale, esistono
Bassa
Elevata
Elevata
Elevata
Buona
Buona
Bassa
Dipendente soprat uno dalla qualità dell'antisiero
Buona
Difficoltà
di analisi
Tempo richiesto
Bassa
Minuti
Media
Media
Ore
Ore
Elevata
Ore
No
Fotometro e
No
Fotometro
Si
No
Autorizzazioni
legali necessarie
Attrezzatura
termocuvetta
Possibilità
di automazione
Stabilità reagenti
Microscopio
isotopi
a fluorescenza
elevata
Elevata
Elevata
Bassa
Media
Elevata
Media
Elevata
Elevata
Bassa
Elevata
Variabile
Esperienza
necessaria
Contatore
Molto
tuttavia alcuni criteri su cui basarsi
per determinare se un enzima è più
adatto di un altro.
Si dovranno prendere in conside
razione:
1) il numero di turnover, cioè il
numero di molecole di substrato
convertite nel prodotto finale per
unità di tempo da una singola mole
cola enzimatica (o da un singolo sito
attivo) quando l'enzima è il fattore
che limita la velocità di trasforma
zione (18);
OBIETTIVI VETERINARI
X/21
2) la purezza della preparazione
enzimatica;
3) la sensibilità della determina
zione del prodotto dell'attività enzi
matica;
4) facilità e velocità di determina
zione della reazione enzimatica;
5) assenza nel fluido da esaminare
di fattori interferenti con attività si
mile a quella dell'enzima usato;
6) la presenza nell'enzima di
gruppi potenzialmente reattivi che
permettano la coniugazione con altre
molecole senza danneggiare sostan
zialmente l'attività enzimatica;
7) la stabilità dell'enzima e dei
suoi coniugati;
8) il costo e la disponibilità degli
enzimi.
I primi tre criteri sono relativi alla
sensibilità della determinazione. In
generale quanto più è piccola la
quantità di enzima marcante che può
essere dosata, tanto più risulta sensi
bile il relativo metodo di dosaggio.
Perquanto riguarda il quarto criterio
di scelta, si può avere un metodo di
dosaggio sensibile non solo sceglien
do enzimi altamente purificati con
numero di turnover molto elevato,
ma anche adottando al posto di sub
strati cromogeni, un substrato fluo
rescente o radioattivo (27). D'altra
parte la scelta suddetta influisce poi
sulla effettuabilità del sistema, dal
momento che una misura di fluore
scenza o radioattività richiede più
attenzione e un'apparecchiatura più
sofisticata di una misura colorimetrica.
L'eventuale presenza di sostanze
interferenti con l'attività anzimatica
(quinto criterio) è un problema che
può essere evitato adottando meto
diche opportune al momento dell'e
tipo e il prodotto della reazione en
modo si riesce facilmente a legare
zimatica viene di solito rivelato per
almeno 10 gruppi aptenici steroidei
per mole di jS-D-galattosidasi. Un
altro metodo consigliabile, anche se
non dà gli stessi risultati dell'anidri
via colorimetrica.
Per quanto riguarda la stabilità
minima degli enzimi suddetti si han
no i seguenti dati:
Perossidasi: 18 mesi a temperatura
ambiente se liofilizzato;
/5-D-Galattosidasi: 12 mesi a 4°C
in soluzione;
Fosfatasi alcalina: 12 mesi a 4°C
in soluzione;
Glucoso-ossidasi: 6 mesi a 4°C in
soluzione.
Di quelli sopra ricordati, un enzi
ma che si presta bene alla coniuga
zione con gli ormoni steroidei è la
/?-D-Galattosidasi, che soddisfa i
criteri esposti (4-5-6-8-12-17).
Infatti ad esempio la molecola
proteica della perossidasi, enzima
dotato di stabilità superiore, riesce a
legare solo un numero basso di resi
dui ormonali a causa del limitato
numero di amino-gruppi disponibili,
mentre una singola molecola di
/?-D-galattosidasi può facilmente le
In relazione al sesto e al settimo
criterio, gli enzimi più usati nell'E.I.A. in fase eterogenea sono i se
guenti: Perossidasi (EC 1.11.1.7)
estratta dalla barbaforte (Armoracia
rusticana), /?-D-Galattosidasi (EC
3.2.1.23) estratta da E. coli, Fosfatasi
alcalina (EC 3.1.3.1) estratta da E.
metodo dell'anidride mista (2-27).
devono essere seguite dalle fasi di
purificazione del prodotto ottenuto.
La parte di aptene che non ha reagito
incide infatti negativamente, se non
viene allontanata, sulla sensibilità
del dosaggio, mentre le moli di enzi
ma non coniugate incrementano de
cisamente il valore del bianco. Le
tecniche di purificazione più comu
nemente adottate utilizzano una pri
ma fase di dialisi seguita da gel-filtrazione(5-8-13-23).
Cenni sulla tecnica per competizione
surare la concentrazione, entra in
posto (vedi fig. 2) di cui si deve mi
competizione con lo stesso tipo di
possibile di molecole apteniche in composto enzimaticamente marcato
per legarsi all'anticorpo dosato in
modo da avere una reattività immumodo che i suoi siti di combinazione
nologica completa del coniugato
(11).
Si dimostra che quando 2, 4, 6.5, e
10 molecole di collisolo sono unite
ad una molecola di /?-D-Galattosidasi, si ha un'attività enzimatica le
gata al relativo antisiero usato in ec
cesso pari al 30%, 45%, 66% e mag
giore del 95% rispettivamente(27).
Accoppiamento aptene-enzima
descritta
suddetta, si avrà una frazione anti
genica legata all'anticorpo e una fra
zione antigenica libera.
determinata a scelta sulla frazione
Una delle tecniche più usate e più
soddisfacenti è quella precedente
mente
risultino in difetto rispetto agli anti
geni presenti in soluzione. In pratica
si sceglie una diluizione dell'anticor
po tale che l'antigene marcato venga
legato in ragione del 40-60% in as
senza dell'antigene non marcato. A
seguito della reazione immunologica
L'attività enzimatica può essere
e sua purificazione
dell'anidride
mi-
sta(l 1-5). In questa tecnica l'aptene
steroideo contenente un gruppo carbossilico viene trasformato in un'a
miato in solvente organico, mentre
1.1.3.4) estratta da Aspergillus o Pe-
l'enzima viene aggiunto in soluzione
acquosa, consentendo all'aptene di
X/22
(8-27). Le reazioni di accoppiamento
dimensioni ridotte dell'aptene steroideo, è meglio coniugare all'enzi
ma marcante il maggior numero
le di vitello, Glucoso-ossidasi (EC
mi suddetti possono essere di vario
un quarto del coniugato riesce a le
garsi agli anticorpi antisteroidei
La tecnica è analoga a quella radioimmunologica (R.I.A.). Il com
coli oppure dalla molecola intestina
I substrati su cui agiscono gli enzi
90% dell'attività anzimatica prima
della reazione. Purtroppo però solo
Tale proprietà, in questo caso, è
determinante perché, a causa delle
nidride mista con isobutileclorofor-
nicillium.
consente una resa in enzima attivo
che si aggira su valori ottimali pari al
gare 10 molecole apteniche con il nell'E.I.A. eterogeneo (E.L.I.S.A.)
strazione della sostanza che interessa
dal campione da analizzare.
de mista, è la tecnica che utilizza le
carbodimmidi, tecnica questa che
formare un legame peptidico con un
aminogruppo enzimatico. In questo
libera o su quella legata. La separa
zione della frazione libera da quella
legata viene effettuata precipitando
l'immunocomplesso con un secondo
anticorpo specifico per gli anticorpi
della frazione legata. La scelta della
frazione libera ha alcuni svantaggi
tra cui la necessità di usare una se
conda provetta di reazione, la possi
bilità di interferenza nella reazione
enzimatica di componenti indeside
rati del campione da analizzare e la
OBIETTIVI VETERINARI
necessità di una purificazione molto
spinta del coniugato enzimatico. La
maggioranza degli E.I.A. descritti
nella letteratura vengono realizzati
— confronto con altre metodiche
in relazione alla sensibilità, precisio
ne ed effettuabilità;
— automazione.
con una fase solida che serve da
supporto al secondo anticorpo
(D.A.S.P.: Doublé Antibody Solid
Phase). Oppure può essere lo stesso
secondo anticorpo a funzionare da
fase solida dopo essere stato polime-
rizzato per trattamento con etilcloroformiato( 1-5-8). Si dovrà poi met
tere particolare cura nel lavaggio
rum. Clin. Chem. 26, 1607-1609.
BIBLIOGRAFIA
of B-galactosidase from Escherichia coli
ML 308. Archives of Biochemistry and
Biophysics 81. 500-507.
2) Avrameas, S. and Guilbert, B. (1972) -
Enzyme-immunoassay for the measure3) Carlier, Y., Bout, D. and Capron, A.
(1981) - Enzymo-Immunoassays. Bulletin
de l'Institut Pasteur 79, 313-382.
4) Celada F., Ellis M. D. J., Bodlund K. B.S.
(1971 ) - Antibody-mediatedactivation ofa
defective B-D-galactosidase. J. Exp. Med.
134,751-763.
5) Comoglio S. and Celada F. (1976) - An
Immuno-enzymatic assay of cortisol using
E. coli B-galactosidase as label. J. Immunol. Methods 10, 161-170.
Conclusioni
Il dosaggio immunoenzimatico si
pone come valida alternativa al do
saggio radioimmunologico per le se
guenti ragioni :
— la normativa sempre più re
strittiva, concernente la preparazio
ne, il trasporto, l'uso e la disponibi
lità degli isotopi radioattivi che ine
vitabilmente condurrà a dei costi
sempre più elevati;
— l'attrezzatura di laboratorio e il
personale comportano livelli di sofi
sticazione sempre più elevati, il che
ha ancora come risultato costi sem
pre più elevati;
— l'uso saltuario del dosaggio ra
dioimmunologico è antieconomico a
causa della durata limitata della vita
degli isotopi radioattivi.
D'altro canto la messa a punto del
dosaggio immunoenzimatico è per
fezionabile, data la relativa novità
del metodo, soprattutto nei seguenti
punti:
— ottimizzazione e caratterizza
zione della preparazione dei coniu
gati;
— standardizzazione;
— controllo di qualità dei rea
genti;
OBIETTIVI VETERINARI
17) Hu A. S. L., Wolfe R. G., and Reithel F. J.
(1959) - The preparation and purification
1651-1659.
gates. Biochimie 54, 837-842.
numero di campioni.
ofpregnant sows. J. Reprod. Fert.58, 7-12.
tigens and antibodies. J. Biol. Chem. 242,
L'attività enzimatica viene deter
minata senza reazioni cinetiche, ma
termine. Per ogni campione è dun
que necessaria una sola misurazione,
il che permette l'analisi di un grande
G., Wrathall A. E. and Saba N. (1980) -
Estimation ofoestrone sulfate in theserum
1) Avrameas, S. and Temynck, T. (1967) Biologically active water-insoluble protein
polymers. (I) Their use for isolation of an
meni of antigens usìngperoxidase conyu-
sta colorimetrica di una reazione a
Sci. USA 6, 2689-2693.
15) Haynes S. P.,CorcoranJ. M., EastmanG.
J. and Doy F. A. (1980) - Radioimmunoassay ofprogesterone in unextracted se
16) Hattersley J. P., Drane H. M., Matthews J.
della fase solida.
misurando semplicemente la rispo
Hapten mimic elicits antibodies recognizing prostaglandin E2. Proc. Nati. Acad.
6) Craven G. R., Steers E. Jr. and Anfisen B.
C. (1965) - Purificalion, composition and
18) Lehninger A. L. Biochimica (1980) - Ed.
Zanichelli Bologna.
19) Pope G. S. and Swinburne J. K. (1980) Revies of the progress of dairy Science:
Hormones in milk: their physiological si-
gnificance and value as diagnostic aid. J.
Dairy Research 47, 427-449.
20) Pratt J. J. (1978) - Steroid Immunoassay in
clinica! chemistry. Clin. Chem. 24, II,
1869-1890.
21) Sauer M. J.. Foulkes J. A., Cookson A. D.
(1981) - Direct enzyme immunoassay of
progesterone inbovine milk. Steroids 38, 1,
43-53.
22) Scharpé S. L., Cooreman W. M., Blomme
W. J. and Laekeman G. M. (1976) -
molecular weight ofthe B-galactosidase of
Quantitative enzvme immunoassay: Cur-
Escherichia coli K12. J. Biol. Chem. 240,
rent status. Clin. Chem. 22, 6, 733-738.
2468-2477.
23) Ogihara T., Miyai K., Nishi K... Ishibashi
K-, and Kumahara Y. (1977) - Enzyme
7) Den Hollander F. C, Van Weemen B. K.
and Woods G. F. (1974) - Specifìcities of
antisera against oestrogens linked lo albumin al different position (C& Cu, C16>
24) Ruder J. H., Guy R. L. and Lipsett M. B.
Cl7;. Steroids 23, 549-560.
8) Dray F., Andrieu J. M. and Renaud F.
in plasma and urine. J. clin. Endocrinol.
(1975) - Enzyme Immunoassay of proge
sterone al the picogram level using B-ga
lactosidase as label. Biochim. Biophys.
Acta403, 131-138.
9) Erlanger B.F., Borek F., Beiser S. M. and
Lieberman S. (1957) - Steroid-protein
coniugatesi (I) Preparation and characterization of conjugates of bovine serum albumin with testosterone and with cortisone.
J. Biol. Chem. 228, 713-727.
10) Erlanger B.F., Borek F., Beiser S. M. and
Lieberman S. (1959) - Steroid-protein
conjugates: (II) Preparation and characterization of coniugates of bovine serum
alb.imin with progesterone, deoxycorticosterone and estrone. J. Biol. Chem. 234,
1090-1094.
11) Erlanger B. F. (1980) - The preparation of
antigenic Hapten-carrier conjugates: a
survey. Methods in Enzymology 70,
85-104.
12) Exley D. and Abuknesha R. (1977) - The
preparation and purification ofa B-D-galactosidase-oestradiol-17-B conjugate for
enzyme immunoassay. Febbs lett. 79, 2,
301-304.
13) Exlev D. and Abuknesha R. (1978) - A
Highly sensitive and specific enzyme-im-
munoassay melhod for oestradiol-l7B.
Febslett.91,2, 162-165.
14) Fitzpatrick F. A.and Bundy G. L.(1978) -
labelled immunoassay for plasma cortisol.
J. Clin. Endocrinol. Metab. 44, 91-95.
(1972) - A radioimmunoassayfor cortisol
Metab. 35, 219-224.
25) Seren E., Leopold A. and Bolelli G.
(1974) - Peripheral plasma levels of oe
strogens and progesterone during the bovi
ne oestrus cycle. Arch. Vet. It. 25, 1-20.
26) Stimson W. H. and Sinclair J. M. (1974) An immunoassayfor a pregnancy-associa-
ted a-macroglobulin using antibody-enzyme coniugates. Febs lett.47, 190-192.
27) Schuurs, A.H.W.M. and Van Weemen B.
K. (1977) - Enzyme-immunoassay. Clin.
Chim. Acta81, 1-40.
28) Vaitukaitis J., Robbins J. B. Nieschlag. E.
and Ross G. T. (1971) - A methodforpro-
ducing specific antisera with small doses of
immunogen. J. Clin. Endocr. 33, 988-991.
29) Van Weemen B. K. and Schuurs
A.H.W.M. (1972) - Immunoassay using
hapten-enzyme conjugates. Febs leu. 24,
77-81.
30) Van Weemen B. K., and Schuurs,
A.H.W.M. (1975) - The influence ofheterologous combinalions of antiserum and
enzyme-labelled oestrogen on the charac-
teristics of oestrogen enzyme-immunoas-
says. Immunochemistry 12,667-670.
31) Wisdom G. B. (1976) - Enzyme-immu
noassay. Clin. Chem. 22,8, 1243-1255.
32) Zettner A. (1973) - Principles of competi
tive binding assays (Saturation analysis).
Clin. Chem. 19, 7, 699-705.
X/23
Estratto da . OBIETTIVI E DOCUMENTI VETERINARI -
-Anno III - n. 10 - ottobre 1982