relazioni - Istituto Superiore di Sanità

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RELAZIONI
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RELAZIONE I NTROD UT T I VA
Necessità di una normativa per le analisi chimico -cliniche
G. B. )fARINI-BETIÙLO
D irellore dell' / $1Ìiuw Superiore di Sanild, Roma, I1alia
Negli ultimi decenni le analisi chimico-cliniche hanno acqws tato una
crescente importanza per la diagnosi delle malattie, per la loro rivelazione
in fase ancora presintomatica, per la loro prevenzione e per il controllo
delle conseguenze delle terapie. Parallelamente, infatti, all'estendersi delle
conoscenze bio-mediche sono venute assumendo . valore diagnostico crescente le determinazioni di un numero sempre più vasto di componenti
dei liquidi fisiologici, dalle più semplici sostanze inorganiche alle più complesse proteine.
La chimica clinica, nel frattempo, ha saputo trarre b eneficio dalle ricerch e compiute non solo nel suo campo specifico, ma anch e in altri più o meno
vicini, come quelli della fi sica , della chimica e della biochimica ed oggi
la maggior parte delle analisi può esser e eseguita con m etodi ch e, se applicati correttamen te, consentono di ottenere dati aventi un'accuratezza corri!~ p ond ente alle esigenze diagnostich e. Oltre ai sempre più numerosi metodi
di analisi strumentale si v anno ormai diffondendo, soprattutto nei grandi
cen tri ospedalieri, sistemi di semi-automazione e di automazione che consentono di eseguire un elevato numero di analisi in modo t empestivo ed
a b asso costo unitario e si vanno affermando i micro-m etodi, che r endono
possibile l'esecuzione di analisi diverse anch e quando il campione biologico
iniziale è p er necessità limitato.
L'aumentato numero dei parametri considerati di interesse diagnostico,
unito all'estensione dell'assistenza mut ualistica a quasi l'intera popolazione,
ha portato in Italia ad un rapido aumento dellla richiesta di analisi. Attualmente abbiamo raggiunto cifre dell'ordine di molte decine di milioni di
det erminazioni analitiche all' anno e ci si deve preparare a numeri assai
maggiori se si considera ch e già ora in alcuni Paesi si compiono in media
in un anno circa 4 determinazioni chimico-cliniche pro-capite; una t ale frequenza significher ebbe per l'Italia oltre 200 milioni di det erminazioni
all'anno. L'aumento della spesa che si verificherà inevitabilmente in tale
A nn. l at. Super . SanitA (1971) 7, 165-167
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HI:.I.AZ IU:-.1 1
seltorc arà ampiamenl<· ripagato, non solo in t ermini sociali, mn anche
in termini e conomici. per la rid uziolll' delle a;.~enzc dal lavor o, t! elle d \!genz«·
ospedalicre e della loro durata.
Quando si pa;;sa ad esaminare quali garanzk si h a nno chi' i dati
analitici siano suflicicutemcnte accurati, si deve riconoscNe che allo s tato
attuale, alm<·no per quanto riguarda l'Italia, queste sono connesse qua;,i
esdusivamentc al prestigio professionale dci singoli analisti o dd lc organizza·
zioni dn cui dipendono. Iufall.i - probabilmente p er la mancanza di un
numero suffiriente di centri anali l id di dimensioni adeguai e che funzionino
da unitù pilot a cd anche p«' r le t roppo piccole dimensioni della quasi 1otalità
dei laboratori e~ i s t (• nti - n on si sono tuttora sufficientem ente sviluppai «'
nd campo delle analisi chimico-clinich«· le m·ecssaric iniziative di autocontrollo di qualit;ì. di unificazione d(•i m etodi analititi, d i clifrusione Jdl'uso
di sostan ze s taudard e materiali di riferimento, ecc. , Attivito't di ques to tipo
sono inv•'ce orma i largam entc difl'use in altri settori naziona li. quali ad
esempio quell i dell 'indnstria, che 11011 solo hanno labor atori propri p•·r
il controllo analitic·o della produzione, m a sono anche soggetti alla verifica
da partc dci laboratori d egli utilizzatori. La neccssito't tli promuover e od
est ender e - ove esist ano - iniziative tendenti a gar antire una ma g~ior
accuratezza nell'esecuzione delle analisi (' himico-clinich c risulta anehc chiaramente da indagini compiute sia in Ttalia ch e all'estero. I n P aesi che purl'
hanno un livt•llo t ecnico-scientifico elevato risulta infatti tuttora non snflicicntcmrntc a ccurata una apprezzalJile aliquota delle anali!-i di r ontrollo
eseguite ùa gruppi di laboratori selezionati, sottoposti periodkam cnle alla
val11tazione delle prestazioni fornit e. È facile immaginare, ed ebist ono anche
esempi di verifiche, quali risultati s i avr ebbero se l' indagine fosse est esa a
gruppi di laboratori non selezionati.
P er quanto riguarda l'Italia ù inter esse del Ministero della Sanità eh«'
si giunga quanto prima ad una standardizzazione cd unificazion«' di'i m etodi
di analisi a livello degli os pedali e degli enti assist enziali c successivamcn t «·
an che dci laboratori privati. Scopo di una normalizzazione non deve esser e
solo quello di escludere errori aventi gravi conseguenze cliniche c di consentire indagini valide ai fini della mf•dicin a preventiva, ma anche quello
di poter meglio valut are i valori «normali» dei vari parametri in una
popolazione. È infatti essenziale in qualunque indagine epidemiologica, cono·
scer e la linea «zer o» da cui si parte e seguir e nel tempo l'andamento dd
valor e dci vari parametri in funzione delle condizioni ambientali, nutrit iv(',
sociali, ccc. della popolazione.
È da ricordare infin e che n elle r icerche m ediche in generale, ed in
particolar e nel caso d ella sp erimentazione clinica di nuovi far maci, i risul·
t ati dell(' analisi chimico-cliniche a cquist erebber o maggior valor e se quest e
fossero accuratamente « normalizza t e».
ÀJlll.
hl . Suver. Sanitd (1971) 7, 15$-157
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){AftlNI· BETrtlLO
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Ritengo che sia stato molto opportuno, in questo 1° Congresso Nazionale
di Biochimica Clinica, dare particolare considerazione al controllo di qualità
nei suoi vari aspetti, soprattutto perchè la sua applicazione rappresenta la
premessa per poter e, una volta messi in evidenza gli eventuali errori ed
individuatene le cause, procedere alla loro eliminazione adottando gli opportuni provvedimenti ed ottenere quindi il miglioramento dell'attività del
laboratorio. Su tale argomento si terrà un Simposio Internazionale in cui
verrà fornita da vari esper ti una visione aggiornata e critica della materia.
Nel corso di questi ultimi anni sono stati organizzati e realizzati
programmi di controllo di qualità intcr-laboratori non solo per iniziativa
di Centri, Società Scientifiche ed Associazioni Professionali operanti in chi·
mica-clinica ma anche ad oper a (li alcuni Centri di Sanità Pubblica nazionali
ed internazionuli. Desidero qui accennare in proposito che una delle condizioni fondamentali per la realizzazione di pyogrammi del gener e, cioè a
vasto raggio, è l'esis tenza di una consistente rete di laboratori di riferimento qualificati. Generalmente l'adesione dei singoli laboratori a programmi
di controllo di qualità è del tutto volontaria, ma è da sottolinear e che esis tono all'estero casi in cui la sis tematica valutazione, ad opera dei Centri
di Sanità Pubblica nazionali, della qualità delle prestazioni fornite dai singoli laboratori, è condizione indispensabile p er la partecipazione di questi
ultimi ad attività pubbliche di assistenza sanitaria. P er quanto riguarda
l' Italia è auspicabile ch e le iniziative attualmente esis tenti si estendano,
cd altre ne sorgano, in modo da favorire wta più vasta e spontanea applicazione del controllo di qualità; qualora ciò non avvenisse, l'autorità sanit aria dovrebbe intervenire, esercitando una pressione in tal sen so.
A livello nazionale non vanno poi dimenticati i numerosi altri problemi esistenti nel settore della chimica clinica - qualificazione postlauream ed aggiornamento professionale, migliorame nto dell'or ganizzazione
t ecnica dei laboratori, omologazione delle apparecchiature, ecc. ch e
devono essere affrontati da autorità ed organizzazioni compet enti, nelle
sedi opportune.
L'I stituto Superiore di Sanità ritiene suo compito contribuire allo
s tudio cd aUa soluzione dci vari problemi sopra accennati, in ciò incoraggiato prima dal ministro Ripamonti ed ora dal minis tro Mariotti.
Concludo quindi sollecitando l'impegno di tutti a svolgere uu pr oficuo
lavoro per poter giungere rapidamente, avvalendosi anch e delle esperienze
degli altri Paesi c d ella collaborazione della Federazione Internazionale di
Chimica Clinica, ad un'efficiente norma tiva t ecui('a in campo nazionale,
da applicare poi diffusamente in risposta alle rcaH esigenze della salute
pubblica.
Ann. 1st. S"pcr. Sanitd (1971) 7, 156-157
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Determinazione di alcuni enzimi organo-specifici : recenti
progressi n elle metodologie e a pplicazioni diagnost iche
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G. CERIOITI,
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C. FRA~Zl JI.
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P. A. BO ' I NI.
l' • • •
A. GAZZA ' JGA
Laboratorio Centrale dell'Ospedale Civile di Padova. •• Laborarorio di analisi
ddl'Ospedale di Vigel'ono e •n J,aboralori scient~fìci della dilla Zambon di Milano
I NTRODUZIONE
Il problem a della specificità d "or gano dei vari enzimi si collega in scuso
gen erale con quello della specificità di funzione dci singoli organi . n m eglio
dci processi m etabolici che si svolgono a livello delle singole cellule c degli
organuli cellulari. Un enzima sarà tanto più or gano-sprci fiC'o qua nLv più un
dato processo metabolico, c quinJi una data funr.ione , sono spcr ifici di un
det erminato organo. Si può r icordare l'esempio della lallato deidrogenasi:
la componente H, che prevale n egli isoenzimi di ori~;in c cardiaca, predomina
n egli organi c n ei t essuti <:arattcrizzati da un m rtabolism o acr ohil'o dd
glucosio, mentre la componente M prevale nei te~s uti che utilizzano prefer enzialmente i processi glicolitici anaerobici t1 ) . Una s pcrifidtiL di grado piit
elevato s i ha nel caso della ornitina-carbamile transferasi: questo enzima •'legato specifi cament e al cido de lla s intesi dell'urea. r hr si s' olgt' in maniera
pressoché esclusiva negli cpatoci ti.
D 'altra parte un enzima può rivelare in modo sp ccifÌ l'O la sofferenza di
un determinato organo non perché s i trova esclusivamcn t(• iu esso, ma 1wr
motivi a natomici e funzionali.
Cons ideriamo il caso dell'a milas i: questo enzima ('· sccr eto sia Jall <·
ghiandole s alivari, sia dal pancr eas; è rvidente però eh(: l'enzima contenu to
nella saliva non può provenire dal pancreas. D ' altro lato, in presenza di tma
sindrome addominale acuta il suo aumento nel sangue e ncll(' urin e p uù
essere considerato un indice specifico di lesione pancrcatica.
Un enzima con car atteristich e sotto un certo aspetto analoghe è l'o:glucosidasi uriuaria. Sebbene l'cx-glucosidasi non sia di per sè un enzima
specifi co dci tubuli r enali (è presente infatti anche n ella mucosa intestina!<·
c in concentrazioni minori n el fegato e in altri organi) nell' uomo il suo livello
A nn. I st. Suver. Sanità (1971) 7, 16&-185
159
CERIOTI'l, FRANZINI, BONINI E GAZZANIGA
plasmatico è nullo o assai basso, anche nel corso di epatiti acute. La sua
presenza nell'urina, come vedremo ampiamente in seguito, deve essere con·
siderata come un indice fedele della funzionalità e della sofferenza dell'appa•
rato tubulare dei reni. Sotto questo profilo 1'~-glucosidasi urinaria può
quindi essere considerata un enzima organo-specifico.
ORNITINA-CARBAMILE TRANSFERASI
l
~
t
L'ornitina-carbamile transferasi (E.C. 2.1.3.3.) (OCT) è l'enzima che,
nel ciclo dell'urea, catalizza il trasferimento del gruppo carbamilico del
carbamil-fosfato sul o-amino gruppo dell'ornitina, determinando in tal
modo la formazione di citrullina e di fosfato inorganico (2):
· OCT
carbamil-fosfato
ornitina :;-~ citrullina
fosfato
[lJ
+
+
L'equilibrio della r eazione favorisce nettamente la sintesi di citrullina (3· 4).
Metodi analitici
I metodi usati per la determinazione dcll'OCT possono essere classifì·
cati in due gruppi: il primo si basa sulla determinazione della citrullina formatasi nella r eazione [l J; il secondo si basa s ul fatto che se la reazione
inversa ha luogo in presenza di arseniato (5), l'attività enzimatica può essere
valutata mediante la determinazione della C02 oppure della NH3 :
citrullina
OCT
.
ornitina
(arsemato)
+
C02
+
NH 3
[2]
F ra i metodi che si basano sulla misura della C02 il migliore, soprattutto
per l'alta sensibilità, è quello radio-isotopico messo a pm1to da R eichard
mediante l'uso di citrullina marcata con HC nel gruppo carbamilico (6•7).
Dal punto di vista pratico è da considerare però il costo non indifferente
dei r eattivi e la necessità di disporre di apparecchiature complesse e costose
non adatte alla comune routine.
Nei metodi basati sulla misura della NH 3 le determinazioni vengono generalmente eseguite m ediante la t ecnica di diffusione in celle di Conway con
successiva applicazione della r eazione di Nessler o della reazione di Ber·
thelot (3•6•8•9). Questi m etodi, pu.r essendo più accessibili al comune laboratorio clinico, sono poco adatti alla r outine, c soprattutto hanno lo svantaggio di richiedere un lungo tempo di incuba7.Ìone (24 or e) e di dare« bianchi» elevati, con conseguenti perdite di sensibilità e di precisione.
I m etodi basati sull'impiego della r eazione [ l ] sono stati messi a punto
in un secondo t empo, rispetto a quelli basati sulla reazione [2], per l'iniziale
Ann. lat. Suve'l'. Sanit<\ (1971) 7, 168-185
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RELIZI0!\1
mancanza di un m etodo sufficientemente sensibil e cd attendibile per la
dcterminarionc della citrullina. Quest 'ostacolo i· s t a t o da noi super ato ricor·
r endo al r eattivo alla diacetilmonossima-fcnazonc, introdotto inizialmente
per la det erminazione dclrur{'u (1°); la citnùlina d;\ infatti con il predetto
r cattivo la s tt>ssa reazione colvrata dcU'urcu , con uguale coefficiente di cstin·
zione molare a 4·60 um. Per p{)t<·r applica r e la r ea7.ionr alle miscele di inc u·
bazionc contenenti s iero, l' urea presente d ev'esser e distrutta complr.tam(•nt<'
m ediante aggiunta di urcasi (metodo I ) (11 ).
In un secondo t empo abbiamo m esso a punto un procedimento acct'·
lcrato in scala micro ,metodo II) c ultramicro (m etodo II-a ) (12) più idoneo
per l'applicazione alle analisi automatiche .
Successivam ente, Str andjord e Clayson (13 ) e Mahuzier c D csmoulins (1 4 )
hanno descritto due metodi automatici con sist emi monocanale che si b a·
sano entrambi stilla reazione della citrullina con la diacetilmunossima-fena·
zone da noi proposta; nelle condizioni da essi a dottate, tut tavia, la r ea:.r:iont:
enzimatica non decorrc cou buona vt>locit;'t.
Anche noi abbiamo m esso a punto un m etodo automatico monocanall'
(Ill) (16). T e nuto conto del fatto che. accunto alla determinazione della
citrullina prodotta cnzimaticamcnte occorre eseguire anche quella della
citrullina prcformata, la v elocitù ottcnibile con de tto m etodo (20 anali si
enzimatiche
20 «bianchi» all'ora) ristÙtava troppo bassa per le es igenze
di laboratorio; siamo passati così a un m et odo bicanalc (ITI-a) (16). Questi
metodi si differ enziano da quello manuale II in qua nto la diacetilmonossima
è sciolta in soluzione di NaCl al 9 Oj 00 invece che in a cido acetico a l 5~ ~ .
L'ureas i impiegata dev'esser e d i tipo p erfettamente solubile, per c vitan·
precipitati nei tubicini e suJle membran e dializzanti.
Come s tandard primario per la r eazione colorata si utilizza, per ogni
serie di determinazioni, una soluzione di citrullina in concentrazioni scalari
comprese fra 50 e 1000 nmolifml. Come standarcl secondario, per cuntrollarc
la reazione enzimatica c p er v alutare csattaml'ntc il tempo di incubazione
dci sieri con il substrato durante il passaggio attraverso il manifolJ dello
apparecchio automatico, s i impiega un siero la cui attività è stata det erminata
in precedenza con il m etodo manuale.
I campioni, aspirati ad una v elocità di 40 all'ora, con un rapporto di
di l : 2 fra campione e liquido di lavaggio, vengono divisi in due flussi idcn·
tici, di cui l'uno 1) mescolato con una soluzione contenente soltanto l'urcasi,
c l' altro con una soluzione conte nente oltr e all' urcasi anche il substrato
per la reazione enzimatica. Al t ermine del procedimento analitico le
quantitù di citrullina basale c totale vengono lette su una curva di tara·
tura. Sottraendo dal valor e della citrullina totale quello della citruJlina
basale, si ottiene quello della citru1lina formata enzimaticameute p er azione
dcll' OCT.
+
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A nn. 1st. Stwcr. Sanità (1971) 7, 158-18 !'>
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CERIOTTI, FRANZINI, BONIN I E GAZZANIGA
Il metodo ha un' ottima sensibilità, ed una eccellent e riproducihilità. La
velocità di 40 campioni/ora permette di evitare qualsiasi inquinamento fra
campioni successivi anche in presenza di campioni aventi attività elevate.
In ricerche di screening preliminare in cui predominano largamente i valori
normali si può aumentare la velocità fino a 60 campioni l'ora; occorre poi
ripetere la determinazione per i s ieri a contenuto elevato, previa diluizione.
0.0.
o,a
l
Fig. l. -
Influenza della concentrnzio·
ne dell'ornitinn sulla velocità
di reazione dell'OCT. Concen·
trazione del carbamil-fosfato
nella soluzione del substrato
12,5 m)1.
0,4
0,3
2.5 5.0 7.5
10,0 12,5 15,0 11,5 20,0
2~
25.0 m M
ornitina
y
Recentemente, per rendere ancora più semplice l'esecuzione della determinazione dell'OCT, abbiamo realizzato un procedimento (metodo IV) che
non richiede la deproteinizzazione ed ha una maggiore sensibilità (1 7). Le
pr incipali modifiche adottate sono le seguenti:
l) Abbiamo ridotto la concentrazione dell'ornitina, in quanto, come
già osservato da Snodgrass (18) un eccesso inibisce fortemente la reazione
(Fig. l).
2) Abbiamo aumentato di quattro volte la concentrazione del carbamil-fosfato onde accelerare la reazione enzimatica (Fig. 2) cd abbiame>
ridotto nel contempo il volume di r eazione otten endo così una colorazione
ragionevolmente bassa del «bianco»: l'intens ità di colore del «bianco»
dipende infatti dalla quantità totale e non daJia concentrazione del carbamil-fosfato.
3) Abbiamo sostituito un tampone veronal-acetato al tampone fo·
sfato ch e, soprattutto in ambiente alcalino, esercita una marcata azione
inibente sulla r eazione (Fig. 3).
4) Abbiamo introdotto un t ensioattivo ad azione chiarificante, il
Cremophor, e ridotto il tasso dell'acido solforico onde evitare l'intorbidaA nn. I st. Suver. Sani ed (1971) 1, 158-186
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RELAZIONI
m en to e la formazione~ di sos tanze umich e color ate legate alla presenza
delle s icroproteine; alla concentr azione di acido solforico adottata la sensibilitù della r eazione colorata ristÙta diminuita di circa il 20 % ma rimane
tuttavia più ehe suHieicntc per il dosaggio di quantità di citrwlina dell' ordine
di 0,1-0,2 fJ- 8; lo sviluppo complet o dd colore è rapido (15 minuti di riscal(Jamcnto sono sufficienti) c la s tabiliti\ è soddisfacente.
D.O.
l
l
l
l
0,6
o,s
Fig. 2. -
Influenza della couccntrazionf' del carhamil-fosfato
~ulla veloci tic di reazione
dell' OCT. Concentrazione
dell'ornitina nella soluzion e del subslrato '~,8m \L
Nellu curva inferiort· è
indicata la corrispondent e
D.O. dd biauco.
Fig. 3. -
l nfluc·uza dd tipo di tarn·
pone> a vari pll su Ua ve-locit à di reaz iouc ddl'O CT.
Couccutrazionc nella ~olu­
zione del substrato : ornitimi 4,8 m'f: carbnmi l·
fo~fato 25 m'l\f.
0,4
O,J
0 ,2
·0,1
1S
10
20
2S mM
corbami!- fosfato
.0.0.
0 ,4
0,3
,,[
0 -
C:,
• tampone
vcroualacetat o (.'11/ H).
C:, tampone fo•fato
(M,'l 5).
0 ,1
6,r.l
1,0
1,2!>
1,!>
8 ,0
pH
A nn. 1st. Su ve r. San i tà (1971) 7, 16&-185
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CEBlorri, FRANZINI, BONINI E GAZZANIGA
In conclusione, utilizzando una minor con centrazione di ornitina, una
maggior concentrazione di carbamil-fosfato e sostituendo il tampone veronalacetato a p H 7 ,O al tampone fosfato si è ottenuta una velocità di reazione
molto superiore (oltre 5 volte) a quella ottenuta nel metodo I; ciò, ha consentito di ridurre il volume del campione di siero necessario per l'analisi
(Tab. I).
TABELLA
Caratteristiche principali dei metodi per la determinazione dell' OCT
descritti dagli Autori
T
:liETO DO
I
(11)
II (l')
n. (u)
III (l')
m. (l')
IV (17)
I
p
o
Volume del campione
di duo
(p l)
Velociù di ru:done
relativa a) metodo l
200
100
l
lO
2
2
Manuale .
Manuale .
~fnnuale
.
Automatico a l canale
Automatico a 2 canali
2
125
125
Manuale .
2
5, 5
25
•
L'aumento di velocità della reazione enzimatica consente di esprimere l'attività della
OCT del siero in U.I.
Nelle metodiche precedenti, tenuto conto
dei bassi valori ottenuti per l'attività enzimatica, avevamo espresso tale attività in unità
corrispondenti alle nmoli/ml/ora di ornitina
prodotta pari a 60 U.I. (nmoli/ml/min); si rendevano così più evidenti al clinico le·differenze tra
i valori normali e quelli patologici. P er lo st esso
motivo Strandjord e Clayson (13) avevano adottato l'uso di« decaunità» (D.U.), pari a IO U.I.
Con il metodo I il livello massimo dei valori
normali raggiunge 110 nmolifml/ora (1,84 U.I.),
con il m etodo TI le 220 unità (3,60 U.I.) e con il
metodo IV si aggira sulle IO,O U.I. La distribuzione dei valori normali, ottenuti con quest 'ultimo m etodo, calcolata su IOO casi, va da O a IO
U.I. con un massimo fra le 5 e le 6 U.I. (Fig.4).
Fig. 4. -
Distribuzione dei valori dell' OCT sierica negli
individui normali determinata con il metodo lV.
30
111
"o
v
c
20
o
rT
n
012345678910
UJ .
A nn. lat. Suver. Sa.nitd. (1971) 7, l&S-186
1 6~
HELAZJONI
A ttualmente è iu cor::;o lo studio per l'automazione a flusso del metodo
diretto; l'esclusione della dt•protcinizzazione r ende il m etodo adatto anch e
p er l'automazione discontinua.
Prima di p assan· all'applicazione del dosaggio dcll' OCT è opportuno
far cenno alla elevata stabilità de ll' enzima nel si•·ro dopo il preli evo \' alla
mancanza di infl uenza della emolis i sulla determina zio ne. Si tratta di caratteristiche molto utili dal punto di vis ta pratico, ad ~· ~ . per la raccolta e la
spedizione d i un gran numero dì prelievi in inda~ ini epidemiolog iche'! com1·
anche per la conscrvm-:ionc di sieri di riferimento (6·la) .
A differ enza di altri enzimi, quali le tran samina~i , in condizioni di
s terilità l'OCT s i conserva ottimamente per lO giorni a t emperatura ambiente, p er almcuo 15 giorni a 4 ° C e p er anni a - 20 °C, naturalmente se
non viene sottoposta ad operazioni ripetute di congelamento c disgelo.
La presenza del coagulo non esercita alcuna influcm:n sulla conservazione dell'attività enzimatica: il sangue può quindi essere prelevato in veuula
sterile e conservato tal q uale.
Contrariamente a quanto avvien<• per le transaminas i c la lattato deidrogenasi, la determinazioni' dclrenzima n on è assol utamente influenzata
dall'emolisi. Anche nei nostri laboratori, utilizzando un m etodo con d t'proleinizzazionc, abbiamo confrontato determinazioni eseguite s u sang ue intero
con q uelle eseguite sul s iero c Sltl plasma dello s t esso indiviùuo cd abbiamo
osser vato tma perfetta coincide nza dci risultati, naturalmente dopo la corr cziont' del dato ottenuto sul sangue intero per il valore ematocrito.
Comportamento dell'OC1' sierica in intossicazion i sperime11tali
Abbiamo effe ttualo una seri•· di ricerche sperim entali sul ratto, aiiiJ
scopo di saggiare la specificità ù'organo dell'enzima, di studiarnc le variazioni in confronto a quelle di altri enzimi , di comprendcrn<· il comportamenti)
in patologia umana c d i facilitare la rompr cnsiont' del m eccanismo d' azione
di talune sostanze epatotossichl' cd cpatopr'otettive. Rias~ mn crcmo br•' v•··
mente i risultati attualmente iu cor so di pubbl icazione.
l) Nei sieri di un gruppo di anima li sottoposti ad intossicazion1· con
dosi relativam ente basse di tetraclontro di carborùo, abbiamo rilevato un
aumento d ell' OCT pitl precoce e piil intenso di q uello di a ltri enzimi eomidcrati (GPT, GOT e fosfatasi alcalina) . Il livello dcli' OCT s icrica raggiungt·
un massimo 21 or e dopo la som.ministrazionc di t c lracloruro di carbonio,
nel contempo vi è una prog ressiva riduzioni' deli' OCT epatica e compaiono
alterazioni is tologichc caratteristich e.
2) In un altro gruppo di animali sottoposti a int ossit·aziorw con
Nionina abbiamo riscontrato una dissoeiazione fra il comportamento degli
enzimi, c in particolare dcli'OCT (che era aumentata in misttra rilcvarllc), c
i r eperti is tologici che sono risultati normali, con modeste a lt erazioni rilc.4 nn. 18t. Suvcr. Sanità (1971) 7,
1~18!'>
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CERIOTTI, FRANZ INI, BONI!'ii E
G.~ZZANIGA
165
vabili solo con lo studio dell'ultrastruttura. Questa ricerca ha dimostrato
chiaramente la maggiore sensibilità del comportamento dell'OCT, come
indice di sofferenza epati ca, non solo nei confront i degli altri enzimi ma
anche n ei confronti d ei controlli istologici.
Comportamento dell' OCT in patologia umana
Nel vastissimo campo della epatologia, cercheremo di delineare schematicamente il comportamento dell'OCT sierica in alcuni dei più importanti
quadri nosologici.
Epatopatie acute
Nei riguardi del comportamento dell' OCT nelle epatopatie acute, in
particolare n ella epatite virale, vi è tm sostanziale accordo fra i vari Autori.
La possibilità di seguire facilmente le variazioni del livello di tale enzima
in numerosi casi e nelle diverse tappe evolutive della malattia, p ermette di
individuare schematicamente tre quadri enzimatici principali, che trovano
riscontro n ell'andamento clinic? dell'epatite virale. II primo quadro (Fig. 5),
corrispondente a una risoluzione rapida e senza conseguenze della malattia,
e fortunatamente il più frequente, è caratterizzato da un aumento molto
rapido dell' OCT, quasi parallelo a quello della GOT ma notevolmente più
accentuato e probabilmente più precoce, seguito, dopo la seconda settimana
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Fig. S. -
Comportament o dell'OCT sierica nell'epa·
tite virale in confronto
con quello della GOT
c della GPT in un caso
tipico con decorso nor·
male della malattia.
Le variazioni dei livelli
enzima tici sono espres,e utilizzando com e
unità il valore massimo normale. Sulle a·
scisse sono riportate
le settimane trascorse
dopo il ricovero.
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.(nn. lat. Suver. Sanità (1971) 7, 1!>8-185
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166
JU:LAZIONJ
di m alattia , da un dccr cm enlo m oll o r apiùo. con normal izzazionc alla fìn1·
della t erza o entro la quarta settimana, solitamente precedente alla nurmalizzazionc delle transaminasi; l'altezza del livello di OCT nella fase inizial e
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Fig. 6. -
Comportamento
ddl'Ocr &icrica twll'~pa·
tilc viralc in confronto
con quellu della GOT
c della GP1' iu un caso
t ipico con tendenza alla cronicizzazione della
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sono esprc~se utilizzanrlo come unità il valon·
massimo normale. Sul·
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2
'77-
•settimane
non sembra avere relazione eon la prognosi. 11 secondo quadro (Fig. 6) , corri spondcntt· alla cr onicizzazione della mala ttia (10), è caratterizzato daHa prolungata permanenza di livelli elevati di OCT; salvo pochi casi in cui l e lrausamiuasi hanno un comportam ento analogo, l'alterato Ji,·ello dell' OCT
costituisce l'unico segno della sofferenza epatica. Il tcr:w quadro (Fig. 7).
infine, corrisponde alla insorgenza di 1ma ri cadula clinica; dopo normaFig. 7. -
ICI
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A nn. lat. Super. Sanitcl. (1971) 7, 168-186
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CERIO'ITI, FRANZINI, BONINI E GAZZANIGA
167
lizzazione s ia delle transaminasi che dell'OCT, il livello di quest'ultima
risale in modo rapido e improvviso precedendo sia la ricaduta clinica che
l' aumento del livello delle transaminasi (20, t J, 22).
Mentre il significato prognostico dell' OCT nella epatite virale sembra
essere largamente accettato, vi sono delle discrepanze riguardo al tempo di
comparsa dell'aumento e della normalizzazione del livello dell'enzima nel
decorso della malattia, ch e ha portato taluni AA. a sottovalutarne l'importanza diagnostica (23). Tali discrepanze sono facilmente comprensibili, data
la notevole difficoltà di stabilire dal punto di vista clinico il momento di
insorgenza della malattia specialmente nelle forme anitteriche, in cui pure si
hanno elevati tassi di OCT, e in quelle frus te, pressoché asintomatiche.
Tuttavia, data la precocità di comparsa di tale enzima nelle ricadute della
epatite virale e nelle intossicazioni sperimentali studiate, si può ragionevolmente supporre che la sua dete»minazione sistematica, in casi di focolai
epidemici, possa costituire un sensibile mezzo diagnostico per la rivelazione
di forme ancora latenti.
Oltre ch e n elle epatiti virali, il livello dell' OCT si innalza spesso molto
fortemente n elle epatiti tossiche acute, spedalmente se sorprese in fase precoce (24 • 25). Ghidini e coli. (25 ) hanno osservato dei livelli di OCT estremam ente elevati e persis t enti in alcuni casi di intossicazione alcoolica acuta e in
un caso di intossicazione acuta da idrazide isonicotinica, con livelli di transaminasi modicamente elevati. Soltanto in un caso di intossicazione da amanita
falloide le transaminasi erano elevatissime e l' OCT pure elevata ma in grado
minore. Si deve osservare che le determinazioni vennero eseguite in 3a giornata quando già, probabilmente, il livello dell'OCT era in fase r egr cssiva.
Oltre che n elle forme virali e tossiche, un innalzamento dell' OCT sierica
può essere utile per rivelare specificamente un danno del fegato di tipo
meccanico, come si può aver e nei traumi addominali o in caso di insufficienza circolatoria acuta o subacuta. In tali s ituazioni, l'instaurarsi di una
stasi epatica det ermina ipossia e necr osi centrolobulare con innalzamenti
anche rilevanti del tasso dell'OCT. Il fatto è stato verificato sperimentalmente: T egeris e coll. hanno osservato nel maiale un aumento del livello
11icrico di OCT dopo la l egatura della coronada di destra, e conseguente insuffi cienza del cuore destro; ciò non si verificava dopo la legatura della coronaria di s inistra. La GOT era invece elevata in entrambi i casi (28 ).
Epatopatie croniche
Nello s tudio delle epalopatie croniche i risultati sull' OCT ottenuti
dai vari Autori, e quindi le loro opinioni, differiscono maggiormente (2' · 27-32 ).
Ciò è probabilmente dovuto a due ragioni principali:
- i valori patologici sono solitamente molto più bassi nelle forme
croniche che in quelle acute, e talvolta i metodi u sati non sono sufiicientemente sensibili e riproducibili;
A nn. l at. SUll81'. S11nitd (1971) 7, 15&-185
168
RELAZI 0 :'-11
- i criteri nosologi ci di classificazione non sono sufficientem ente
rigorosi; in particolare essi non t engono conto degli ~tadi evolutivi di epat opatie croniche com e ad es. la cirx osi.
Dal canto nostro in uno studio eseguito su 103 t• asi (28) abbiamo ecn~ato
·di evitare entrambe q ueste difficoltà, adottando, da un lato, un m etodo di
d eterminazione sufficientemente sensibile ed accurato, dall'altro, una classificazione dei diversi quadri nosologici secondo criteri piuttosto rigidi, comprendenti oltre al dato clinico ed anamnestico ed ai comuni esami di laboratorio anche la epatobiopsia, eseguit a in tutti i casi studiati, e la laparoseopia, condotta nella maggior p arte di essi, in modo da poter stabilire
con sufli<'iente sicurezza, oltre al tipo, anch e la fase evolutiva della malattia.
N ella T ab. 2 vengono confrontati in m aniera sintetica i dati clinici et l
anamnestici con il quadro istologico c laparoscopico ed i risultati delle
-determinazioni delle transaminasi c dell' OCT, valuta ti approssimativamente c in maniera globale per ciascun gruppo nosologico.
Le indicazioni che si possono trarre dall'analisi dei dati ottenuti po;;sono essere così riassunte: m entre la sensibilità delle transaminasi in tutte
le cpatopatie cron iche considerate si presenta generalmente m olto ~ear sa , la
sensibilità dcll'OCT, e soprattutto la correlazione fra il suo comportam ento c i dati clinici c morfologici, sono verament e notevoli. Nei vari mom ent i evolutivi della malattia in cui sono in atto alterazioni dell'epatocita,
come nelle cpatopaLic etiliche nel I c II stadio, nello stadio precirrotico c
n elle cirrosi ipertrofichc compensate o m eno, tali alterazioni vengono denunciate dalla elevazione del livello deJI' OCT sierica. Quando prevalgono
i fenomeni fibrotici e sclerotici, come n ella fase t erm inale a trofica della
eirrosi, l'OCT è di solito entro limiti normali. Seguendo vari casi nel loro
decorso, come stiamo facendo attualmente, si può anche osservar e la normalizzazione deli'OCT in concomitanza con una risposta favor evole alla
terapia, o l'innalzamento del suo livello nei p eriodi di riaccensione dd processo morboso. L'eziologia etilica, come ci si può anch e attendere da quanto
sappiamo sul suo modo d'azione, sembra essere particolarmente lesiva delle
strutture mitocondriali, in quanto determina innalzamenti dell'OCT frequenti ed elevati; nell'etilismo lo squilibrio umorale può precedere le alterazioni strutturali microscopicamente documen tabili. P er quanto riguarda
altre forme di epatopatic croniche, Fagiolo c coli. (24) hanno osservato
innalzamcnti molto frequenti e spesso rilevanti dell' OCT sierica nell'epatite
~ronica attiva, di cui è noto il decorso progressivo con frequenti episodi di
r ecrudescenza imputabili a fenomeni citolitici. Essi hanno riscontrato valori
elevati anche nella cirrosi biliare primitiva, mentre i livelli della GPT presentavano elevazioni nettamente inferiori; la bilirubinemia era elevata. È interessante notare che nella patogenesi della cirrosi biliare sembrano implicati
fenomeni autoimmuni di tipo antimitocondriale (33 • 34 ) e che le concentrazioni elevate di bilirubina agiscono anche esse in senso antimitocondriale (35).
ilnn. Ist. Suver. Sanità (1971) 7, 158-185
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169
CERIO'ITI, FRANZINI, BONINI E G!ZU.NI GA
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T A BELLA
2
Confronto schematico tra i riBultati dell'esame anamnestico eziologico, clinico,
laparoseopico ed iBtologico condotto su 103 pazienti affetti da epatopatie
croniche, con quelli delle relative determinazioni enzimatiche, valutati appl'08·
simativamente. I dati relativi ai singoli casi sono stati pubblicati altrove (28 )
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Enzimi sierici
Forma morbosa
e eiotomi d.inici
Esiolopa
CO'l'
l) Alterazioni nervose.
2) E patopatie eùliche
I e II stadio
3) Epatopatie non etiliche
4) Stadio precirrotico.
Alla laparascopia non
segni diretti o indiretti di cirrosi
5) Epatosclerosi
evolutive
Qu.odro h tolosico
n on
6) Cirrosi ipertrofiche .
Epatomegalia.
Segni laparascopici di
cirrosi; segni incobtanti c m od esti di
iper tensione por tale,
comclinicamente
pensati.
Cirrosi scompensate.
I pertensione portale,
segni clinici di scompenso (ittero e ascite)
8) Cirrosi
atrofiche.
Atrofia, ipertensione
portale, scompenso
conclamato. Stadio
terminale.
Etiliamo •
E tilismo .
Nessuna alterazione
Rigonfiamento torbido;
steatosi; degenerazione idropica; degenerazione acidoDla. Modesti fenomeni fibrotici e
flogistici, solo in sede
portale. Architettura
lobulare conservata
Come in 2) tranne che
per la degenerazione
acidofila
+
Fenomeni degenerativi
e rigenerativi. Disordine della architett ura lobula:re. Fenomeni flogistici e fibrotici evid enti.
Fenomeni fibr otici pre·
valenti. Non alterazioni flogistiche. Scarse alterazioni degenerative epa tocitarie.
±
Varia, prevalen- Quadro istologico anatemente etilica
logo al 4) ma con
alterazioni più accentuate.
±
Non sempr e precieabile ma sicuramente non
alcoolica
Varia: etilica
postepatica,
ecc.
Sconosciut a
l l
CPT
l
OCT
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+++
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+ ++
t
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+++ +l
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Varia, prevelentemente etilica
Accentuato
d isordine
archit ettonico stmtturale, con fenomeni
r eatti vi flogistici e
fibrotici
prevalenti
su quelli citolitici.
±
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Varia, prevalen- Scarso parenchima epatemente etilica
tico a struttura disordinata; scler osi.
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~--------------~------------~--------------~--~--~------
Ann. llt. SuliBT. Sanità (1971) 7, 15$..-186
2
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l iO
HELAZJONI
Conclu siolll:
Sulla base di quanto riferito, si possono trarre le seguenti conclusioni:
l) Da un punto di vista metodologieo, la de terminazione dcli 'OCT
è diventata s ufficientemente semplice, sensibile e attendibile da permettere
la sua introduzione in qualsiasi laboratorio tOm(' mrl odo di routinc. n
raggiuugimento di condizioni ottimali per l' esr cuzione della reazion<· enzimatica ha conl'i f'ntito òi esprimer e l'atti\"ità in U .I. ancLc nella pratica
clinica; l'intervallo dci valori normali si es tende in tali condizioni da O fino
a circa lO U.J.
L'unifurmiti1 di espressione che ne consegue p crmclle di confrontare·
meglio tra loro i dati di laboratori div<>rsi. Il confronto con i dati gii'
a cquis iti può essere fatto t enendo conto dell'awncnto della 'clocitù di
r eazione.
2) Il significato fi siolog ico dcllt> Yariazioui del livello dcll'OCT sierica
è in rapporto eon la specifica localizzazione di tal!' cnl'.ima nei mitocondri
dell'ep atocita. E sso rivela quindi in modo elettivo c sensibile le alterazioni
di tale apparato cellulare indipendentem ente clalle cause r he lo hanno det erminato e dal fatto cbe esso s ia primitivo o sct•ontlario ad altre lrsioui dt' lla
cellula epatica. Il compor tamento dell'OCT nelle intossieazioni sp erimentali
h a dimostrato ch e non è necessaria una li!>i rellu.lare i tologicamenl c rileva bile per permettere una s ua fuoriuscita dalla cellula c ha m esso in c' J·
denza la preeocità e seusibiljtà della risposta.
3) li significato clinico dell' OCT sicrica è in s tretto rapporto cou
il suo significato fi siologico. L 'innalzamento dell' OCT sieriea cow<iderato
isolatamente, come quello delle transaminasi, non p uù fornir e indicazioni
sulla diagnosi eziologica. E sso seg nala però fed<'iulf'nlc lo stato tli sofl'ercnza
dell'appar ato mitocondria lc dt'Ue et·llule epatich e c permette c1uindi di seguire
l'andamento delle varie form e morbose sia a cut<' ch e cr oniche nei loro st adi
di insorgenza, s tato, decremeuto, (' \ rutuali riacrensioni, c di valutare l'efl'etto
della t erapia; di segualare l'ius taurarf>i di lUI da nno celhùare in forme inizialmente solo da stas.i o di escluderne l'esis tenza, se non altro per quanto
riguarda i m itocondri . La possibilitù di eseguire la determinazione su fmstoli del plmtato epatico pern:cttc di valutar e direttamente lo s tato dl'll'apparato mitocondrialc anche nelle sue eventuali fasi di esaurimento. La
applicazion e della det erminazionr dell' OCT, facilitata anche dalla s traordinaria stabilità dell'enzima n ei campioni
sangue, inter essa in campo
clinico tutt e l e forme nwrho:w iu cui vi è lesione ùell' epatoeita, <Juiudi, l ra
le forme a cute, l'epatite virall·, di cui è rivelator e prccore, l e epatiti to;;sicbc
e le lesioni trawnatir he, tra le form e croniche i vari t ipi di cirrosi, in particolare quelle alcooliche, e le into,;sicazioni croniche.
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A""· l st. S uvcr . Sa 11it à (1971) 7,
.1;,$- Jd~
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CER IO'M' I, FHANZ I:\1, 110:"1:111 1: GAZZ.~:IIIGA
171
'1) In campo sperimentale la det erminazione dell' OCT può, tra l'altro,
essere utilmente impiegata nella rivelazione de11a possibile cpatotossicità
a cuta e cronica di nuovi fa rmaci, c nella valntazione dcH'eventual«> effetto
protettivo di altri.
a · GLUCOSIDASI
t:Rli~ARIA
Nei tessuti c nei liquidi biologici di diversi mammif eri si possono trovar e
due tipi di enzimi in grado di scindere i pol isaccaridi del tipo dell'amido:
le ex-amilas i (E.C. 3, 2, l , l) e le ex-glucosidasi (E.C. 3, 2, l, 20). ~[c ntre le
ex-amilasi agiscono sui legami <X-1,4-glucosidici interni alla molecola p rovocando la formazion e di oligosaccaridi, le ex-glucosidasi attaccano gli st essi
legami in corrispondenza dell' estremità d('lla cat<'na polisaccaridica, con
liberazione di glucosio (36,37) .
Una <'hiara diffcr enzia:r.ione tra i due tipi di enzimi , basata ~nù le loro
proprictù catalitiche c m olccolari, appare importante per due m otivi: il
primo ì: che l'<X·amilas i è pr esente nell'urina umana in concentrazionr lar gamente 1>upcrior e aii'<X·glucosiclasi c occorre evitarne l' interferenza nel dosaggio ùcll'ex-glucosidasi; il secondo è che non è possibile consid(·rar e la
ex-glucosidasi com e un isoenzima dell'ex-amilasi, come talvolta è s tato asserito (38).
•
Alcune proprietà molecolnri c catalitiche dei due enzimi sono .riportate
nella T ab. 3.
TABELLA
3
Confronto fra alcune proprietà delle a-glucosidasi e delle a-amilasi
a.-Giuootidasì
a)
PROPRIETÀ MOLECOLAIU
Cci-cromatografia su Sephadex G-100 e G-200
E lettroforesi su carta
. . . . . • •
Eluizione rapida
(alto P. M.)
Elu.izione lenta
(basso 11 • M.)
Zona alfa-beta
Zona gamma
+
+
+
+
b) PUOPRIETÀ CATALITICHE
Idroli6i di polisaccaridi del tipo dell'amido .
Idrolisi del maltosio . . . . . . .
hlroli~i
di a-glucosidi sintetici
. •
Inibizione da citrato o da EDTA .
I nibizione da TRIS
pH ott.imnle
+
Acido
t!tttl.
1'\eutro
l$t. Suvor. Sani tà (1971) 7, 158-186
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172
llf;l .AZIU:\1
M etodi analitici
Quando si dc>ve determinar•· un enzima in un a mi"<'l·la rhr Jlt' rontie nt'
wa altro con attivitù l~a taliti ~·a s inailc, s i possono i rnpi c ~arc ml'lodi basati
s ulla separazione prcliminarr dci due enzimi (tipo A) ov\'cro mclndi basati
Slùla det erminazione di ma o di c~:~s i in condizioni sclcttiw (1 ipo B ).
I metodi di tipo A, pur essendo tcoricamrnte i migliori. ~ nno in gt' ll \'rl'
poco consigliabili p er chè indaginosi e per chè provvntno faeilrn<·nLr perdita
dell'ati i\'ità enzimatica. · cl caso specifico da noi com·itlcrato si puil ottener~:
la separazione prclinùnarc dell'«·glucosidasi dalf«-amila ~>i basata sulle dif.
fer enti caratteristirh ~ molecolari dci due enzimi. ~~·l nos tro laboratorio
abbiamo utilizzato questo m etodo in un numer o limitato di cas i, con buoni
risultati.
Nei metodi di tipo B si ricorre ad uno o più d ei segu enti artifici:
- impiego di s ubstrati specifici;
- impiego di m etodi specifici p er la determinazione dci ptodotti
di idrolisi;
- impiego di inihitori eelettivi.
I metodi per la determinazione della «-glucosidas i che impiegano i
polisa ccaridi del tipo dell'amido come substrati richiedono la pr esenza di
inihitori selettivi dell'«·amilasi capaci di legare gli i oni calcio, ad es. l'EDTA
o ancora meglio, secondo nostri esperimenti r ecenti aneora inediti , il citrato.
P er la rivelazione dei prodotti di idrolisi, il r eattivo TIIAM-glucosio-ossidasiperossidasi (TGO) speciftco per il glucosio, sarebbe t eoricamentt' il migliore;
peraltro, abbiamo riscontrato spesso nelJe urine, anc he diuliz;,ate, la presenza
di inibitori nou identifi cati di ques to s istema enzimatico. L'u&o combinato
del citrato e di un reattivo modificato alla o-toluidina (39 ) permette, in
base alle nostre ricer chr , una buona det erminazione deJla oc-glucosidasi urin aria (Ceriotti, osservazioni non pubblicate).
I m etodi che impiegano il maltosio come suhstrato specifico, offrono
anche il vantaggio di ottener e due molecole di glucosio p er ogni molecola
di sub strato idrolizzato; la sensibilità del m e to1lo risulta così raddoppiata .
Anche in questv caso l'uso del r cattivo TGO è soggell.lo alle interferenze sopra
espost e, m entre trova un valido impiego il reattivo modificato alla o·toluidina che permette an ch e di evitare una eventuale deprotcinizzazionc (39).
Come suhstrati specifici hanno più r ecentem ente attirato la nostra
attenzione quelli sint etici per chè consentono l'impiego di procedimenti ana·
litici, fluorimetrici o sp cttrofotometrici, più semplici . L'uso d ei ~ -glucosidi
del metil-umhelliferone, ad esempio, ha avuto m olto successo p er la determinazione Buorimetrica di diverse ~-glucosidasi. Purtroppo l'«·glucoside del
m etil-umbellifer one non è r eperibile in commercio c la sua s intesi appare
difficile; pertanto la possibilità del suo impiego per una det erminazione
An11. 1st. S ul) or. Sanità (1971) 7, 15B-18&
173
CERIOTTI , F RANZINI, 80:-<J:III E GUZA~IGA
fluorimetrica dell'cx-glucosidasi ·u.rinaria è per ora t eorica. L'uso di ex-glucosidi
i l cui aglicone è det erminabile spettrofotometricamente sembra offri.re poss ibilità più immediate. Abbiamo perciò intrapreso 1mo studio preliminare
con il 4-nitrofenil-cx-D-glucopiranos ide (4-NPG). Le cu.rve di idrolisi del
ò
b
•
3
Fig. 8. -
60
03~--'---'-----'
6 pH 7
5 pH 6
Idrolisi del 4-~ PG ( •-•) e del maltosio (o- -o) da parte dell'urina umana,
in funzione d el pH. Sistemi tampone: acet ato (a) e citrato-fosfato (b).
·1--NPG in funzione del pH (in confronto con l'idrolisi del maltosio), con due
sis temi tampone t citrato-fosfato ed acetato) sono riportate nella F ig. 8;
il pH ottimale per l'idrolisi appare compreso fra 4,10 c 4,25. La curva di
attività in funzione della concentrazione di substrato è ripor tata nella
F ig. 9-a; gli st essi dati sono st~ ti utilizzati per costruire un diagramma
secondo Lineweaver e Burk (40), che ha andamento rettilineo (Fig. 9-b). In
base a ques ti dati ris1Ùta che con la massima concentrazione di substrato
b
o
Fig. 9 a. -
0.5
S
IO
Conct fttrltioftt ' ub5trato (mM)
Velocità d i idrolisi del
4-NPG da parte dell' urina
umana in funzione della
concentrazione e del sub·
strat o.
1/(SJ ( mM' ')
Fig. 9 b. -
.~nn .
Stessi dati d ella Fig. 9 a,
r iportat i secondo LineWt'aver l! Burk (40).
lat. Suoer. Sanit<l (1971) 7, l:>d-186
174
RELAZIONI
impiegata (IO mM), che è prossima a q-uella della soluzione satura, si ha wta
velocità pari al 75 % circa della velocità massima. Nonostante la concentra·
zione sub-ottimale dt•l substrato, si ottengono cinetiche lineari di idrolisi
(Fig. 10), ed una relazione li neare fra quantità di enzima ed attivitù, misu·
rata per un intervallo abbastanza ampio (Fig. Il).
Fig. IO. -
Cinetica dell'idrolisi del 4-NPG da parle
dell'urina umana. Conccutrazionr del sub·
strato: IO mM.
In complesso il metodo al 4-NPG, che risulta pìì1 semplic:<: c r apido di
quelli precedentem ente descritti, sembra adatto p er determinare con buona
precisione l'attività (.1(-glucosidas ica dell'urina; prima di introdurlo nel laboratorio clinico, però, i- ancora necessario accertare se l'attività misurata con
il snhstrato sintetico è la stessa attività ch e viene misurata usando il mal-
Fig. li. -
Relazione fra quanlili• di tmzima ed
attività misurata. Concentra_zione del
suhstrato: IO m:'lf.
0.2
0.1
~ rnima(ml )
tosio come suhstrato. Il diverso comportamento delrattività enzimatica
con i due suhstrati in funzion e del pH può lasciar e infatti perplessi a questo
riguardo; anche l'eterogeneità del nostro enzima urinario (41 ), c quanto è
noto su alcune disaccaridasi (42, 43) consigliano prudenza prima di afrermare
l'identità delle due attività em~imatiche. Il confronto eseguito in un numero
limitato di campioni scelti a caso ha dimostrato una discreta correlazione fra
attività maltasica ed attività 4-NPG-asica.
Ann. 1st. Su!>er. Sanità (197ll 7, 15d- loo
175
CERIOTII, FRANZI NI, RON I NI E GAZZA NI GA
Comportamento della oc·glucosidasi urinaria in patologia umana
P er interpretare il significato delle modificazioni di enzimuria da
noi riscontrata in condizioni patologiche può essere opportuno premett ere un cenno relativo alla distribuzione dell'enzima nelle varie specie
animali.
Nei mammiferi le oc-glucosidasi sono contenute in diversi organi; in
alcuni di essi l'enzima è stato riscontrato anche n el sie ro, con notevoli differenze fra le varie sp ecie (Tab. 4).
TABELLA
4
Attività amilolitica del siero di alcuni mammiferi ("-46)
SPECIE
a -Amilu i
a-Clucoaidui
l
%
%
Uom o
........ 100
Cane
........ 80
o(?)
........ 20
Maiale
........ 15
........ 85
Cavallo .
o
100
P er quanto riguarda l' uomo, la presenza di oc·glucosidasi è s tata des critta in diversi t essuti e fluidi (mucosa intestinale, re ne, fegato, leucociti,
urina, liquido seminale), ma l'enzilDa appare assente, o quasi, n el siero, anch e
nel corso di epatiti acute (47) . Mancano dati precisi ch e possano dare un
quadro della distribuzione qualitativa e quantitativa di questo t ipo di
enzima nelle diverse s edi; comunque il r ene umano appare ricco di enzima (48), in accordo con dati istochimici \49) e biochimici (50) ottenuti nel
ratto, che indicano nel r ene, e più precisamente negli epiteli tuhulari, una
elevata concentrazione di oc-glucosidasi, pari a quella che si riscont ra nella
mucosa intestinale.
La presenza di maltasi nell' urina umana è nota da tempo (61• 52 ) , ma
senza che fossero precisate nè proprietà nè comportament o dell'enzima;
più r ecentemente noi a bbiamo studiato alcune caratteristiche dell'oc· gluco·
sidasi urinaria (41) , nonchè la sua eliminazione in condizioni normali e pato·
logiche (53).
P er quanto concerne il ruolo fisiologico dell'enzima, la sua· attività
metabolica appare evidente in organi come il fegato e la mucosa intestinale.
P er la localizzazione renale, la possibilità che l' enzima faccia parte, in qualche modo, del comples so enzimatico connesso con il trasporto attivo del
glucosio, secondo l'ipotesi di Semenza (M), appare suggestiva.
Ann . l st. S uv e r. Sanitd (1971 ) 7, 158· 185
176
RELAZIONI
La distribuzione dcll'<X-glucos idasi nei tessuti, la sua assenza nel plasma
umano e le elevate dimensioni della molecola enzimatica (cfr. Tab. 3), fanno
ritenere estremamente improbabile l'origine plasmatica, per filtrazione glom erulare, dell' attività enzimatica urinaria; suggeriscono invece l'ipotesi che
essa derivi dall' epitelio del tubulo r cnalc come espressione del normale ritmo
di rinnovamento delle cellule tubulari. P er verificar e tale ipotesi, abbiamo
preso in considerazione diverse condizioni morbose renali primitive o secondarie, con maggiore o minore interessamento delle diverse sezioni del nefroue, al fine di valutare l'eventuale esistenza di una correlazione fra entità
del danno tubulare ed enzimuria.
Abbiamo esaminato 116 soggetti, raccogliendo 1 .~ uritw di 12 ore in
presenza di sodio m ertiolato (100 mg/1). P er avere dati direttamente confrontabili tra i vari pazienti , abbiamo adottato il m etodo della raccolta
« temporizzata» dell'urina ed espresso l'enzimuria come quantità di enzima
escreta per minuto. Abbiamo scartato la determinazione dell'enzima su
campione estemporaneo di urina, e il successivo calcolo dell'enzimuria sulla
base della creatininuria, in quanto nelle malattie renali l'eliminazione urinaria di creatinina non si può considerare costante, e non è quindi possibile
riferire correttamente ad essa gli altri parametri chimico-clinici. P er motivi
d'ordine pratico abbiamo utilizzato per la raccolta dell'urina le 12 ore notturne. Su tutti i campioni è stato eseguito un esame standard di urina,
determinando la prot.einuria mediante precipitazione con acido tricloroacetico
e reazione al hiureto. P er la determinazione dell'attività <X-glucosidasica
abbiamo incubato un campione di urina, dopo dialisi contro acqua corrente
e poi contro soluzione fi siologica in presenza di sodio m ertiolato (100 mg/1),
a 37 °C con un ugual volume di una soluzione di m altosio 20 mM in tampone
a cetato 0,2 M., pH 5,0; il glucosio liberato per idrolisi enzimatica è stato
det erminato direttamente con il reattivo all' o-toluidina modificato. La eliminazione urinaria dell'enzima è stata calcolata in mU (l m U = quantità
di enzima che idrolizza l nmole di substrato per minuto di incubazione) e
riferita alla diuresi per minuto.
Nelle condizioni del procedimento adottato abbiamo ottenuto cinetiche
lineari fino a una concentrazione enzimatica di 70 mU/ml per 60 minuti
di incubazione.
I risultati delle 116 determinazioni, eseguite in 18 soggetti sani, in 93
pazienti affetti da diverse malattÌ<', •! in 5 donne gravide, sono riportati nella
Tah. 5. Per ciascun gruppo abbiamo riportato il numer o dei casi studiati,
il valore m edio di eliminazione dell' enzima e l'inter vallo di variazione corrispondente. Abbiamo calcolato ]a deviazione s tandard solo per il gruppo dei
soggetti sani, perchè i gruppi patologici non mostrano una distribuzione
normale. I valori normali sono contenuti in un intervallo piuttosto ristretto.
Nell~ maggior parte dei casi patologici si osserva un'enzimuria elevata,
Ann. 1st. Suv er. Sanità (1971) 7,
15~HS5
177
CERJOITI, FRANZJNJ , BONJNJ E GAZZANIGA
come dimostrano i dati relativi alla sindrome nefrosica, alla glomerulo·
nefrite acuta e cronica, alla nefropatia diabetica, alla nefropatia da ustione,
alla pancreatite acuta e al gruppo delle malattie renali varie; un aumento
è stato riscontrato anche in gravidanza. ~ stato anche accertato che non
esiste alcuna correlazione tra l'enzimuria e la diuresi, sia per i soggetti sani
che per quelli malati. Poichè l'ot·glucosidasi è presente anche nei Jeuco·
citi (56), abbiamo considerato, su un totale di 98 casi, la possibilità di una
correlazione fra en:r.imuria e leucocituria (valutata semiquantitativamente),
accertando che tale correlazione non sussiste.
TABKLU
s
Eliminazione urinaria di a-glucoeida.si in 18 soggetti ~
in 93 pazienti atretti da malattie divene e in 5 donne gravide (v. teeto)
DIAGN O SI
.
l
l
Soggetti sani
Sindrome ne(rosica
Glomerulonefrite acuta
Glomerulonefrite cronica
Pielonefrite cronica .
Nefropatia diabetica
Nefropatia da ustione
Pancreatite acuta
Malattie renali varie
Gr avidanza
Numero
dei cui
18
36
7
12
4
4
10
8
12
5
Ea.d moria
(mUjmln)
Medio ± D. S.
6,3
17,6
23, 7
9, 4
7,9
16,6
31 , 2
29, 3
13, 0
13, 0
±
lnternllo
di va.riuioae
1,2
!
3,22,8 9,5 0, 0 4,6 11,7 14,9 9, 1 2, 9 9, 4 -
8,1
61, 3
36, 0
28,2
15, 8
21 , 2
95 , 1
79,7
25,7
17,7
Sotto la denominazione di malattie renali varie (Tab. 5) abbiamo
raccolto diverse forme morbose, di cui abbiamo potuto osservare solo
casi isolati. E ssi meritano un cenno, data l'anomalia apparente di alcuni
valori dell' enzimuria. In un caso di calcolosi del bacinetto con idronefrosi
grave e sindrome uremica, alla distruzione quasi completa del parenchima
renale abbiamo visto corrispondere un valore di enzimuria inferiore al
normale (2,9 mU).
Analogamente abbiamo osservato una bassa enzimuria (3,7 mU)
in un soggetto mononefrectomizzato, con nefrite interstiziale del rene
superstite. Abbiamo invece osservato valori aumentati di ot-glucosidasi
urinaria in due cas i di ipopotassiemia, in una nefropatia mielomatosa,
in un rene policis tico, in una glomerulonefrosi gravidica, in una tubulo·
nefrosi colemica e in due neoplasie renali; in tutte queste forme morbose
sono state descritte lesioni tuhulari di varia entità (6HO).
Abbiamo infine osservato valori elevati di enzimuria in 5 donne gravide sane fra iJ sesto e il nono mese. Questi v alori p ossono trovare una
.4 nn. h t. S IIDBT. Sa nità (1971) 7,
1~:.-185
178
RELAZIU:"ìl
s piega zio ne s e si tien e conto da u n lato dci s egni is tologici di lieve sof f erenza t ubularc docume nta ti m ediant e n efrohiopsia in gravid e sant' (6 1) .
c dall' altro dell' aume nto de1l'alliv itù r enalc in gravida nza, con verosimile
elevazione· anch e dci fenomeni di ricambio dell'epitelio tubulare (57) .
L a T ab. 6 mostra w1a analisi del comportamento dell' enzimuria in
rapporto con il tipo e l'entitù delle altcrazioui tubulari. La sindrom e ncfrosica, la glomerulonefrit l' acuta f' cr onica f' la n efr(lpatia dia br tica AOno
entità nosologich e in cui p r e' aie il danno i stologico e funzionale a carico
dell'appa rato glom crularc : tuttavia in quP!'i t r afrcziuni il danno tubulare
secondario è ampiamente docum entato sia dal punto di vista ist ologico
chP fun zionale. cou preYa lt·nza di fenom eni rlegcn crativi a carico dell 't'pit elio tnbulare (dege nerazione vacu olare, id ropica, ialina r st eatos ica ),
( 62-65) . In tutte quest e form e abbia mo ossl'r vato un'elevata eliminazion e
urinaria di o:-glucosidasi. Abbiamo in vece O~>Scrva to u n aument o medio
più modest o nel gruppo delle glomeruloncfriti cr oniche, dov (' non è raro
osservare valori inclividuali normali o anc·h c n ettamente inferiori alla
norma. Questi risultati sono ben correlati con i r ep er t i is tologici che spesso
mostrano una netta atrofia dell' epitelio tubular e ( 82-45) . Nei casi di pielonefrite cronica abbiamo invece riscontrato v alori praticamente normali
di o:-glucosidasi urinaria, ch e b en si a ccorda no con i fenome ni di appia t timento e atrofia de ll'epitelio tubulare b en docum entati istologicamente
in questa affezione morbosa. Il danno renale da ustione e da pancr eatitc·
acuta presenta is tologicamente il quadro della tubulonefrosi a cuta (66 • 67 )
in cui s i osser vano gravi fenomeni di tubulorcssi e tubulonecrosi, con disgrt'gazione completa degli epiteli tubtùari, m entre l' apparato glom erulure è
solo scarsam ente interessato (67, 68) .
TABELLA
6
Correlazione fra lesioni istologiche renali cd eliruinnzionc urinaria
di a-glucosidasi
l
l
~ 1 011(1 IITOLOCJCB E
FOR~IA
MORBOSA
Clomtnalari
Pielone(rite cronica
Glomerulonefrit e
nica
ero·
Sindrome n efrosica .
Nefropatin diabetica
Glomer ulonefrite acuta
l
Nefropntin da u stione
Pancreatite acuta
l
1\tbulari
di tipo
degeot rativo
++
±
+...!..++
++++
++..!..+
+-...!..+
±
±
+
+++
+++
+,-+
++++
++++
l
a-CLUC081DAII U arN.t..R.U.
Tubulari
di t ipo
% d i cali
oon e.nz.imuria
at rohco
t-levata
+++
..... +
,..
-
l
lnc.remeoto
medio %
deU"enzimu ria
25
125
so
149
279
263
375
494
464
78
100
100
100
100
l
l
- -.~ nn.
lat. S uve r. Sa nità (1971) 7,
I S~-185
CERIOTH, FRANZit'il , llO:-I INI E GAZZANIGA
179
I dati sopra riferiti dimostrano l' esistenza di una stretta correlazione tra l'aumento della oc-glucosidasi urinaria e le lesioni dell'epitelio
tubulare renalc, rilevate istologicamento. Non abbiamo trovato invece
correlazione tra i valori della oc-glucosidasi urinaria e alcuni indici di fun·
zionalità r enale, come l'azotemia, la creatininemia e l'intens ità della pro·
teinuria.
Allo scopo di valutare il significato della enzimuria come indice di
evoluzione della nefropatia, abbiamo seguito il decorso d ella malattia
in tre pazienti con glomeruloncfrite acuta e in sei con tubulonefrosi da
ustione mediante determinazioni successive dell'oc-glucosidasi urinaria,
eseguite ogni 7 giorni. Come appare dalla Tab. 7 una diminuzione pro·
gressiva dell'cnzimuria si accompagna al miglioramento clinico, mentre
al peggioramento corrispondono valori persistentemente elevati dell'oc-glucosidasi.
Come abbiamo ricordato all'inizio, l'oc-glucosidasi è assente o pre·
sente in quantità molto piccola nel siero umano, nonostante la sua pre•
senza in diversi organi c tessuti. Per verificare questo dato, abbiamo ricer·
cato l'oc-glucosidasi in alcuni campioni di s iero normali c patologici me·
dian t e incubazione prolungata (fino a 4 ore), in modo da rilevare anch e
piccole quantità di enzima. Tra i sieri patologici, abbiamo preso in parti·
colare considerazione quelli di pazienti con anuria acuta, n ella ipotesi che
in ques ta condizione morbosa la s oppressione della via fisiologica di eliminazione dell'oc-glucosidasi r enale avrebbe potuto determinarne la com·
parsa nel sangue, con tm meccanismo analogo a quello ipotizzato per la
fosfa tasi alcalina nell'ostruzione delle vie biliari.
L' attività oc-glucosidasica è s tata determinata con le s t esse modalità indicate per l' urina, ma con l'aggiunta di sodio m ertiola to (100 mg/ l)
anche alla miscela di incubazione. Come s i osserva n ella Tab. 8 l'enzima
è risultato assente o pres ente a livelli molto bassi n ei soggetti sani e nei
soggetti patologici non affetti da anuria a c uta. Ne i pazienti a nurici invece
ù s ta ta cos tantemente osservata un' attivit à enzimatica t alv olta anche
rilevante.
Onde poter escludere che la bassa o nulla attività oc-glucosidasica
del siero potesse essere dovuta alla presenza di possibili inibitori abbiamo
saggiato l' attività enzimatica dell'urina prima e dopo l' aggiunta di s iero
n el rapporto di l : l. La mescolanza col siero non ha portato ad alcuna
.inibizione dell'attività oc-glucosidasica dell'urina.
Negli individui in cui è stata ricercata e det erminata l'oc-glucosidasi
n el sier o, s i è contemporaneamente proceduto alla sua de t erminazione
n elle urine. I risultati dell' enzimuria sono s tati i seguenti: valori normali
n ei soggetti sani, valori modicamente elevati nelle epatiti acute c molto
elevati nella pancreatite acuta e nell' ustione .
A nn. I st. Su por. Sani te\ (1971) 1, 153-1"5
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U,tionc . . . . . . . .
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o
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l
CER IOTTI, FRANZI:-11,
8U~I~I
E
GAZZA~IG.~
181
Determinazione dell'attività a -glucoeidasica n el siero di 13 soggetti sani,
di 1 pazienti con affezioni varie e di Il pazienti con anuria acuta
AnEZlorn
SoGGIITTI I A-' (1
V.lBla
l A~tivi','
l A~livi':'
C.JO
l
0, 0
l
Pancreatite acuta
0,9
o, o
2
Ustione.
0,0
0,0
l
2
2
1,4
3
0, 0
3
Nefrectomia bilat er ale
0,0
0,0
0, 0
4
Nefrect omia bilaterale
0,8
3
4
2,0
4
5
1,4
5
6
0, 6
6
Nefrectomia bilaterale
E patite acuta .
7
7
Epatite acut a .
0,0
0,0
6
0,8
8
9
10
1, 0
1, 2
8
9
1,3
IO
11
11
12
1,5
1,5
13
1, 5
l
5
n.
l
Afraione
l
l
ANuauo ACUTa
Attivi t•
msimatita
mUfml
Cu o
n.
l
Caso
e.J:Uun&ttea
e~>umat>oa
o.
mU(ml
mU(ml
7
l
l
2,1
2,4
l
2,6
3,4
l
3,5
5,7
5,8
6, 9
l
l
... ..
100
l
,~
L'enzima presente nel siero di p azienti
anurici presen t a una curva di attivi tà in funzione d el pH sovrapponibile a quella dell'cx-glucosidasi urinaria, con un massimo tra pH 5
c 5,5 (Fig. 12). L a cinetica di r eazione in funzione del t empo è lineare (Fig. 13).
l. O
Fig. 12. -
20 ~.-~~r-~-r~
Effetto del pH sull'attività a:-glucosidasica
nel siero di un paziente con anuria acuta.
l
.'
'•
'
:
'f
·~
i
3
l
\•
'
l
60
.
'
••......
••
4
l
s
6
7
8 9
pH .
In alcuni pazient i abbiamo determinato
l'attività enzimatica nel siero dop o la risoluzione dell'anuria: con la r ipresa della
diuresi a bbiamo osser vato una progressiva,
ma assai lenta riduzione dell'attivit à enzimatica fino a valori normali.
o.o.
0,4
O,J
0 ,2
0 ,1
Fig. 13. IO
t•mpo di incubaziont (ort)
Attività a:- glucosidasica nel siero di pazienti con anuria acuta. Cinetica enzimatica in funzione del tempo di incubazione.
l
l
l
l
l
A nn. l st . SuoeT. Sanità (1971) 7. 158- 186
l
l
l
l
l
18:.!
1;1.1 IZIII:'\1
I risultati lli qut'::. la ricerc·a bull"attivitù <X-glucosidas ica nel s ier o ci
suggeriscono alcune considerazioni :
l) La presenza nel siero di ah·uni soggrtti di una pur modesta attività enzimatica pone il problem a della possihilc origin e plasmatica , per
filtrazione· glomcrulur(' , dcll' cn;-.ima urinario . Questa possibilità viene
esclusa sulla base di al cune osscn·azioni :
Non esiste· alcuna correlazion e tra la concentrazione sierica
dell'enzima e il t a sso di enzimuria.
Tnoltrl', ai valori di cleYal.l cn1.imuria o~>~cn ati ili alcuni ea,;i patologici (epatite, u stione , pancrcatitc·) <·orri sponde la completa a ~~c nJ~:a dcl l'enJ~:ima nel s iero.
- Il calcolo della cnntualr clcararwc• dell'enzima nei soggetti
a mas:.ima concentrazione sic rica. ha dato Yalori di 4 -5 ml/min. assolutament e incompatibili con l'eleval o prso molceolare dcll'rnzim a.
- Una dcarnncc de ll'enzima viene anche esclusa se s i cons idera
la estrema lentezza ton cui si riducono i Yalori dell'attivitìt enzimatica
sier ica nei pazienti nnurici, dopo la ripresa della diuresi.
2) La presenza dell'«-glueosidasi in eleYal\• quantitit solo n el si<·ro
degli anuri<•i, e l'idcutitù delle <'llrH' di pH ne ll 'enzima sierico c di quello
urinario, sembrano eomprovam·c l'ipo tes i di part r n:r.a di una origine rcnalc ,
per riflus!'o, deii'<X-glurnsidas i Jlt•l l'anguc {*) .
Conclusioni
L'in sicmt· dei dati riportati conferma l 'ipotesi clw l' attivitù «-glucosidasica dell' urina umana normale provenga con ogni verosimiglianza ùal
tuhtùo rcnalc c ne esprima i normal i processi di rinno\ amento. L ' aumento
di r nzimuria ch e si verifica in seguito ad una s ofl'l·rt~nza primitiva o secondaria dc] tuhulo r e ua l <~ config ura il <JUadro di una « sindrom e citolitica
r cnalc» c porta a ritt·n crc ch e l ' atti\ itoì <X-glucosidasica rapprr~'<c nl i un valido
parametro JH'r Yalutarc la g ravi LÙ Ùf•l danno tubulare n l'Il<· varie forme
morbose c p er scguirne l'evoluzione nel decor!>o della malauia c che possa
fornire indicazioni aucora pitt sig nificatiYc s ullo stato del n cfron c qualora
venga studiata in concomit anza co n altri parametri di funzionalità renale.
Riassunto. - Yil' HC hreYcmenl c discusso il concetto d i enzima organospecifico c vrngono considerati in Ùcllaglio d ue enzimi di cui gli AA. hanno
esperienza dire tta: l'ornitina-carbamilc transfcrasi (OCT), spe<'ifica p er l 'epatocita, c 1'<X-glucosidasi urinaria, prove niente dugli epiteli tubulari del r ene.
(*) I dati riferiti sui pazienti anurici fanno parte di una ricerca, tuttora in corso,
in collaborazione col Centro di Emodialisi dcll'Universitìt di PadoYa.
A 1111. h t. Suve r. Sanità (1971) 7, 158-Hl;;
CERIO'ITI , t' RANZINI, BONINI E
G AZZA~I GA
183
Vengono illustrati i vari metodi di dosaggio dcll'OCT con particolare
riguardo p er quelli, sia manuali che automatici, basati sull'impiego del
reattivo diacetilmonossima-fenazone. Dai risultati ottenuti in studi eli·
nici emerge l'importanza della determinazione di questo enzima soprat·
tutto nella prognosi della epatit e acuta e nello s tudio delle epatopatie
croniche, in particolare d ella cirrosi.
Vengono quindi esaminate alcune proprietà dell'cx-glucosidasi in con·
fronto. all'ex-amilasi la cui conoscenza consente di poter realizzare le
condizioni per un corretto dosaggio. Partendo dall'ipotesi ch e l'enzima
dell'urina sia di origine tubulo-renal e ne è stata misurata l'eliminazione
in diverse malattie del rene, confrontandola con altri parametri. I risultati ottenuti confermano l'ipotesi di partenza ed indicano l'utilità della
determinazione dell'enzima urinario come indice per la valutazione del
danno tubtùarc.
Summar y. (Determination of some organ-specific enzy m es : recent pro·
gress in methodology and diagnostic applications) - The conccpt of organspeciGc enzymes is bricfly discussed; two enzymcs were examined in detail: ornithine-carbamyl transferase (OCT), specific for hepatocytes, and
urinary cx-glucosidase, which originates from kidncy tubular cpitelia.
Severa} methods of OCT determination ar e dcscribed , and in particular manual and automatic m ethods based on the use of diacetylmonoxime-phcnazone. Clinica! investigations showed the importance of OCT
determinations for the prognosis of acute h epatitis and for the study of
chronic hepatic dis cascs, and in particular of cirrhosis.
Some propertics of cx-glucosidase are then examined and compared
to those of cx-amilasc; these properties must b e known in order to set
the conditions for a corrcct d etcrmination of t h c cnzyme. Following the
working hypothesis that the cnzyme found in urine originates from kidney
tubulcs, the urinary cxcretion of enzy me in di:fferent renal diseases was
measured and compar ed with oth er parameters. The r esults obtained
confirmed thc hypothesis and emphasize the importance of the urioary
cnzyrne determination for the evaluation of tub ular damage.
B IBLIOGRAFIA
(l) PFLEIDEm::n, G. In : En:ymeJ in Clinica! Chem~try, Elsevier, Ghent, 1964, p . 107.
(l)
H. A. & K. H ENSELE TI. Z. Phys. Chem., 210, 33 (1932).
P. A cta Chem. Scafld. , 11, 523 (1957).
BunNET'l', G. H. & P. P. ConeN. ]. Bio!. Chcm., 229, 337 (1957).
KREBS, H. A., L . V. EGGLESTO~ & V. A. KNIVETI'. B~chem. ] ., 59, 185 (1955).
REICRARD, H. & P. REICIIARD. ]. Lab. Clin. M ed. , 52, 709 (1958).
Kru:os,
( 3) REICIIARD ,
(~)
(6)
1
( )
A nn. I a:t. Super. SanitA (1971) 7, 158- 185
l
l
l
l
Il! l
l
l
RELAZIONI
H. ). Ln/,. Cli11, /l!ed., 63, 1061 (1964-).
(') ]l};ICHARD ,
( 6 ) ~fO llETTI,
9
( )
C. F., H. .'ILurOL"i, J. STAEf'FE , 1'. BAr.! ..\'\', (;,
mm:sscm.. A11rr. Rio/. Clin., 21, 573 (1963).
.li1 0llF.TTI . G. J:'., J, STA I: FI'I::I'ò, P. llA r.LANt~ G. f'AT\ t\ZARU.
LAT.\:-ilA110 lì;
l'rt·ssr 1Tt d. , 72, :!:13 (lW•·IJ.
1
( ")
Cr-.nro-rrr. (;, & l.. Sr'A:'> IHIIO.
(l ')
Cr·:II JOl'TJ, C:.
& ,\, GAZZA '\ JG A. Clin. Chim. Acta. 14, 57 ( l %u).
<:.
& Il. GA7Z,\'\IGA. Uin. Chim. Acta. 16, -13(• (1967).
(' ") CrmJOT"rr.
(' 3) ST rtAI'òDJ Oilll,
(' 1) '\LA II UZIEH,
P. E. & K . .1 .
G. & H.
c~ì
Lor.u::., ll., A.
p. 75.
6
(' )
Cl:ltlOTTI,
C., U.
Uirr. Chim. A cta. 8 , 295 ( 196:1).
LOLLIS
.T. ],ab. r.Jin. Mt·tl., 67, 15 ~ (l%h).
l.r.A,ì:>OI'ò •
D EsMOt;LJI'ò,..,
::'ì'AUAl l'JtAI\h.
\f. YAì'ni '\·
& ~-
Amr. Bio/. Clin., 27, 7u7 (19!.\1).
Atti .'lrmposio 'l 'echnicoll , R oma,
LF.Ili01'TJ.
oll.
19h9,
& A. D1. i:'ìADAJ FnAL"iK. A11n. Bio/. Clirr .. in cor-n di stawp.a.
(1 7 ) CElllOTTr, G., in corso di •t nm JJa.
('R) Sr.ODGRASS, P. J, Biochemistry, 7, 3047 (1968).
IJ. J, Lab. Clin. 1\.Icd., 57, 78 (1961).
( 19 ) RI-: rCnARH,
( 20) Dr.
A., U. T.n•l•J, F. Ù S l' UNI & A. VH,LA, Simposio ft1eto di Enzimatici in Vifl·
gnostica Clinica, Conegliano Veneto, no\', 1969.
(21)
PASCAU;,
FERRACI!'\,
G. S. & L.
Policlinico, 76, 1258 (1969).
LOIIA.
( 22) B OLLETTI,
(n)
NECRI,
l\f. & C. HtCA. Qr•aderni Sciavo Diagn., 5, 190 (1969).
S., F. CrvAnDr, L. T ENCONI, N . MA SSAm & S. PROCACEmA. JUini'rva ,\[('d., 60.
l
l
l
l
l
l
l
l
171 (1969).
(24)
FAGIOLO,
u., n.
l <'A nl:'il,
c.
PA~ZL"M'A &
H.
Quadc•mi Se/an> /)iogn., 6.
::'\ACCAit.\TO.
210 (1970).
(:!6) Gurnrr;r, O .. A. 'l'O\J.\51, P.
:!81 (l'J7J).
(26) Tr.:rmms, "· S., n. E.
col., 14, 5 ~ (l 969). ·
e
7
)
(2«)
P . A.. S. ZoTTI & G.
("'') Mon1-:rn, (;. F ., J,
(3°)
Rr·;l(; HAllll ,
(3') CAnooso
Sl! AT.LEY
B ATTOr.CUIA. Atlll. I st. ::>upcr. Sar~itrì, 7 .
Jn, F. J.. EAnT.& J, Jl f. CL' IITI•. 'l'cchnol . . 1pJ>I. Plwrnw -
H. Arta .l!td. Scond. , 172, Suppl. 390 (1962).
R LICUAliD,
BON INI ,
XtGill ~~ . \.
STAI l- l t .'l
C!ènrOTTl.
Quodnni .'-idrm> lliop1., G, 200 (1970).
& 1'. lhLI.. AI\.
Il. Swnd. j . Clin. La/1.
OA StL\' A,
lr~ vt·st .,
J>n~.~~
J!HI., 72, :11119 {19Co 1).
J. Ar(Jait·. P tllol. (l.i,IHln}, 35, <•9 (1963).
10, 5(a (IY&l) [ùa Chem. Abstr. 61, 5966 g (196:1) ).
E. \ . Am. j, llrd. Sd., 253, 911 (1967).
(3 1) COPPO, i'll. c~ 1\L T. Acxo r:uccr. l'roblt•mi :a11uoli cl··llo cirrosi PJW tico . Eù. :\fim'r'\ ',1
.'llctlica, T nr·ino. l \!(•\1, p. 28-33.
(~) ~fAt;cn.H Trr,
G. B. ,lliliwr.v MPd., 131 Su ppl. llll , (19(.C>).
(J6) lh ;n:-<:t.'t::Ln, l'. I n : Comparati ve llit>l'hemi.5tfl·, ~f. Florlin ancl S. \fa>on Ed•., o\ cud.
l're.,,:--. ì. uml Louclun, 1962, 'ol. III, p. 35.).
(3 7 )
L AIII\En,
J,
)n: 'J'Iu• J·:n::y nH•s, P . D. Boyc'J', l f. Ln ~ùy and K. \fyrJ.ack Eds.,
N . Y. nnù Lunùon, 1960, II cd.,
(38) SEARCY,
H. K., S.
HAYA SHI,
\'Ol.
J. E.
& H.
STEli!'\ ,
l
l
l
l
.\ cad. P rcss,
lV, p. 369.
llE t\K
l
l
9 , 10:1 (19é>7).
(l!) Ko.•mo O, K. Kun'lo, S. JIAJl.\H,\YASlU & S. KAnAYOSlfl. i\'ippottl•:iseil(casa Gisltikoi,
( 33) CEJ.ZAIO,
l
l
Prue. Soc. Expll. lliol. 1\[ed.,
122, 1291 (1 966).
A nn. I st. SuveT. Sanitd (1971) 7, l f•)\..t;>:.
l
l
l
l
l
l
l
l
CERiani,
fRA~ZINI,
185
BONINI E GAZZANIGA
l
l
l
(3D) CERIO'l'TI, G. Ann. [!l. S uptr. Sanitd, 7, 471 (1971).
('O) LINEWEAWER, H. & D. BuRX. J, Am. Chem. Soc., 56, 658 (1934).
l
( ' 1)
FRANZINI C. & P. A. BONJNI. Clin. Chim. Acta, 17, 505 (1967).
( 42)
DABLQVIST, A., B. BuLL & B. E. GuSTAFSSON. Arch. Biochem. Biophy!., 109, 150 (1965).
(") HsiA, D. Y. Y., .1\1. MAKLER, G. SEMENZA & A. PRADER. Biochim. Biophy!. Acta, 113,
390 (1966).
l
l
l
l
(") FRA.'IZINI, C. & P. A. BONINI. Experienlia, 23, 373 (1967).
(") FRANZINJ, C., P. A. BoNtNI & M. L. SoLA. Enzymology, 36, 117 (1969).
l
(") FRANZlNt, C. & P. A. BONLNI. Experientia, 25, 597 (1969).
l
(H) BoNtNI, P. A. & C. FRA.'IZINI. Biochim. Biol. Sper., 7, 47 (1968).
l
(48) AURICCDJO, F., C. B. BRUNI & V. SICA. Biochem., 108, 161 (1968).
( 41)
RUTENBURG, A. M., J, A. GOLDBARG, S. H. RUTENBUliC & R. T. LANG. J, IIinochem.
Cytochem., 8, 268 (1960).
(50) DABLQVIST, A. & A. BRUN. ]. Histochem. Cytochem., 10, 294 (1962).
( '1 )
KOBURYO, T. Chem. Ab!tr., 28, 1063 (1934).
( 62)
FLEYRY, P. F.,
( 54 )
SEMENZA, G. In: Intestinol Absorption and Malabsorption. D. H. Sh.merling, Il. Berger
aud A. Prader Eds., S. Karger, Base1 aud N. Y. 1968, p. 32.
( 61 )
WILLIAMS, H. E. Biochim. Biophys. Acta, 124, 34 (1966).
(") HOLLANI>ER, W. In: Diseases of the kidney, M. B. Strauss nnd L. G. Welt
A. Churchill. London 1963, p. 675.
Ed~ .•
J, and
S01s, E. A. H. I n: Di&ease& of the kidney, M. B. Strauss nnd L. G. We1t Eds, J, and
A. Churchill, London 1964, p. 853.
(") DAWAAliD O. Z., In: Diseases of the kidn ey. M. B. Strauss and L. G. Welt Eds., J. and
A. Churchill, London 1963, p. 907.
(") HABVEY A. M., W. G. WALKER & J. H. YARDLEY. In: Diseases of the kidney. M. B.
Strauss and L. G. We1t Eds., J, and A. Churchill, London 1963, p. 575.
8
( 0) FIASCHI, E. & L. C.utPANACCI. In : Traltato Italiano di Medicina Interna, a cura di
P. lntrozzi. Ed. Poligralìci il Resto del Carlino, Pnrte VII, 1963, p. 575.
( 11 )
l
l
l
J, E. CoURTOIS & D. RAMO:'!. Bull. Soc. Chim. Biol., 33, 1762 (1951).
('3) BONINI, P. A., G. CERIOTTI & C. FRANZINI. Clin. Chim. Acta, 27, 415 (1970).
( 67 )
l
COPPJTZ, A. & P. ZuLLI. Arch. De Vecchi, 25, 533 (1957).
(") LEONARDI, P. & A. RouL. La biopsia renole transcutanea. Ed. Ambrosiana, 1961.
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
( 83 )
FIAscm, E ., G. E,RCOLI & A. TORSOLI. Min. Med., 44, 1851 (1953).
( 114 )
Mc ~UNUS, J. F. A: In: Diseases of the kidney. M. B. Strauss and L. G. Welt Eds.,
J. an d A. Churchill, London 1963, p. 259 e 265.
l
( 81 )
;\{ARDLE, A. In: Diseases af the kidney, .1\f. B. Strauss and L. G. Welt Eds.,
Churchill, London 1963, p. 621.
J. and A
l
(") ~{ONASTERIO, G. In: Trattato Italiano di il'leclicina Interno, a cura di P. Introzzi,
Ed. P oligrafici il Resto del Carlino, Parte VII, 1963, p. 402.
(8 7) FIASCHI, E. & L. A. ScuRo. In : Trattato Italiano di Medicina Interna, a cura di
P. Introzzi, Ed. Poligrafici il R esto del Carlino, Parte VII, 1963, p. 616.
( 18) OLIVER,
J., M. l\fAc DowEu.
& A. TRACY. ]. Clin . lnvest., 30, 1307 (1951).
l
l
l
l
l
l
l
A""·
3
l
Itt. SUDtf'.
Sanitd. (1971) 7, 158-186
l
l
l
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l
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Controlli biochimici durante e dopo interven ti
in circolaz ione extracorporea
G. B. FERHAHA (•), 1\f. TARANTINO (••), L.
SPA~DHIO
(**•) ,. C.
GAVAZZE~I
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(*ì
R eparto di Cardiochirurgia, Cliniche Gauazzeni di B rrgnmo.
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La circolazione extracorporca (C.E.C.) può essere considerata come uno
stato di shock controllato, durante il quale le funzioni essenziali di circoluzione ed ossigenazione del sangue sono mantenute artificialmente.
Durante la C.E.C. è n ecessario mantener e il paziente in condizioni quanto
più possibile vicine a quelle fisiologiche; è quindi indispensabile proceùcrr
a un controllo assiduo dci parametri biochimici che possono piì:t profondam ent e modificarsi sia durante, sia dopo l'intervento.
I fattori che tendono a modificare l'omeostasi c il m etabolism o duranll·
la C.E.C. sono numerosi ; fra di essi ricordiamo soprattutto:
- l'anestt'sia;
- la r espirazione artificiale;
- la circolazione artificialmente indotta, con le conseguenti modi ficazioni di velocità di flusso c di dis tribuzione del sangue n ei vari distretl i :
- l'introduzione di sangue c la sua poss ibile diluizione con varw
~olu zio ni ;
- In contemporanea som ministrazionc di farmad ad a:r.wnc aulicoagulante, antiistarniuica, antibiotica ere.;
- le event uali m odificazioni della temperatura corpor ea.
H.iteniamo interessante r iferire sui controlli di una serie di parame t ri
biochimici effe ttuati su un gruppo di cento pazienti ricoverati nd H.cpart o
di Cardiochirurgia, dirett o da l dott. Azzolina. delle Cliniche GaYaut•ni
di Ber gamo.
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(*) Indirizzo attuale: o~pcdalc Generale l'rovincialc di :'!Ta--a.
) l .ahomtorio di anali~i cliniche, Qo; pedale Passirana di Hho.
(• **) Laboratorio Centrale, S pcdali Civili di nrcsr:ia.
(
0 0
A nn. lat. Sur>eT . Sanità 0971) 7, l<>tHOs
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FERRARA , TARANTINO, SP ANDRIO E GAVAZZENI
187
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Casistica e metodi
La nostra casistica comprende bambini d'ambo i sessi, di età compresa
tra i 3 e i 12 anni e tra gli 8 e i 26 kg di peso, sottoposti ad intervento a
cuore a perto in C.E.C. per correzione di cardiopatie congenite.
I parametri biochimici sottoposti a controllo sistematico sono stati i
seguenti:
- equilibrio acido-base, con dosaggio dei composti p iù rappresentativi delle modificazioni anossiche, quali il lattato e il piruvato;
- concentrazione plasmatica dei principali elettroliti ;
- tasso di urea e di glucosio;
- attività enzimatich e, quali glutammico-ossalacetico transaminasi
(GOT), glutammico-piruvico transaminasi (GPT), e lattato deidrogenasi
(LDH), che possono denunciare uno stato di sofferenza dei t essuti più
direttam ente interessati dall'intervento.
Ci siamo attenuti ad un numero ristretto di esami, !imitandoci alle
det er minazioni che possono v enire eseguite con rapidità sufficiente p er essere
utili al chirurgo nel corso dell'intervento. La presente relazione costituisce
d'altronde solo una premessa p er un programma di studio più approfondito
dci numerosi, complessi problemi che la C.E .C. offre all'indagine biochimica
e fis iopatologica; i dati che la letteratura presenta al riguardo sono r elativamr nte scarsi e controversi.
L ' anestesia generale è stata effettuata n ei nostri pazienti con una miscela
di ossigeno e di protossido di azoto, con aggiunta di alotano e di picco)e
quantità di curari sintetici, a seconda della n ecessità.
Durante gr an parte dell' inter vento la ventilazion e polmonare è st ata
m antenut a con respiratore automatico . Per la C.E .C. è stata usat a una
macchina cuore-polmoni con pompe rotanti a fl usso pulsatile, ossigenator e
a bolle e scambiatore di calore a contatto tramite intermediario metallico.
Sono st ati u sati alti flussi, pari in m edia a 2,5 1/ min/ m 2 di superficie corporea.
Gli int erventi, con durata m edia della C.E.C. di 45 min, sono s t ati eseguiti
in cmodiluizione; il sangue, n on più vecchio di 7 ore, raccolto in ACD è
stato diluit o p er lo più con Ringer jlattat o; in alcuni casi , an ch e con altri
liquidi e farmaci quali Rhcomacrodex, mannitolo, eparina, calcio gluconato,
acido amminocapronico, t rasilolo, antibiotici. La quantità di Ringerflattato
è stat a variata caso per caso in rapporto ai valori dcll'cmatocrito del paziente,
in modo da ottenere cos tantemente, durante l a p erfusione, un valore di
ematocrito del 30 %·
Per ogni paziente v enivano effettuati i seguenti prelievi :
l O prelievo: da p aziente in anestesia, ad intervento non ancora iniziato; prelievo arterioso per pH, P 0 2 , P C0 2 ; prelievo venoso per le altre
det erminazioni.
Ann. I1t. SupeT. Son(tà (1971) 1, 186-198
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1\ELAZ!Ol\J
188
20 prelieYo: dalla p a rH· infr•rion· d dr o,, j~en a t or t · dr Ha ruarrhina
cuor e-polmonr durant e la p r rfu~ i onc.
3o prdieYo: ari rrioso pc t· p IL PO~. PCO .: prelievo 'rno~o prr lr alt n·
drtrrminazioni, 24 orr dopo l'int er vento.
OILrc a r·iù abbiamo cll'cllunl.o un prelieYo di un campionr Jdla mi~l'(•)a
per infusion r (P = prime·) dalla macchina cuon·-polmorw al. trrmine della
emorliluizione, prima di efl'ct"l mu·c le rorrrzioni biorhimirht• Het·r,..saric, e
prima dcll'immif's ion c r.lclla mi ~<~ cla gassosa (02 95 %,
.5 '~ ~) .
D11rantc intern•ut o apparrrrhio per i rili1·' i o,,..imetrid era p osi o a
fianco della macchina cuorc-y ulruunc t: le determinaziOni. oltre che p er
i prelievi sopra indicati, sono s tate ripetute più v oh r srrond o la nece:-sitù.
Infatti, fin dalle prime e"p cricmw .li pcrfusionc extracorpor ca si è rilevat o
che esist e la possibili t il r h c s i s, ·ihrpp i u n' acido"i di 1ipo mrtabolico, compensata o no da alcalosi r espiratoria.
J fattori ehe J>OSSOilO infltH' Il:tart• r equilibrio acido-ha~C HO ilO Ì se~uenti;
- la velocità d el flusso sung uig no;
- la diluizione drl sangun ron soluzioni ,alint•:
- l' ipotensionc arteriosa, che pui'1 indurre ba ~si lin·ll i di prrfn=-ione
negli or gani che presentano maggior resist en za Ya~col are:
- le tecniche di anest esia w·atc.
Si t enga presente che il pH del sangue usato JH'r preparare la macchin a
prima del «by-pass » è sovente assai basso; il Yalorc rucùio da noi troYato ì·
di 7,05; esso non si modifi ca apprezzabilmente quanflo il sangue viene diluito
con la soluzione di Ringerjlat.lalo. È quindi necessario cor regger e il pH del
«prime » prima di effettuare la C.E.C. Abbiamo aggiunto a ques to scopo.
secondo l e neccssit~t, da 5 a l 5 mEq/1 di N aiiC03 , utilizzando una soluzione
a l 5 % fino a portare il pH ad W1 valore intorno a 7,40; l' aggiustamento
fìnalr del pH è effettuato a nr h e mediante ossigenaziour cl cl «prim e».
1":: evidente la n ecessit;"t di rilevar e quest i parametri biochimici, chr
dura n t c i minuti immediatamente precedenti l'inizio della C.E.C. assumono
uu·importanza addirittura determinante per la nor malitù del s uccessivo
decorso operatorio e p ost-operatorio. Anche n el corso dcll'interYento occorrr
mantenere uno s tretto controllo dci Yalori attinenti all 'etpri librio acido-basr
(pH, P0 2 .. PC0 2 , HCO;;-); durante questo p eriodo abbiamo dovuto proceder•·
solo al'sai di rado alla correzione di tale equilibrio m ediant e ulteriore aggiunta
ùi NaHC03 •
Come giù accennato in precedenza. abbiamo preso in comidcrazione
ancbr il comportamento dc11'acido la ti i co c ddl'aci(lo piruYico.
Poich~ la concentrazione d egli elettroliti nel plasma è influenzata dalla
composizione del «prime» utilizzato p er riem pire il sis tema extracorporeo.
r iteniamo opportun o ricordare i prinr ipa li diluenti impicgnti che contengono
elettroliti : ein dal l 90~ Azzolin a utilizza per l'emodilui7.ionc "oluzioni s alin P
r
r
co2
FERRARA, TARANTINO, SPANDRIO E GAVAZZENI
189
fisiologiche, onde ovviare ad eventuali alterazioni della funzionalità renale,
in accordo con l'opinione oggi prevalente che preferisce impiegare sol~i
saline anzichè liquidi privi di sale.
Le soluzioni da noi utilizzate .s ono le seguenti :
- soluzione di acido citrico, citrato e destrosio (ACD) che contiene
130 mEq di Na+ per litro;
- Ringerflattato, che contiene: 129,3 mEq/1 di Na+
5,5 »
di K+
1,8 »
di Ca++
111,8 »
di ciAbbiamo utilizzato inoltre l'eparinato di potassio e il gluconato di calcio
al lO %- Le altre soluzioni impiegate, il Rheomacrodex, il mannitolo e i vari
farmaci aggiunti non contengono invece elettroliti.
Per il dosaggio degli elettroliti abbiamo utilizzato i metodi seguenti :
- per il Na+ e il K +
fotometria a fiamma con apparecchiatura
a standard interno di litio;
- per il Ca++
metodo fluorimetrico con calceina in ambiente alcalino (Kempner-Hercules);
dosaggio titrimetrico con nitrato di mer- per il ciCUTiO in ambiente acido (Schales e Schales
modificato).
La concentrazione dell'urea ematica è stata valutata con metodo enzimatico (ureasi-dosaggio degli ioni ammonio mediante la r eazione di B erthelot).
Abbiamo determinato la glicemia con il metodo enzimatico alla glucosio
ossidasi-perossidasi.
Abbiamo determinato l'acido lattico e l'acido piruvico con metodo
enzimatico (lattato deidrogenasi) in condizioni di pH e di concentrazione dei
r cattivi e dei coenzimi piridinici tali da consentire uno spostamento praticamente completo dell'equilibrio lattato-piruvato verso l'uno o l'altro dei due
componenti (1•2). In pratica la misura è stata eseguita n ell'U.V. a 340 nm,
in condizioni rigorosamente controllate, sia p er quanto riguarda la temperatura, sia p er quanto concerne la precisione della lettura.
I dosaggi delle attività enzimatiche sono stati eseguiti mediante misura
nell' U.V. a 340 nm del sistema NADH-NAD secondo il principio delle reazioni accoppiate. Le condizioni sperimentali adottate sono analoghe a quel1e
descritte per il dosaggio del lattato e del piruvato.
Risultati e discussion e
I risultati ottenuti per i vari parametri da noi esaminati sono illustrati
uelle Fig. l-6. In ogni grafico abbiamo riportato sull'asse delle ascisse i
«]uattro prelievi considerati, e sull' asse delle ordinate le concentrazioni del
Ann . lst. Suv er . Sanità (1971) 7, 186-198
-------------------------------------------------------------------------------
.
-
190
P.I:I..\ZI II \ 1
parnmetro prt '!-O in t·~a me. P er op1i i"Ìilf.wlu preli•·' o ahJ,iam o riportato le
d evia;r.iuni ;,tandurù dd Yalorr m <·dio tr·uYato: l<· du,, lin t'l' ori :r.zoutali incl icano i limiti dei valori norm ali . Ogni singolo punto ri~ uarda 3 di ' <·rsi pa1.icnti.
T triangoli indican o la JUr din dci nostri dati rtt•ll'amhitn di ogni ~i ngnln
prclit•Yo.
I valori della concentrazion e del la ltato n<·i pazienti studiati (Fi~. l. o)
sono. sa lvo rare eccezioni, n ell'ambito della norma. Il valore m edio di q ne!"to
mg/100 m'
.,,_
F
~.-
l
2,5
2,0
mg/100 m t
60
p
60
l
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1,5
1,0
l. O
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p
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!9,9
!3,6
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m
0.$.±0,7
p
o
! 0,5
ll
..,,,,.
a
Fig. 1. -
Comportamento del lattat.o (a) e del piruvato (b) nl'l •an~u•' nrl cor-o tl<-ll'in·
Lervent o (v. testo). I .c due linee orizzont ali dcli naitanu l'intcn·allo tlt'Ì ntlori
normali. ~ = valore medio.
m c Labolita è elt•Yato JH'l« prim e» in conseguenza d i ùue 1·:n t ~c entll'omitanti:
l 'in !'l aurar;; i d t' l m el abulisuw anaerobico nel sa ngw· rom-e n al n dal momeu to del prclicYo al momento dell'u tiliz7.aziouc ,. - fu t t ore quanti t a t j, nm<' nt c pi ìr rilevante - l'alta concentrazione di ion i la ll nto )'rn.en ti nella
~olu zio nl' di Ringrr utilizzata p er la preparazionr llt·l « prirn e». l ri ..,ulta t i
del 2o prelieYo dimostrano che nei confronti dei Y;dori La~ali 'i i· llll t'erto
awn rnto ùd la t lato, la cu i roncentrazione ritorua i l giurnu ::.cgucnte a \ alorì
normali.
A 'I n. lat. Suver. Sanitd (1971) 7, lS&-lP'
191
FERRARA, TAI!Ai'ITINO, SPANORIO E GAVAZZENI
Per quanto riguarda il piruvato (Fig. l , b) l'alto livello che si nota nel
« prime» è dovuto solo ai fenomeni glicolitici già descritti : n el 20 e 30 pre·
lievo l'andamento del piruvato è analogo a quello del lattato, ossia si
ha prima lm aumento e poi un ritorno a valori normali 24 ore dopo
l'intervento.
mE q/L
p
120
mEq/L
160
p
150
l
______.__ __ __
,
6
l
110
,
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- -- -+---6---·... __ .::._
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....
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----+--·--"·-- --
140
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6
- --+---6--A-=::::.....-
90
130
80
70
o. s.:! 8,5
p
:! 6,4
:t 5,4
:t 5,0
I
n
m
o
Fig. 2. -
0.5. !5,9
!t.,O
p
!4,7.
II
:t 2,3
m
b
Comportament o del sodio (a) e dei cloruri (b) nel plasma nel corso dell'inteJ."Vento.
Le due linee orizzontali delimitano l'intervallo dei valori normali. 6. = valore
medio.
Come risulta dalla Fig. 2, a, il tasso plasmatico del sodio non ha presen·
tato nei nostri pazienti v ariazioni degne di particolare rilievo; il livello un
po' elevato nel « pr ime» può essere dovuto al citrato di sodio contenuto
nell'ACD.
P er quanto riguarda i cloruri (Fig. 2, b), s i nota un valore assai basso
nel« prime»: ciò è dovuto alla diluizione del sangue conservato con l'ACD,
ch e non contiene ioni cloro. I valori si mantengono nell' ambito normale
durante e dopo l'intervento.
A nn. lat. Supe1'. Sanità (1971) 7, l Be-108
19!!
RELAZI U/'.1
P er gli ioni calcio (Fig. 3, a), si osscr vnoo valori normali nei pazienti
<·d un valore elevato n el« prim e», in seguito all'aggiunta del calcio gluconalo
introdotto per n eutralizzarP. il citrato di Rodio.
E saminiamo ora il comportamento dc·lla polussiemiu; n ella nostra
casistica abbinmo riscontrato diminm:iune della concentrazione' degli ioni
mE q/l
p
8,0
'
l
mEq /l
~.c
p
7,0
l'
T
6,0
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5,0
t.,V
0 .5.'!.0,7
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n
p
a
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3. -
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! 0,5
D S..!. C.6
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:!: 0, 8
i
TI
±0,9
t (•,6
n
T''
b
Comport amento del calcio nel oiero (u) e MI rota.,;., nrl J!lasmn (b) nrl rur•o
dell'i ntervent o. Le due liuee orizzontali 1ldimilano l'intrrvullo dci valori ucmnali.
~ = valore medio.
potassio nel plasma (Fig. 3, b). el p eriodo post-opcratorio abbiamo riscontrato in m edia una diminuzione di l mEq/1 ri petto al primo campione.
Abbiamo trovato un valore basso nel« prime'», in seguito aU'emodiluizionc,
solo in p arte bilanciata d al potassio aggiunto come eparinato potassico.
Dalla F ig. 4 , a si rileva che i valori di base dell'urea (prelievo lO) cadono
tutti entro l'ambito della norma . La concentrazione dell'urea nel« prime»
(' piuttosto bassa: il valore m edio è pari a 0,24 g, J. La soluzione diluente
non contiene urea; e poicbè J'urea diffonde liberamente attraverso le m embrane cellulari, indipendentemente dalle variazioni del pll, il basso valorPosser vato va attribuito alla diluizione del sangue impiegato p er riempire
il sist ema. Il tasso riscontrato nel corso dell'inter vento t'l circa uguale a quello
iniziale; anche il valore riscontrato dopo 24 ore è uguale in m edia al valore
A nn. l at. Su per. Sani !.A (1971) 1, lSG-198
FERRARA, TARANTIXO, SPANORIO E GAVAZZENI
193
gjl
0,60
p
l
gfl
6,0
p
5,0
l
0,50-+----------
4 ,0
0,40
...
3,0
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6 _ _ _::
.....
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2,0
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_;.;_ 1,0
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- ----t---"!i
O S.!O,Oé
p
c: 0,04
I.
!:0,04
II
~ 0,06
o
0. 5 !0,78
m
!0,24
p
! o.ss
.: o,19
II
m
I
a
Fig. t -
b
Comportament o deU'or«>a (a) e del glucosio (b) nel sangue nel cor&O dell'intervento. Le due linee oriz?;Ontali delimitano l'intervallo dei valori normali. 6 =
valore medio.
di partenza. Ciò indica che, in assenza
di complicazioni r enali acute, non vi
sono a carico di quest o catabolita alterazioni dei normali processi di om eostasi.
Come risulta dalla F ig. 4, b, abbia•no riscontrato nel« prime » un valor e
elevato della glicemia, dovuto al destrosio contenuto n ell'ACD; in base ad un
bilancio quantit a tivo questo a umen to
dovrebbe essere maggiore, ma occorre
tener presente ch e una parte del glucos io va p erduta prim a dell' infusione per
l'att ività glicolitica degli enzimi enFig. S. -
Valori medi di GOT, GPT e LDH nel
siero nel corso dell'intervento. Le linee
orizzontali indicano, per ciascun enzima, il limite superiore dei valori
normali. O, e . .0. = valore medio.
LDH
GOT GPT
mU/m l
mU/rnl
25
p
.!!'L
-L-~.::.:" .,
20
.
............. ....... f.( .... .... .
150
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5
p
~
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50
I
II
m
A n n. l st. SUil6T. Sanità (1971) 7, 18~108
l
l
l
l
l
194
m:r.urONI
trocituri. In 6eguito, la diminuzione dt·lla r onccutrnzionc del glucos io è
analoga a quelJa che s i ha in pazienti norm ali dopo un carico di glucosio.
Le trf' attività •·ozimatiche prrse in eon" idt•razinllt', e cioè GOT, GPT e
LDH (Fig. 5) s i comportano in mod o unalogn. ·cl « prime» i valori sono
Lassi per la cliluiziout• del sangue; nrl primo campione i valori sono uormali .
Duruult· c dopo l'in ter veulo si h a un progressivo numcoto dci t assi enzimatici nei confronti dei valori basali, sia purt r ntro limiti p er lo pit• moùt•t.l i.
L 'aum<•nto può esser e forse attribuito i u pirt·ola p orte all' em olil:>i dovut a
a ll'azionl' m ct'l'anit•a della macch.ina euore·polwuui ; esso ast.umt> peraltro
mU/ml
mU/ml
_.:,.20:. :0~
j
90
75
p
250
p
105
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60
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100
30
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50
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0.5.±2,1
±4,5
p
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Fig. 6. -
:::11,3
! 21,0
D
m
DS!:1l.,G
! 17,8
p
,,
±34,9
! 36,0
n
m
Comportament o della COT (o) c df Un LDll (b) n<'l oicro nel cort.o ddJ'intervevto.
L'intervallo di'i "'alori normali è indicat o clnllc linci.' ori7-zomlali. 6 = ,-alure
medio.
particolare interesse per la GOT c la LDJI, in quanto dimos tra che durante
l'inter vento si verifica una liberazione di enzimi dalle cellule miocardiche
danneggiate.
È interessante notare che, in maniera analoga a quanto a\ viene nel
danno miocardico s pontaneo, l'aumento della GOT (Fig. 6, a) è pitt precoce
c mar cat o di quello della LDH (Fig. 6, b): infatti nel 15 °~ dci nostri casi il
t asso della COT è superiore alla norma nr l 2o prelievo, mentre la LDH r esta
r ntro i limiti della norma. Questa modificazione è ancora pitt evidente 24 ore
J opo l'intervento (30 prelievo) : il valore medio della COT raggiunge livelli
drcisnm<'n t e pat ologici anr he se non parngonnbili u qurlJi che si osservano
Ann, lat. Suller. San!td (1971) 7, 186-UIS
l
l
l
l
l
l
l
l
fEIIRARA , TARANTINO, SPANOniO E GA\'AZZENI
L95
nell'infarto m iocardico, me ntre la LDH, pur dimostrando un progri'S ivo
aumento, non s upera il limite superiore della norma.
t; importante s egnalar e la presenza di un gruppo di pazienti che al 30
prelievo hanno pr esentato valori più marcatamente elevati sia per la GOT
che per la LDH (Fig. 6, a, b): tutti questi pazienti hanno rivelato, nei giorni
successivi all'intervento, complicazioni cardiopolmonari. Minore interesse ha
avuto p er noi la GPT, i cui valori nella nostr a casistica si sono mantenuti
co ' tantemente nell'ambito della norma.
In base ai dati raccolti, possiamo affermare che nei nos tri operati
abbiamo potuto evitare di norma i due maggiori p er icoli a cui sono esposti
gli individui sottoposti a intervento con C.E.C. : l'acidosi e l' ipossia.
Ricorderemo che già nel 1956 Kirklin e coll. (3) misero in evidenza
l'importa nza di una velocità di flusso adeguata pe r la profilassi dell'acidosi
rc!!pirntor ia: un b asso flusso era associato ad un abbassamento del pH ema·
t ico, mt•ntre a fiussi più elevati il pH rimaneva stabile, con valori vicini alla
norma.
Dc Wall e coll. (4 ) osservarono che durante la C.E.C., quantunque
il pH n on deviasse apprezzabilmente dalla nor ma, s i verificava r egola rmente un abbassamento dei bicarbonati plasmatici, accompagnato da un
aumento dell'acido lattico: si trattava evidentemente di uno s tato d i
a r idosi compensata, in r apporto con il procedimento di « by·p118s» cuorepolmoni, d i origine ipossica; questa acidosi si può sviluppare quando la
perfusionc non fornisce quantità di ossigeno sufficiente al fabbisogno elc i
tessuti.
D ennis e coll. ncll951 {5), Coffin e Ankeney n el l 960 (') hanno dimostr ato
che negli interventi con C.E.C. può t a lvolta instaurarsi una s ituazione di
ipossia , con pr evalenza del m etabolismo anaerobico c conseguente aumento
1le ll'acido lattico. I nostri dati ci consentono di escluder e il verificarsi d i
tfUCSto inconveniente n ella no tra casistica. A nostro a vviso ciò è dovuto
a lla rigorosa correzion e del pH del « prime», come anche a l controllo
r alla eventuale correzione dell'equilibrio a cido-base durnntc la C.E.C.
Fattor r pnre molto importante t- il manteuimento di una vcloritù dj flusso
adeguata.
I modcsliSH imi numenti da noi riscontrati pl'r il lnttato c per il piruvato
dimoatruno r he ne i nostri ca si l'equilibrio acido-base ha potu to r sserc tenuto
cost ant em ente ::.otto controllo.
Per quanto riguarda i cationi, ricorderemo che già nel 1957 Hayes,
\X.illiamson c Ilcindt•nreich t 7) hanno osservato che quando s i somministra
solamente boluzione glucosata i verifica ritenzione di Na+ cd aumento della
l':.crt>zione di a ldost er one; dal canto loro, Dieter , "Ncville e Pifurré (8 ) hanno
d imostrato t·he se hi sommini trano soluzioni saline, come Tiingcr /lattato, i
(•,·itano la iper secr ezione di aldosterone con le r elative eonsrguenze met a.t nn. h t. Suoer. Sanotd (19711 7,
I~G-Uh
Jt)(o
RE[.Allll\1
lmlichl·: una pa rte del sodio introdotto 'it'nf' t•limiualo con h· urine, mcntr,·
la ronccnlra:t.ÌOIH' del so<iio nel plasma rimati\' praticamente .invariatu.
l nostri ris ultati, ottenuti con l' impi ego eli :-oluzioui saline isotonidu·, ei
permettono <li confermare l 'asS!'rlo di D iet cr, cvillt· c· Pifarn\ Ln riduzioni'
della polasH iemia riscontra ta da noi come da nl1 ri A•\.., può derivar•· da
tliversi fallori. Ricordiamo tra ques ti il trattamt•nttJ di~italico l' la h·rapia
l'On diurl'tici in fase preopcratoria (9·10): la dih1i7.imw fil•l li!]uitlo eli pcrfu.,iorr-d urante l'intervento; l 'eventuale· correzione in cccc~;~o dell'acido" i con
aH COa (che può spostare l'equilibrio aci,Jn-bast· th·l pazic ntt· vrr:-o r alc:•l o~i) . Può anchl· istituirsi a volte un'alcalosi r espiratoria da ipt•rventilazimw.
\ Itri fa llori po sono essere costituiti dalrauw r·nlo della secrezione min era·
ltH·orticviclc iu seguito allo s trt'~" cl1irurgico, t• la pcr,i l\•ntc JH·rtlita tli
J'Otast>io cou le urine dopo l"intern·nto.
P er quanto riguarda gli enzimi, il mocll''-LO aumento ri:.toutrato 11 1 l
t'<lrso ddl'iut crv~:nto e dopo di e:-«o va attribuito in prima linc·a alll' m ani ·
polazioni chirurgiche efl'elluat<' sul cuor e: la m udc:-,1 a entitù dcf!li a ument i
O!'S<'rvati imlil·a peraltro che le couscgucnzc eh· i tranmi soppnrlal i dal mio·
1·nrdio sono assai limitati . Per quanto riguard a in particolare la GPT. i
v alori normali da noi ottenuti sono in contras to con quelli di altri a utori
( 11.12 ) r bc hanno riscontrato valori a ument at i, senza ~''"''r<' in ~r:t tlo di prt'·
eisare se l'aumento riscontrato era dovuto n soffen•ut.a epatica o ad altri
motivi di sofferen za celhùare.
A titolo di conclusione, possiamo asseri•·u che un' assidua assistenza di
labor atorio con controlli biochiwir i ripetuti ro:'i litui:>tC per il chirmgo una
g uida indispensabile ne l trattam e nto dci sog~<~U i sottoposti a C. F..C. lia
pnrtirolan' importanza il controllo dcll'ct{ltilibrio arido-ha'>c, pt·r il CJuaJ,•
i da ti ùi la boratorio assumono w1a funzione fomlnm cntal<' speric ndla fas •·
preopcr atoria.
l mporta n t c i· anche il con trollo ùclla conce n trat:iunr p ia~ ma tic a dd
potassio. specie nel periodo post-opcratoriu, dutn la fal'ilitì1 cou <·ui può
. . viluppar,i ww depl cz ion c~ pota!'Sit'n; poir h.-. ripopotn ' iemia ptH) pronwan·
aritmie cardiache, i nostri pazienti ono co,tanl!·nwnlt' ('(llllrollati nd pe riodo
post-opcr.tlorio dal pWltO di vi ta c lcttrocardiogrufìt·o. e la d <>tcrminazi01w
della concentrazione degli ioni pota.-'<it·i Yi(·uc· ript' luta cou purtico larc
f rcqucnza.
La Ùclcrminazioue d r llc ntti,·it:'t e n:.r.imnl id~t· d r Ila GOT ,. d C'Ila LDH
può cs>'crr utile in quanto può consentir<' liiHI 'ulutazionc di'Ila ~ ofl'cr cnza
miocardica . in particolar m odo dopu l'in tcn t'tllo.
Da tùtimo è opportuno contrullarc clu.rantt· il periodo po,t·utwratoriu
In ditLn·~ i r la concentrazione e matica dell'llrt•a; iu rari casi "i p111ì co:;:Prc
un aumcutu del Lasso ddl'urt'a, quali' indi<'C' delln rvcntuale iu~orgcnza di
complicaziuni renali acute.
A nn . llt. Su ocr. Scnlit<l (1971) 1,
I,C,..J \J ~
FER&AII.l, TARANTINO, SPANDIIIO E G!VAZZE.NI
197
/
Riu1unto. - Durante e dopo circolazione extra-corporea in coreo di
interventi di chirurgia correttiva su un gruppo di 100 puienti. di età com·
presa tra i 3 e i 12 anni, con malformazioni cardiache congenite, sono stati
eseguiti esami biochimici di alcuni parametri particolarmente importanti
per un controllo generale dd paziente.
I parametri esaminati sono:
- equilibrio acido-base con dosaggio del lattato e dd piruvato;
- quadro elettrolitico;
- azotemia e glicemia;
- alcune delle più importanti attività enzimatiche del siero.
Si discutono i risultati ottenuti sottolineando l'importansa pratica di
un controllo continuo dell'equilibrio acido-base durante l'intervento, e della
cleterminazione del potassio e degli enùmi nel periodo post·operatorio per
la profilassi e il trattamento di eventuali complicazioni.
Summary (BU~clumical controu durin& an.d ajùr aurgery performfJd in
extra-corporeal circulafion). - Biochemical testa of some parameters, parti·
cularly important for a generai contro! of patients were performed on a
group o{ 100 patients between 3 and 12 year-old during and alter surgery
performed in extra-corporea! circulation for congenita! heart malformations.
The parameters examined are:
- Acid-baae balance, with doaage of lactic and pyruvic acid;
- Plasma electrolytes;
- U rea an d glucose levela in plasma;
- Some of the most important enzymatic acnvtnes of serum.
The Authors discuss the results obtained and stress the importance ot
a continuous contro! of the acid-base balance during surgery and of the
determination of potassium and of enzymes after surgery for the prophylaxis
and treatment of possible complications.
BmLIOGRAFIA
(') HouoR&T, H. ]. In: Melhod. of En")'11\Qtic Analy•ùr, H. U. Bergmeyer Ed., Acad.
Preee, New York 1963, p. 266.
I~t: Mttlaod. of Ensymotic ArualYJil,
H. U. Bergmeyer Ed., Acad. PreN, New York 1963, p. 253.
( 1) Kmlu.m, J . W., D. D. DoNALD, H. B. liu.sHB.UOU. P. S. HETZBL, R. PATlUCK..
H. J . C. Sw.A.N& E. H. Woon. Ann. S~., 1", 2 (1956).
(') D:a WA.LL, R. A., H. E. W.um:&l'(, V. L. Gon, R. C. Ru.o, R. L. Vuco &: C. W.
LULum. }. Thorocic Sur&·· 31, 591 (1956).
(•) Dmmts, C., D. S. SPllll!fG, G. E. Nnsol'f, K. E. KAlluol", R. M. Nnsol", J. W. TnoiU.!,
W. P. Eon &: R. L. Vuco. Ann. S urg., 1M, 709 (1951·a).
t') B6Clll'!a, T., R. Czol'. W. L.ui:PllECBT & E. L.uu.o.
l
A""· llt. Supn. &1\IU (1971) 7, 18&-188
l
l
l
l
l
198
(e)
RELAZI0:-11
COFFII',
L. H . & L. ANKE~EY. Arri•. Surg., 80. -H 7 (1960).
(1) H AYES. M. A .. R. J. \\'tLL~'lSOI" &: W. F. H E t NDENIIEICfl . • rugcry. 41. 353 (!957).
1 8) DlET Ell, H.. A., W. F.. NEVTLI.E & H. PtFAJtn É. J. Tlwrctcic Cordiovoscular .'iu r~ .. 59.
168 (19-;"0).
(~) LOCKF.Y ,
(1°)
(
11
)
o. N.
E.,
NEVILLE.
' ORBERG.
H.oss,
W. E. & P . J.
o. n. LO:-!(;~IORE &
TAL&O.
M. F. S ·ru nnroca; . LoncPI, i, 67 1 (l96f>).
S urgrry, 63, 220 (1961!).
n. &
('~) NAitVA"'Ei>~ ,
A. SF.NN~(;. Acta Chir. Scand. Suppl. 245. 275 (19.)9).
S. Scan d . .!. Clin. L(Lb . ln vest .. 18, Suppl. 91 (191•6).
Per In circolazione extracorporea sono stati consultali i seguenti te~ti :
P . :M. & G. A BltEC nr.rt. H cort-Lrmg JJ_y-pass. .Principlrs nrul Techniljii<'S '!l
Extracorporeal Circularion. Grune-Strattoo. •c,,· York 1911:!.
GALI.E'ITJ,
:E. l l, .M. D. E.wrncorporrnl Circulntion ,/Ìlr Oper•· l-leart :Srlfguy,
C. Thomas E d., Spingfield, Jlli nui~, 1969.
CONVERSE l'F.tRCE
Charl('~
l
l
•
l
l
l
1l
l
l
l
l
l
l
l
l
Ann. Jat. Sv.por. Sanitd (1971) 7, 186-103
l
l
Méthodes ftuorimétriques pour le laboratoire
de chimie clinique
M. ROTH
Laborafoire cen fTal, H 8pital cantonal Gen~e, Suine
La fiuorimétrie se range parmi Ics mé thodes Ics plus utiles de l'nnalyse
biochimique. Les premièr es puhlications sur l' utilisation analy tiquc d e la
Ouorcscence parurent il y a environ cent ans. C'est l'époquc à luquelle
Thudicum ( 1) observait la fluorescence rouge d e l' hé matoporphy rine et Jaffe (2)
d écouvrait la fiuor escence verte donnée par l' urobiline en présence d e zinc.
Oo se bornait au déhut à des examens qualitatifs et l' utilisalion du phénomène pour l'analyse quantitative s'es t surtout d évcloppée au cours d es
quarante ans qui nous précèdent. Le progrès co ce domaine a été fa vorisé
par la Jnise au point d e sources lumineuses convcnahles, d e filtres eolorés
ou à interfér ence, de monochromateurs et d e cellulcs photoélectriques. Parmi
Ics plus r écentes contributions de la technologie, le photomultiplicateur et la
lampo à are d e xénon se sont r évélées très profitables .
Rappelons brièvement qu'un fluorimè tre est constitué d ' une source
lu.mineusc, d ' un monochromateur primaire ou d'un filtr e primaire d estiné
ù isoler la portion dés irée du spectre de la sottrce, d ' une cuve contcnant
l'échantillon, d'un monocluomateur secondaire ou d 'un filtro sccoodaire,
d ' un d ét ect eur (qui fut autr efois l'wil d e l'analysto, puis une cellule photo·
électrit[Ue, et qtù est gfonéralement de nos jours un photomultiplicuteur),
e t d ' un indicateur (galvanomhrc, oscilloscope on r.ompteur d e photous).
Parmi les avantages ùe la fluorimétrie, il faut citer la sens ibiJité, qui
est environ 100 fois m cilleure que celle ùes m éthodes pnr photométrie
d'absorption. .En outre, en solution cliluée, l' intens ité d e fluorescence l est
rcliéc iì. lu concentration de suhstance fluorescente C par la fonction linéaire
I = kC, k tltant une constante t enant compte des cnractéris tique du
fluorimè tre et de la suhstance à doser. La simplicité de cette fonction faci·
Lite l'évaluation des r ésultats. Elle r end superflua les dispositifs d e linéarisation utilisés co photomé trie d'ahsorption.
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naphtalène-2-sulfonate, puis obscrvée sous une lampe à rayons ultraviolct s.
L es zones protéiques apparaissent à la surfacc du gel sous forme d 'anneaux
fluorescents, ce qui rend leur localisation aisée. Cc procéd é très simple a
l'avantage d c préscrver l'intéricur du gel, d e sorte q ue les protéin cs qui s'y
trouvent sont intactes et pcu vent etre oumises à d 'autres t est s .
Signalons qu'en biochimie fondamentale, on utilise ce typc de r éactif
pour étudier les sites hydrophobcs cles protéines.
Ma is les protéines n e sont pas les scules macromolécules capables
d'intensificr la fluorcscence d'un composé. Vous savez que le r éactif histologique auramine O, qui est p cu fluor escent, fournit une fluorcsccnce marquéc lorsqu' il est adsorbé sur Ics a cides nucléiques. Or, il y a quelques
annécs, Le P ecq et Paoletti (9) ont m ontré qu' un autre composé, le bromure
d'ethidium, fo rme un complcxe fortcmcnt fluoresccnt avec les acides nucléiqucs.
I ci encor e, la r~action est pratiquem ent instantanée et son cxécution
se limite à un simplc m élange d c d" ux solutions . Sur cettc base, La R oque
et al. (10) ont dévcloppé un dosage scnsible de l'acide désoxyribonucléique
dans le plasma humain.
Le m étabolisme de l'hèm e, la partic non protéique de l'hém oglobine,
f'St un domaine englobant de nombreuscs substances que l'on p eu t détecter
par fluorescence. Chose curieuse, peu de m éthodes ont ét é élaborées pour
leur détermination quantitative, sauf c n cc qui concerne les porph yrines.
Par exemple, la fluor escence de l'urobiline en présence de zinc est cxaminée
chaquc jour dans cles centaines dc laboratoircs d e par le monde, mais uniquemcnt d e manière qualitative. A v rai dire, cles versions quantitativcs d e
ce t est ont ét é publiées (U), mais leur validité est incertaine. Les difficultés proviennent du fait que l'urobilinogène, dont le taux doit normalement
etre déterminé conjointem ent à celui de l'urobiline, se pret e mal à une
oxydation quantitative par cles substances tclles que l' iode, qui est l'oxydant utilisé ùans le t est qualitat if. Si l'on ajoute trop pcu d'iode, la quantité d 'urobilinc form ée est inféricure à ce qu'elle d evrait etrc, et si l'on en
ajoutc trop, une partie d e l'urobiline sera oxydée plus avant avec production
de d érivés non fluorigènes. Dans les deux cas, on obtiendra d onc une Huorrscence trop faible en présence d e zinc. Le problème consist e ici à trouver
un oxydant moins puissant que l'iode. n est certain qu'mle détermination
quantitative de l'urobilinogèn e dans le sang préscnterait un intér et d iagnos tique.
U n problème analogue se pose ave c la bilirubine. Il exist e une vieilie
n~action de Buorescence pour la bilirubine, d écrite en 1908 par Auché ( 12).
EUe consist e à m élanger une solution alcoolique de bilirubine avec une solution d ' acétate d e zinc, et à ajout er une très faibl e quantité d'iode. On
observe u ne belle fluorescence rouge sous la lumiè re d e W o od. E n 1930,
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IIELAZIONI
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Dhér é (13) rapportait qu'il était capabk d C' d éceler 0,1 tJ.g/ml d e bilirubin e
au moyen d e celte r éaction. J 'ai t cnté dC' m cttre au point une vers ion quantitative d c cc t est. Malhcurc usem ent, les cssais furcnt infructueux, ca r
un excès d ' iodc d étruit le composé r esponsablc d e la fluorcscence. P ar
contro, il m 'a été possiblc, lors d ' autrcs cssais. d 'élaborcr une techniquf•
fiuorimétriquc d c d osagc d c la bilirubine reposant s nr un principe difl"l-r cnt.
On m éla nge une solution d c bilirubine, contenant d c l' albumine, avec douze
foi s son volume d 'acide phosphorique à 85 %, puis diluc l e m élange obtenu
avec 60 volumcs d ' eau. On ob tient une solut ion présentant une fl uor escence jaune (!4) . Il n 'y a pratiqucment pas dc fluor cscence en l'absence
d 'albumine. Il s'a git probablcment d 'un a u tre excmpl e de molécule qui
d evient fluorescente si elle est adsorbé1' sur une protéine. La r éaction est
donuéc aussi bien pa r la bilirubine libre que p ar la bilirubine conjug uéc. dc
sorte quc la m éthode mesure la bilirubine totale. E lle est très simple et
perm c t d c déterminer , eu routinc, d c grandcs sérics d 'échantillons. La r cproductibilité es t excellente, m eme dans la zone cles valcurs normales, et il
est m em c p ossible d e mettre cn évidencc d es h ypobilirubinémies, cc qui
s'observc dans certains t y pes d'anémic. Un avantagc d c cctte m é thod e
est qu'elle mesure égalcm cnt les produits de photodécomposition de la
bilirubine. Ainsi, un sérum qui a ét é abandonué plusie urs heures sous
l'éclairagc ambiant du laboratoirc fournira d es valcurs qui n e seront pas
diminuécs.
Nous avons ehcrehé à aug rnenter les possibilités d ' utilisation dc la m r thodc en l' adaptant au d osage différenlicl d e la bilirubine libre et d e la
bilirubine conjuguéc. Après plusieurs invcstigations infructueuscs, nous
avons fìualem ent r éussi à mettre au point, tout récemment, une t echniquc
d 'cxtraction de la bilirubine librc par la 2-méthyl-isobutylcét onc, cc qui
p e.r me t d c d éterminer fluorimétriquement la bilirubine conj ug uée qui r este
dans la phasc aqueuse. La corrélation avec une méthoclc diazo couventionnolle d ét erminant la bilirubine duectc e st bonnc.
L' hémoglobine, quant à elle, n'est pas une sub!>tanee fluorescente. l\lais
il est connu depuis 1904 quc si on la traitc par un acide organique t't un
agcnt r éductcur, l'atome d c fer est séparé du hèm c (L6) , On obticnt alurs
une porphyrine fluorescente. Morrison (16) a publié une m éthode fluorimétrique permettant d e détermincr d E' très faiblcs quantités d 'h émoglobine, la limite inférieurc se situant à 0,01 f.Lg d 'hémoprotéinc.
Comme on vient d c le voir, l'oxydation ou la r éductiou s 'accompagn('nt
souvent d e l 'apparition d 'une fluoreseenec . En fait, on connait d e nombrcuses s uhst ances pouvant etr c soumises il une r éaction r évcr siblc d 'oxyd or éductiou avcc un changem cnt d c fluorescenrc concomitant. D c t cllcs suhstances p cuvcnt etrc utilisées commc indicateurs r ed-ox fluoresccnts. Un
excmple bien eonnu est le NADH, qui est fiuoresccnt, contrairemcnt à sa
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forme réduite, le NAD+. L cs nomhreuses utilisations de cette propriété
pour la dét crmination d'enzy mes et de suhstrats sont bien connues. Une
autre suhstance biologique, la ribofiavine, est fluorescente sous sa forme
oxydée et non-fluorescente sous sa forme r éduite . D e m ème, il existc des
composés synthétiques qui subissent de t els changements par réduction.
Cependant, les t cxt es scientifìques sur les indicateurs red-ox fluorcsccnts
sont rarcs. Un composé de ce typc est le ~-naphtoquinone-4-sulfonate de
sodium, qui n'est pas fluorescent. Freytag (17) a montré qu'il est réduit
par l'acide ascorbique en une suhstance à fluorescence bleue qu'il supposa
etre l'hydroquinone correspondante. Nous avons étudié cette réaction et
confirmé que la fluore scence est bien due à la formation de l, 2-dihydro·
xynaphtalène·4·sulfonate (18). M.me B. Huhmann ( 19), qui a fait sa t hèse de
doctorat sur ce sujet, a été à m eme d'élaborer une t echnique fluorimétrique
de détermination de la vitamine C basée sur cette r éaction. A pH 4, la vita·
mine C réduit rapidement et quantita tivement le r éactif, alors que la cystéine
et le glutathion ne réagissent pratiquement pas. La méthode es t simple,
hien reproductible et applicable au dosage de l'acide ascorbique dana le
plasma sanguin.
La sensihilité est hien suvérieure à celle de la m éthode colorimétrique
au dichlorophénol-indophénol, de sorte qu'elle perme t de dét ecter des valeurs
inférieures à la normale. Le seui inconvénient est que le réactif, une fois
<lissous, est sensible à la lumière. Sous l'inBuence de celle-ci, il est trans·
formé graduellement cn un composé présentant la mème fiuorescence que
la forme réduite. On doit donc préparer la solution de naphtoquinone·sulfonate le jour de l'emploi et la protéger de la lumiè.re, ce que l'on peut faire
en entourant Ics tuhes de papier aluminium, ou en utilisant des ép.rouvettes
en verre inactinique.
La méthode convient bien à des dosages en série, et elle est actuelle·
ment utilisée dans notre hopital dans le cadre de travaux consacrés à l'étude
de l'ascorbémic dans différents états pathologiques.
Le domaine des lipides est également sujet à d'intéressantes applica·
tions dc la fiuorimétrie. La détermination des triglycérides, automatique (3 )
ou manuclle (20) est un cxemple. Signalon s qu'il exist e un moyen plus
, imple de déterminer Ics triglycérides sériques: la néphélométrie. C'est une
tcchnique apparentée à la fiuorimétrie, qui p eut s'exécut er convenablement
à l' aide d ' un fluorimè tre munì du mème fìltre pour la lumière primaire et
la lu mière secondaire. Les triglycérides du s érum ont la propriété de diffuser la lumièr e, et dans certaines conditions, l'intensité de la lumière diffu sée à angle dr oit es t directement proportionnelle à leur con centr ation .
La méthode consiste à diluer le sérum, à le passer à t ravers un ultrafiltre
capable de retenir les chylomicrons , et à mesurer la diffusion du filtrat par
néphélométrie (21•22 ) . On notera à ce propos qu'il est plus pra tique d' utiliser
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RELAZI0:\1
un néphélomètre ou un fluorimtotr e réagissant dc façon linraire à rinten sit(dc lumière diffuséc, plutot que le néphélomètre de Stone et Thorp (21).
Quant au ch olestérol , il donne plusieurs r éactions fl.uorcscentes. En
fait. certaines réactions coloréel' du cholestér ol sont cn miìmc t cmps fluorrscentes. C'est le cas d c la réaction de Licbermann-Burchard (23) et d(·
celle de Salkowski (rrf. (15), p. 85). Quclques-unes sont cxtrememcnt sensibles.
On sait !)ltC les rncillcurcs t echnique:, de détermination clu cholestérol
comportcnt une extraction par un solvant organiquc. Or, il suffit dc très
peu d'e:x'"trait pour une détcrmination fluorimétriquc, de sorte quc l'évapo·
ration à sec d e l'extrait peut se fair e rapidcment. Les extraits dans J'isopropanol, tri\s utilisés pom isoler la fraction lipidique du plasma, se pretent
bien à la détermination fluorirnétriqu e du cholestérol. Nous avons obtenu
d'excellents r ésultats avec la version fluorimétrique de la réaction de Liebermann-Burchard appliquée à de tels extraits.
J 'en arrive à une cles applirations de la fluorimétrie qui v a certainemcnt
le plus contribuer aux progrès de I'analysc clinique dans les années à venir:
la détermination des enzymes.
Quantité d'enzymcs sont m csurables par fluorescence, et cela a vec unt'
scnsibilité qui se compare à ce1lc d es m éthodes radiométriques. Dans le!laboratoires appelés à analyser de graudes séries d'échantillons, l'utilisation
d'un fluorimètre en piace d'un sp ectrophotomètre permct de diminuer k
volume de la prise. Les quantités de réactifs sont beaucoup plus faiblcs d•·
sorte que d' importantcs économies sont r éalisables chaque fois que d es substrats ou des enzymes coiìteux sont impliqués. L e principe de ces déterminations consiste à mesurer la vitesse d'une réaction enzymatique dont soit
le substrat, soit un produit p eut etre déterminé sélectivement par fluorimétrie. Pour le dosagc d'hydrolases, on utilise de plus cn plus des substrall'
fluorigènes, c'est-à-dire des suhstrats non fluorescente qui, par hydrolyst·
enzymatiquc, donnent un produit fluor escent. Par excmple, l' amino-pepti·
dase hydrolysc le L-leu cyl-~-naphtylamide (qui, comme tous les dérivés
N-acylés de la ~ naphtylamine, n'est pas fluorescent) en leucine et ~-napb­
tylaminc, une substance à forte fluorescence bleue. Gracc à cette réaction.
on détermine aisément l 'aminopeptidase dans le sérum ("). Si le produit
se trouve ~tre fluorescent au pH d'incubation, on peut m eme suivre dircc·
tement la cinétique enzymatiquc.
s uflìt pour cela dc disposer d'un fluo rimètrc munì d'une thermostatisation du comparti.ment de la cuve à mesurc.
La r éaction enzymatique se déroule dans le fluorimètre lui-meme, et l'on
enregistre l'augmentation ou la diminution de fluorescen cc en fonction du
t emps. La m éthode cinétique est très précise et se prete bien à des déter·
minations en série; on p cut facilement effectuer les analyses à une cadence
de 40 à 60 à l'heure. Le controle de la cinétique est une bonne vérification
n
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ROfH
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de la validité du résultat. On peut meme imaginer des cadences plus rapides
grace à l'emploi de photomultiplicateurs très sensibles et de systèmes ~
mettant le mélange rapide de l' enzyme avec le suhstrat.
Parmi les suhstrats fluorigènes utilisables avec profìt dana le lahoratoire
médical, citons la N-oc-benzoylarginine ~-naphtylamide pour la trypsine du
s ue pancréatique (2A), la ~- carbonaphtoxy-phénylalanine pour la carboxypeptidase A (28 ), la ~-carbonaphtoxy-choline pour la cholinest érase du sérum (5), le naphtyl phosphate pour la phosphatase (5} et les glycosides de la
4-méthylombelliférone pour le dosage des glycosidases correspondantes (5).
Le NADH est un coenzyme fluorescent qui s'apparente ù un suhstrat.
La forme oxydée, NAD+, ne fluoresce pas. Le large emploi qui est fait de
la mcsure de l'absorption du NADH dane l'ultraviolet pour la détermination de déshydrogénases est bien connu. Les memes réactions enzymatiques
sont mesurables par fluorimétrie, avec l'avantage d'une sensibilité environ
ccnt foia supérieure. Nous utilisons une t elle méthode pour déterminer la
lacticodéshydrogénase en routine (5).
Grace à la microélectrophorèse, il est aujourd'hui possible de séparer
convenablement de nomhreux isoenzymes. Cependant, la détennination
quantitative des fractions ainsi séparées pose dea problèmes de s ensibilité
e n raison dea faihles quantités d'enzyme déposées sur la bande. I ci encore,
la fluorimétrie se révèle précieuse. On peut rendre les fractions fluorescentes
soit en incuhant directement sur le support avec un suhstrat fluorigène, soit
cn procédant à une élution par zone et incuhation dea éluats. Parmi les
isoenzymes qui ont été dét erminés par fluorimétrie, citons la Iacticodéshydrogénase (27), la phosphatase alcaline (28} et la ~-galacto sidase (29).
Au vu des multiples applications que j'ai énumérées, on peut se demander
pourquoi la fiuorimétrie n'est pas utilisée davantage dans les laboratoires
de routine. J e suis persuadé que la cause r éside dana un manque d'infor·
mation et, souvent aussi, d'équipement. Le fiuorimètre est encore trop
souvent considéré comme un instrument réservé à la recherche ou à des
déterminations spéciales. Cette conception est en train de disparaìtre, car
l'acquisition d'un fiuorimètrc se justifìe dans tout bon laboratoirc. Le fiuorimètre à fìltres, moina cher que le spectrofluorimètre, permet d'effectuer
une bonne part des dét erminations dont j' ai parlé. Le maniement dea instru·
menta est aisé. Rappelons cependant que la propreté de la verrerie et des
réactifs est un élémént essentiel de la réu ssite de ces analyses.
J 'espère que mon exposé aura contrihué à familiaris er les analystes
avec un aspcct très prometteur de l' analyse clinique.
Ria88unto (Metodi fluorimetrici nel laboratorio chimico-clinico). - I progr essi m etodologici e tecnici di questi ultimi anni hanno dimostrato che
la fluorim etria, il cui impiego nei laboratori m edici si limitava precedente·
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RELAZIONI
mente ad un piccolo numero di sostanze come le catecolamine, le porfìrine, alcuni steroidi. ecc. si presta assai bene alla det erminazione di num~>­
rosi altri composti. L'analisi fluorimetrica presenta il vantaggio di uua
elevata precisione e sensibilità.
Vengono descritte alcune delle numerose recenti applicazioni della fluorimetria nel campo della chimica clinica quali il dosaggio delle proteine, d c~li
acidi nucleici , del colesterolo, della bilirubina c deiJ'acido ascorbico e vienP
esaminata la possibilità di applicazione al dosaggio di alcuni enzimi.
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Summary (Fluorimetric methods in the clinica/ chemistry laboratory).
I n tbc latt'st ycars, methodological and t echnical progress showed that fluorimetry is quite suitablc for tbc deterxnination of many compounds. wherca ~ .
previously, it was used in medicai laboratorics only for a s mall number of
suhs tances such as catecholami.ncs, porphyrincs, some stcroids. etc. TIH'
fluorimetric analysis has the advantage of b cing very accurate and sensitive.
Some of the various r ecent applications of flu orimetric analrscs in
clinica! chemistry, such as assay of protcins, nuclcic acids, cholcsterol.
biliruhin and ascorbic acid. are dcscrihed, and the possibility of th<'ir application to tbe determination of some enzymcs is cons idcrecJ.
l
l
l
l
l
l
l
l
l
REFEREtxC E
( 1)
TuuDICUUM, L. W. On chernicnl iclentilìcation of disea•es. Report of J\lediral O.ffìcrrLond on, 10, 228 (1867).
( 2) .lAFFE ,
( 3)
M. V irc.ho11·'s Arrh. Pathol. An«t. Physiol., 74. 405 (1869).
KESSLEB, G. & H . LEDERER. Teclwicon Symposia 1965, Mediad I nc. Edit c ur.
·,._,.
York 1966, p. Hl.
( 4)
CR.OIP, D. G., & G., ROBERTSON. Anal. Biochena., 25. 246 (1968).
( 6)
ROTR,
M. Mt·tlwds Biochem. Anal., 17, 181) (1969).
(') 1\lcCLURF.. W. 0., & G. M. EDEL!I!A:-.. Bìochemistry, 6 , 567 ( 1967).
V. B., J. E. FILOE5 . & D. J. n. LAV RENCE . .T. Clin. Pathal., 7 , 336
D. K., & S. LDENFRTENO. Ano/. Biochem., 30, 391 (1969).
(1)
HEES,
(8)
HARTMA N,
(') LE PECQ,
J. B., & C-
PACIL ETTI.
(195~).
Anal. Diochm1, 17, 100 (1966).
( 1 0)
LA ROQUE,
( 11 )
SCIIMIDT, N. A., & R.
( 12 )
AuCHÉ, A. Compt. Rend. Soc. Bio/., 64, 297 (1908).
( 13 )
DBÉRÉ, C. A rc/1. lnt rrn. PharmocO<Jyn., 38. 131 (1930).
H., ]. DILLF.Y, & G. SJIARP. C/in . !{es .. 17, 536 (1969).
J. H . ScHOLTIS. C/in. Chim. Acta, 10. 571 (19(,4).
(l') Roni, M. Clin. Chim . Acta. 17, 487 (1967).
(l~) DBÉRÉ , C. Lo Fluoresccnrt• en Biocl•imie, Prc.•c, uni,·cr;;itaice; de France, Paris 193~ .
p. 208.
1
(1 ) MoRRJSO!'i, G. R. Ano/. Chem., 37, 1124 (1965).
( 17 )
FREYTAG,
11 . Z. Ano/. Chrm .. 139, 263 (1953).
.4 >llt. Il t. Suver . Sanità (1971) 7, 109-207
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
ROTH
1
( •)
Ronr,
207
M. & ]. RtEDER. Anal. Chim. A cta, 27, 20 (1962).
1
(' ) IIUBMANN,
20
) ROTU, M.
B., D.
MONNIER &
M.
ROTH.
Clin. Chim. Acta, 25, 161 (1969).
Adaptation non publiée de la méthode colorim~lrique de Dunsbacb, F ..
Z. Klin. Ch em., 4, 262 (1966).
(
21
) S TONE, M. C. & J. M. TnORP. Oin. Chim. A cta, 14, 812 ( 1966).
2
(2 ) S T URZENECC ER, V. & E. R. FROESCH . Schu:ei:. M€d. Wochmschr.,
(
98, 923 (1968).
23
( ) A LBERS,
e•) ROTB,
R. W . & O. H. LOWRY. Anal. Chem., 27, 1829 (1955).
.M. Clin. Chim. Acta, 9, 448 (1964).
(2.1) RoTB, 1\f. Clin. Chim. A cta, 8, 574 (1963).
(2
8
)
7
(2
)
ROTR, )f. W~&t-European Symposia on Clinical Chemistry . Vol. 4: En:ymf's in Clinicn/
Chemistry Elscvier , Amsterdam 1964.
ELEVITCir, F. R., S. B.
Pot/101., 46, 692 (1966).
ARONSON,
T. V.
FEICHTMEIB
& ~1. L. ENTI::RLINE. Am. ]. Clin.
(2~) l\foss, D. W. 7th l ntern. Congr . Ciin. Chem. GenevuJEvian 1969; Vol. l, p. 53, Knrger,
Ufdc, 1970.
(2fi)
HODINSON,
D. , R. G. PnrcE & N. DANCE. Biochem ]., 102, 525 (1967).
A nn. lat. Su v e r. Sanità 11971) 7. 199- 207
Fondamenti teorici e tecnici dei metodi radioirumunologici
m biochimica clinica
U. HOS.\ e L. DONATO
Centro Rircrclre Nucleari di Sal!,ggiii c Laboratorio di Fisiologi11 Clinica del CNH, Pioa , ltaliu
Parullclamcntt· al progresso S!'ientifi co t• tecnolugit·o s i è verificata uua
t endenza crescente all' applicaziont' delle nuove acquisizioni nel campo d('lla
chimica " tlella fi sica ai pruhlemì della riccr<·a e dell'assistenza medica. Tali
applicazioni costitui!òcono una garanzia Ji progrcs&u nell a compren!iiorw
dei fenomeni biologici, nella preve nzione (' nella diagnosi delle mala lli<· •·
nello sviluppo di un sislcmu piit efficace di a ssist enza medica.
Uno degli eventi più signili•·ati\'i nella storia dell'endocriu ologia in l[IH'i'IÌ
ultimi dicci anui è s tato lo S\-iluppo d i una nuova serie di mNodi microa ualitici, fondati sull' impiego dei traecianti radioattivi, destinai i al dosaggio
di composti di grande importanza biologi ca nel sangu<' c nei t essuti. Quc•,.tl·
t ecniche nascono dalla combinazione- di mt•todologil· r adiochimic·he con altr('
sviluppa t€' per lo Rt udio di interazioni del tipo proteina-prot cina o IH o t t'inamolccolc organiche. Es1>c traggono partito dall'es trema scnsiLilitù del!<- misure di radioattività cht· consentt• di operan· ai livelli delle sub-minoeoucentrazioni cht· caratterizzano molt c delle sostanzt·. come ormoni o vit amine , coutcrmtc nei t essu ti o nei fluidi biologici. P er conver.~:~o, l'ecce:r.ioualt·
capacità eli ric ouosccn~ specificamente det erminate s trutture molceolari che
caratterizza le intcrazioni in sistemi antigene-anticorpo, protein a v ettricf'compos to trasportato, enzima-suhstrato può esser e utilizzata per impegnare
in reazi<mi sell'llivc alcuni dci piìt importanti cos tituenti plal"matir.i, s enza
n ccclòs it~t di preYcntiva separaziom·. L'utilizzazione contemporan ea di qucstC'
due proprietà permette di sviluppare m etodi analitid che in t ermini di st ;~ ­
sibilitil, s pecilirit;'t c pre<:.isione sono eli gran ltmga pii:t validi dt·i cla;:,.,it'i
procedimenti di dosaggio biolo{!it·o.
«Analisi per ~ attua zion e» è il tl'rmiu<· origiualment c couiato da Ek111"'
3
(1" ) prr definire quC"stv t ipo tli dosaggio , fondato, come vedremo, ;,ulla
progrPSbÌ\ a sattLrazion t• di un reage nte spl'eifico da parte d t'l composto di
cui , j desidera mi;,urare la conccntrazion•··
A nn. I st. Suve-r. Sanit4 (1971 ) 1,
208 -~2:!
..
209
Ques to tipo di analisi ha ricevuto denominazioni diverse, in genere r iferite alla natura della proteina utilizzata come reattivo s pecifico: <losaggio
radioimmunologico, quando s i utilizzi un anticorpo sp ecifico; dosaggio r a diosterico, quando proteine v ettr ici di origine plasmatica vengano utilizzate
per il doRaggio degli steroidi; dosaggio radioeuzimatico, quando s i utilizzi
un determinato enzima pe r dosare lm suo sp ecifico s ubstrato.
La dcfinir.ionc del m c totlo di dosaggio radioimmunologico è implicita
nella s ua etimologia: si tratta infatti eli un m e todo in cui un tracciante radioattivo (antigene marcato) flmge da indicatore c un anticorpo specifico
da r eagente. La metodologia ovviamente include la separ azione dell' ormone
libero dal complesso antigene-anticorpo (Schema l). Si può s ubito notare
l'hc la sensibilità analitica è garant ita dalla misura di attività, eli per sè
Ag
~
AN TI CORPO
IN SATURAZIONE
( Ag-Ab)
incu bazione
/
Ag
*
Ab
{
*
Ag-Ab
Ag
Ag
*
SEPARAZIONE
E MISUR A DELL A RAD IOATT IVITÀ
l
:lE L CO MPLESSO
l Ag·Ab )
*
ScHDIA L -
+
+
\
DELL'ORMO NE LI BERO
Ag .
Schema dcll'annli, i per -ntur:uionc applicata al tlo,ag;,;io
nulioimmunologico d E'gli ormoni.
estremamente sensibil<·, e la specificità della r ea;~,ion c dall' utilizzazione di
anticorpi s pecificamente indotti in vivo da lla somminis tra:.~ ionc dell'ormone
da d eterminare.
P er chiarire il m cceanismo drl dosaggio r adioimmtmologico possiamo·
far riferimento a un modello approssimato, come quello ehe segue. ~Icttendo
a eontatto una quantità limitata di anticorpo s pecifico e una quantità di ormone marcato, quest ' ultimo occupa alcuni siti dell'anticorpo: aggiungrndo
({ Uanti tà progrf'~l' ivamc nt c cr escenti lli urmonl' non marcato. che eompdP
pt•r gli stess i siti dell'anticorpo, possiamo immaginare che i s iti disponibili
~ i ,-urla no via via :.aturando di ormone non ma rca to, fi ssando corrispond en!(•mcntc sempre meno ormonr marcato. Si può cioè parlare di spos lamentiJ
dell'o rmone marcato da parte di quello non marl'ato ovn' ru di tlihùzion c
4nn. l •t. Suvcr . .Sunitù (1971 ) 7, :!O'l-~~2
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"210
RELAZIONI
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isotopica della radioattività . Aggiungendo a quantità uguali di anticorpo
quantità crescenti di ormone inattivo c quantità cos tanti di ormone marcato
si stabilisce dunque un sistema di dosaggio che va dalla situazione di presenza
di solo ormone marcato a quella di saturazione con ormone inattivo. In questo
sistema la quantità di ormone non marcato aggiunto è inversamente proporzionale alla radioattività del complesso antigene-anticorpo, o direttamente
proporzionale all'attività liberata. Si costruisce cosl una curva standard di
taratura su cui per interpolazione s i stabiliscono le concentrazioni incognite
dell'ormone nei campioni.
Come si è anticipato, questo modello pecca di una eccessiva approssimazione, in particolare quando s i ammette che i) sistema fWlzioni in condizioni
di saturazione: il meccanismo di r eazione può essere più soddisfacentemente
rappresentato da un equilibrio regolato dalla legge di azione di massa. In
realtà, n ell'ambito delle concentrazioni che ci interessano, un dosaggio in condizioni di vera saturazione, quando cioè l'equilibrio è tutto spostato n el senso
d ella formazione del complesso antigene-anticorpo, e il complesso resta a
concentrazione costante per successive aggiunte di antigene, è da considerarsi un caso limite. La risposta, cioè la variaz1one di attività n ella fase mi.surata, è puramente e s emplicemente l'effetto della diluizione isotopica del
tracciante. U n tale modello porta a sovraestimare la sensibilità c la precisione
analitica, entrambe legate alla pendenza della curva standard. In r ealtà, la
.situazione sperimentale è meglio descritta t euendo conto ch e ad ogni aumento
della concentrazione di antigene corrisponde un aumento della concentra·
zi6nc del complesso, secondo la legge dell' azione di massa: quindi la pendenza
della curva è minore, per il fatto ch e l'ormone marcato c l'ormone inattivo
si dis tribuiscono fra la fase libera e la fa se l egata al complesso a concentrazione via via cr escente.
Per una descrizione ancora più esauriente del sist ema, s i deve considerare
la possibilità di equilibri multipli esistenti in soluzione:
{l)
H
{2)
H• + A-H*A
(3)
H
(4)
h
+ A - · HA
+ C --. HC
1- A - · hA
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fil A/
= K (per antigene inattivo, standard e
JH/ JA/
e ndogeno)
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/H* A/ = K • (per antigene marcato)
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,IH*//A/
fHC/
/ H //C,'
/hA/
/h/fAI
= Kc (interferenze aspecifiche)
l
l
= Kh (reazioni crocia te)
~ove H = ormone; H* = ormone marcato; h = ormone di specie diversa;
.A = anticorpo; C = sostanza interferente.
A nn. lat. Super. Sanità (1971) 7, 2o&-222
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211
ROSA E DONATO
Non possiamo escluder e infatti una variazione delle proprietà immuno·
logiche dell'antigene indotta dalla marcatura che dia origine a un equilibrio
coll'anticorpo definito da una diversa costante di associazione rispetto a quella
d ell'antigene inattivo, s tandard o endogeno (casi (l ) e (2)); nè trascurare
la presenza di agenti competitivi nel campione d i plasma, o qualsiasi altro
tipo di reazione o adsorbimento competitivo (caso (3)), o, infine, la possibilità di r eazioni crociate con altre sost anze quali ormoni di altro tipo (caso
(4) ), Alcune considerazioni possono derivar e dalla precedente r appresenta·
zione elementare su base pura m ente intuitiva.
L'ormone marcato dev'esser e r hiaramentc a concentrazione molto piccola , p er essere considerato semplicemente come un tracciante che quantizzi
la djstribuzione dell'ormone fra la forma libera e la forma legata all'anticorpo,
e per fornire una sensibilità eleva ta - cioè una risposta n etta a piccoli incrementi di concentrazione di antigene inattivo dal valore zero della ('ur va
(corrispondente alla presenza di solo ormone marcato). Data la nece sità
eli non pr<"giudicare la misura della radioattività con una s tatis tica di cont eggio troppo sca rsa, ne risulta l'esigenza di utilizzare ormoni marcati ad
a l ta atti\'ità specifica. Le proprietà immunologiche dell'ormone marcato
(cioè la capacità di reagire con l' anticorpo) devono essere conservate: a
quc·s to proposito tuttavia va notato che una cer ta riduzione dell'affinità
p1•r l'anticorpo, in seguito alla marcatura, in certi casi particolari può costit uire un miglior amento della s ensibilità, in q uant o che, s e l'an tigen e mar·
cato compe te m eno per i s iti dell' anticorpo, e cioè n e è spostato piìì. facilmcmte, la risposta fornita a piccoli incr ementi di antigene inattivo è piìt
netta. P er evitare pesanti inter fer enze da parte di reazioni competitive le
costanti di equilibrio ùel tipo Kc e Kh devono esser e piccole rispetto a
(1uella che definisce l'equilibrio ddla r eazione antigene-anticorpo. Questa
ultima, cioè, deve essere pr eferen zialment e molto alta per garantire la
;: peeifìcità, la sensibilità e la precisione del saggio; poichè la K di associazione de l complesso dipende dalla qualità dell'anticorpo, ne deriva l'impor·
tanza della selezione di un buon anticorpo. Sem brs inoltre intuitivamentc
<'viùcnte che le concentrazioni di anticorpo debbono esser e basse, per evitare
nn 'assenza di rispos ta nella prima parte della cur va (in corrispondenza a ll' intervallo pM cui tutto l' a ntigene viene )('gato), c per aumentare la risposta
a piccole v ariazioni di antige ne: è quindi cun venicnte ·utilizzare una soluzion e
diluit a 1li ant icorpo. N aturalmente va notato che in ogni caso si deve t ener
presente la precisione della misura effettivamente collega t a a ll(' rondizioni
;.; perimen tali. Al di là di ogni considerazione t eorica, per esempio, non con,·crrà mai lavorare in condizioni di diluizione di a nticorpo corris pondenti
a lla formazione di una quantità troppo picrola di complesso, poichè in questo
enso la precisione del saggio è compromessa dalla possibilità di contamina·
zione della frazione legata da parte di quella libera o dalla variazione troppo
Bl·arsa dl"ll'attività rh·lla frazion e libl' ra.
A1111.
/ st. Suvr r. Sanitd 11971) 7 ,~08222
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212
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IIELAZIONJ
Ricordiamo inJine che il sistema esistente nella soluzione è ulteriormente
complicato dalla et erogeneità degli anticorpi, che possiedono Riti di,•crsamente reattivi, definiti da differenti K di associazione con l'antigene.
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PROBLEMI METODOLOGICl
I criteri di scelta e di valutazione di ogni m e todo microanalitico sono
basati sul livello di sensibilità, precisione e esattezza che t ale metodo puù
fornire (in relazione aH'intervallo di concentrazione della sostanza da dosare')
nonchè sulla semplicità operativa. Ricordiamo a questo proposito ch e la sens ibilità è definita dalla minima quantità di sostanza ch e produce una risposta
sicuramente (signifìcativa.mente) distinguibile dallo zero, tenendo conto del
«bianco» e della precisione della sua stima; la precisione d c fini~<ce l'entità dell'errore statis tico della misura e può essere valutata analizzando la variazione delle misure replicate: l'esattezza è legata nll'errore sistematico , e ptHÌ
essere valutata mediante prove di r ecupero (aggiungendo quantità <'rescenti
di sostanza), o dal confronto con altri metodi indipendenti, se esis tono.
P er quanto detto precedentemente, ris ulterà chiaro che per il dosaggio
ormona.le il m etodo radioimmunologico r appresenta il m etodo di scelta, soddisfacendo sicuramente meglio ai r equisiti definiti sopra che non altre tecniche utilizzabili. Basti pensare a questo p roposit o alle incertezze legate ai
saggi biologici, per cui alla difficohà di una standardizzazione obbiettiva del
«reagent e» biologico si unisce la variabilità individuale d ella risposta. Anche
per il dosaggio p er via chimica di altri ormoni, come ad esempio la flu orimetria p er gli st er oidi, la complessità operativa, la scarsa s ensibilità c gli
alti livelli del «bianco» costituiscono altrettanti fattori limitanti.
Tuttavia va sottolineato che anche nel caso della radioimmunologia la
qualità del saggio dipende dalla scelta c dalla ottinùzzazione delle condizioni
sperimentali. È quindi necessario car a tterizzare preliminarmente l'anticor po
e l'antigene marcato c scegliere le condizioni ottimali di diluizione.
11 saggio viene poi eseguito secondo uno schem a operativo generale, che
include l'aggiunta dell'anticorpo e dell'antigene marcato all' antigen e inattivo
(standard c campioni), l'incubazione, la separazione attività libera-attività
legata e il conteggio di una o entrambe le frazioni.
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Anticorpo: tito/azione e caratterizzazione
Il titolo anticorpale è la concentrazione dell' anticorpo n el siero dell' animale immunizzato, misurata r elativamente a una quantità piccola e costante
di antigene fissata dallo sperimentatorc. Sperimentalmente si procede facendo reagire concentrazioni via via decrescenti di anticorpo con una
doae fissa di antigene marcato, e valutando la corrispondente frazione di attività legata al complesso. Per le ragioni già viste conviene utilizzare una
d nn . l at . S u DeT . Sanità (1971) 7,
20S...22~
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213
ROSA E DONATO
diluizione corrispondente a un Co = 50 %, se questo è compatibile con la
sensibilità e la precisione del saggio: va infatti notato che il titolo anticorpale
di per sè non fornisce indicazioni sulla affinità con l'antigene, dipendente dalla
costante K dei siti. Un buon anticorpo cioè deve certamente possedere un
alto titolo, se non altro per ragioni di risparmio di reagente, ma specialmente
deve avere una grande affinità coll'antigene. Le curve di diluizione di un an·
tisiero possono già fornire un' indicazione su questa affinità, potendosi in prima approssimazione considerare curve di titolazione di un reagente con un
altro (la risposta di un sistema concentrazione fissa di antigene-concentrazione decrescente di anticorpo corrisponde approssimativamente a quella
del sist ema concentrazione costante di anticorpo-concentrazione crescente
di antigen e, quale è utilizzato per il saggio); la K del sistema sarà tanto più
alta quanto più grande è la pendenza della curva di diluizione in corrispondenza del flesso, e comunque la diluizione scelta deve trovarsi nella zona
di massima r isposta (cioè nel flesso) per otten ere la migliore sensibilità.
Come esempio, nella Fig. l, sono riportate le curve di diluizione di diver si antisicr i (anti ormone della cr escita) di questi l'antisiero A ha un
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HOH S ·21
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oaui1iont d t U'ontis.it ro
r-- - --1
1/1S . .
Fig. l. - Curve di dilumone di tre
antisieri anti ormone della
crescita (anti HGH ). In
ascissa, la diluizione dell' antisiero. In or dinata, la
quantità relativa di or mone marcato legata dall'ant isiero, espressa come rapporto tra la radioattività
legata (B) e quella t otale
(B +F).
tit()lo alto e una buona affinità, il B un titolo minore ma una affinità p1u
grande, mentre C rappresenta un anticorpo di cattiva qualità, possedendo
un basso titolo e una scarsa affinità.
A ntigene marcato: controllo e scelta della concentrazione
È ovvia la necessità di un controllo sull'ormone marcato per evitare
i rischi derivanti dalla instabilità del composto (autoradiolisi ecc.): va comun·
que notato ch e un certo livello di degradazione può essere tollerato quando
si traduca in un semplice spostamento della curva, come n el caso della presenza di ioduro o piccoli frammenti di dem olizione (che arricchiscono solo
la frazione di ormone libero) quando venga contata la frazione legata.
La quantità di tracciante deve essere minima, come già accennato. Tuttavia un compromesso fra sensibilità e velocità di conteggio pu ò esser e fatto
sulla base di una esperienza preliminare ch e stabilisca l'andamento della curva
A. nn . Iet. Suver. Sanità (1971) 7, 208-222
214
1\.ELAZ 10:-11
di taratura p er diverse quantità iniziali di ormone marcato (H 0 ). Si costruisce cioè una curva valutando le variazioni della quota legata (B) per crescenti
concentrazioni di ormone marcato, di cui è nota l'attività sp ecifica, e si ricavano quindi le curve di taratura corrispondenti ai diversi Ho che permettono di valutare la perdita di sensibilità (pendenza della curva) , corrispondente
Fig. 2. - Quantità di augiotcnsina Il marcata (Angiotensina (I l)- 1 ~ l ) legata da
una quantità costante di
anti.siero, in funzione della concentrazione dell'ormone nella miscela di
reazione.
""
Fig. 3. -
...
r,,J
Cur ve di taratura ottenute impiegando
lo stesso auti.siero e due quantità iniziali
diverse di angiotensina Il marcata. Nel
caso in cui si impiegano 30 pg di ormone
marcato, la velocità di conteggio è sei
volte maggiore, ma diminuisce la sensibilità del metodo.
6 Angiotensina
O Angiotensina
IO ~·
•"'•~•'•"''"• •tt+-'"'"'
(II)- 1 ~
(11)- 1 ~
f, 5 pg;
J, 30 pg.
lO
ad un adegua to aumento della velocità di conteggio. Naturalmente non
viene considerata la possibile differenza di immunoreattivitù de1la specie
inattiva. Nelle F ig. 2 e 3 viene esemplificato il procedimento, in un caso
di determinazione di angiotensina II .
Procediment o analitico
l) Incubazion e.
Dopo l'aggiunta dell'anticorpo all'antigene, la soluzione è incuhat a a
bassa t emper atura (4 °C) per un tempo possibilmente sufficiente al raggiungimento dell'equilibrio; lo studio della cinetica della r eazion e è n ecessario
&nn. lat. Super . Sanità (1971) 1, 208-222
ROSA E DONATO
21S
.
p er definire il valor e ptu conveniente della durata dell'incubazione (Fig. 4). In gener e, p er
evidenti m otivi, si sceglie un
p eriodo di incubazione inferiore
a quello occorrente per assicur are il raggiungimento delloequilibrio n ei primi punti della
curva .
••
Il non lavorare in condizioni ùi equilibrio p; r tutti 1
Fig. 4. - Andamento d ella reazione tr a l'angiot enpunti della curva porta ad un
sina II ed un anticorpo specifico, in funappiattimento
della s t essa con
zione della concentrazione dell'ormone
nella miscela di r eazione. In ascissa, il
conseguente perdita di s ensitempo di incubazione; in ordinata, la
bilità (Fig. 5). D'altra parte
quantità relativa di ormone legato espresil tempo di incubazione deve·
sa come rapporto trn la radioattività leesser e contenuto in limiti r agiogata all'anticorpo (B) e la radioattività
totale (B + F).
nevoli, per cui è spesso necessario un compromesso fra perdita
di sensibilità e durata del dosaggio. Sempre nel caso della Fig. 5, p er
esempio, l' aumentata sensibilità della curva al punto di equilibrio non
compensa l'aumento del t empo di incubazione, che pertan to è stato limitato a 40 or e. Il tempo di
raggiungimento dell'equilibrio
potrebbe essere notevolmente
ridotto aumentando la temperatura di incubazione: tutta via,
salvo casi particolari (es. incubazione a 37° C per il dosaggio
dell'ormone della crescita), la
perdita di sensibilità sa r ebbe
troppo forte data la r elazione
inversa che lega la K di asAngiohnsino agoiun ta ( pgJ
sociazione col quadrato della
Fig. 5. - Due curve di taratura per l'augiotensina Il
temperatura.
ottenute a tempi diversi di incubazione.
...
-s-
..
2) Separazio"e attività libera - attività legata.
Esis tono numerose t ecniche di separazione che elenchiamo:
a) Temiche elettroforetiche. - Molte varianti sono s tate utilizzate
(es. elettroforesi su carta, s u gel di poliacrilammide, su gel di amido); fra
ques te ha una certa rilevanza, quantomeno s torica, la cromatoelettroforesi~
A. nn. l •t. Suv eT. Sanità (1971) 7, 2~-~2-2
REC.AZIOXI
(1) ch e sfrutta la capacità dell a ccllulo a di atborbirc gli ormoni liberi puri:
r ormou c legato all'anticorpo, acqui;. t ami o lt• propri ctù elettrofor etiche del! t•
y-globuline, migra c viene separato. l't·r (';;altare la separazione, il processo
'iene effettuato a vasehet t a aprrl" provocando un flu sso idrodinamico. l
limiti dd metodo sono dati dalla diflicoltù di s q Htrarc ut:ttarnente alcuni
ormoni a caratteristich e elrttroforNidw non adatte (gonadotropina corioni<'a
umana (JICG), ormone tircotropo (TSII ), n u ~iotc n ;,ina), c dall'esigenza dì
llt.ilizzarc volumi di soluzione molto piccoli, con l'OH ~->eguc ut c :riduzione della
\ C'lorità di conteggio o nrcl'S!'Ìlù di imp iegar~• ormoni rnarrati ad altis;,ima
a t LÌ\ it:t .:.pcd.Gca.
b) Tecniche di preczpztazionf. - Fra l1· varie possibilit~t (precipil azwue per salatura, con etanolo, con dio sano) ha p articolare importanza.
anche attualmente, il m etodo del doppio antit·orpo (5): alla soluzione inr ubat a viene addizionato un secondo a nticorpo (anti y-globu lina) che pr ecipit a
il complcsEo antigene-anticorpo c il precipitato viene separato dal surnatan t1·
mediante centrifugazione o filtrazione su m embrane (es. Oxoid) e sottoposto
a conteggio . L 'anti-antisiero viene prodotto immunizzando un animale Ji
~pecie diversa contro y-globulinc analoghe dell' anlisicro specifico: fissato
il t itolo del primo anticorpo in presenza di un eccesso di anti-antisiero.
qm·1'l 'ultimo Yicnc caratterizzato a sua volta mediante una curva di diluizione. Il vantaggio pr incipale di I}Uesto m etodo è rappresentato dalla grand1·
s pecificità garantila dalla seconda r eazione imm unologica, che elimina le interf,•rcnzc a;;pccifiche dei prodotti di d egrad azione; per contro il metodo
richiede un tempo di incuhazionc supplementare che prolunga notcvolmcntl'
la durala del saggio c, nel caso delln fi ltrazione, una manualità pii:t delicata.
c) T ecniche di adsorbimento. - Le molecole r elativamente piccol1·.
l}uali gli ormoni non legati, possono p enetrare liberamente in numerosi adsorbenti insolubili, cd essen ·i fi ssati. <pJUnli tativamcnte. La decantazione o la
centrifugazione del material e insolubil e permette di separare la frazione di
ormone legato aU'anticorpo. Fra i div<•rsi materiali utilizzati si possono
ricordare alcuni silicati (es. T erra di follone, Florisil, talco, Quso G-32),
r esine a scambio anioni co (es. Amberlitr), cellulosa, carbone attivo ricoperto
da destrano (quest'ult imo per ridurre il diametro dei pori c limita r i'
r adsorbimento a determinate specie molc<·ola ri).
Il principale vantaggio di questi m et odi è rappr esentato dalla rapiditù
d clrcsecuzione; per contro sono da cons iderarsi svant aggi, rispetto al m etodo
d el doppio anticorpo, la perdita di sensibilità dovuta a d una certa competizione dell' adsorbente n ell'equilibrio antigene libero-antigene legato (p er la
legge di aziòne di massa, tale intcrazionc è pitl sensibile per alte concentrazioni
di ormone legato e causa quindi un appiattimento della curva), nonchè la mi.111 " · l t t. Suvrr. Sanità (1971) 7, ~OS-222
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IIOSA E DONATO
217
nore esattezza dovuta al fatto che i prodotti di degradazione dell' antigene
marcato possono essere contati con la frazione libera e con quella legata (pic·
coli e grandi frammenti rispettivamente).
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d) Tecniche in fase solida. - L'anticorpo può essere adsorbito irre·
versibilmente su un supporto solido costituito da un materiale plastico di diversa natura (polipropilene, polistirene) o da altri polimeri (es. derivati di
gel di destrano); la fase solida può essere aggiunta alla soluzione sotto forma
,
di polvere o di dischi, o può essere costituita dalle pareti stesse del tubo da
saggio.
Il principale vantaggio di utilizzare un equilibrio eterogeneo è dato
dal fatto che in fase solida l 'equilibrio è più spostato nel senso del legame.
Inoltre la separazione della frazione libera da quella legata è estremamente
semplice (decantazione e lavaggio).
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3) Contegsio.
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Le t ecniche di conteggio sono naturalmente quelle correntemente usate
nella pratica radiochimica (scintillatore p er sostanze y emittenti, scintilla·
zione in fase liquida per X o {J emittenti)' Dal punto di vista della precisione
sarebbe conveniente misurare entrambe le frazioni dell'attività: praticamente s i è visto ch e in alcuni casi la misura della frazione di antigene libero
può introdurre un errore più grande (caso del doppio anticorpo), e in altri
casi è accettabile il conteggio della sola frazione di legato per semplicità ope·
r ativa (es. p er evitare possibili contaminazioni, si può contare un'aliquota
del surnatante).
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4) Costruzione della curva standard.
I dati del conteggio vengono utilizzati per costruire la curva standard.
N aturalmente sarà cura dello sperimentatore programmare il saggio in modo
da ottenere una sensibilità adeguata nell'intervallo di interesse, stabilendo
il numero dei punti di taratura e d ei replicati. In gene rale comunque va ricordato che, potendosi scegliere tra il conteggio della frazione legata e quello
della libera, dal punto di vista della sensibilità convien e utilizzare la frazione
m eno attiva (maggiore pendenza della curva), mentre da quello della pre·
cisione convien e misurare la frazione più attiva (minore rischio di contamina·
zione da parte dell'altra frazione) .
La curva di taratura può essere espressa con dive rsi sistemi di coordinate: in ascissa il p eso di or mone aggiunto, o le unità biologiche corrispon·
denti (o il loro logaritmo), in ordinata il conteggio di una delle due frazioni,
..t nn. Ist. Suvsr. Sanità (1971 ) 7, 20e-222
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IIEUZJil:'\J
o
r apporti di conteggio B ·B + F , F 1B - F. F 'B, B /B0 , F !F 0 , don B
rappresenta Ja frazione legata, F quella libera e Bo c Fn le slcss<' fra zioni relative alla pre,.,cnza dd solo antigent m a rcato (zero della curva}.
1CO
~ 901
oJ~
IO
Fig. 6. -
Curva stnudard per il dosaggio dt'll'or·
mone della cre.cita (HGH) secondo il
metodo del doppio anticorpo. In a,cissa, la quantità di orruon e e,rn·•-a in
nunugrammi; in ordinnta, In quan titi•
di ormone radioattivo legata nll'auti·
corpo (C), esprc;sa in percr ntualt· rispcllo a quella misurata in a-;scuza di
ormoni staudard (Co).
10 ..
HGH •ggiunto (n':!!)
NelJo Schem a 2 viene riportata Ja sequenza delle operazioni che occorrono in un dosaggio radioimmunologico, m entre la Fig. 6 rappresenta la eun·a
di taratura ottenuta n ei nostri laboratori utilizzando un m etodo giù standar·
dizzato p er il dosaggio dclf ormone dc Ha crescita.
<D
l ADDIZIONE REATTIVI -~ l
VOlUMI VARIABili
(0,1 ·0,5 mi)
INCUBAZIONE
l -~ l
DURATA VARIABILE
(3·8 l ore)
SEPARAZIONE
l ~ LCONTEGGIO
MICROFilTRAZIONE
oppure
CENTRIFUGAZIONE
oppure
CURVA DI TARATURA
(1 oro)
+
5 min per campione
ESTRAZIONE SUPPORTO
SOliDO
SCHE)IA 2. -
Sequenza d elle operazioni in un dosnggio radioimmunologico.
PRODLDU RELAT1V1 AL DOSA GGIO RADIOUD1UNOLOGICO
Non è qui possibile riportare una discussione approfondita su questo
soggetto; verranno solo accennati alcm1i ùti problemi piì:t r ilevanti riguardo
alla specificità del dosaggio.
.11111. Ii! .
Suoer. Sanì td (1971} 7, 208-22:!
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ROSA E DONATO
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Come si è detto in precedenza, condizioni fondamentali p er la validità
del dosaggio sono: che l'ormone endogeno e quello standard reagiscano con
l'anticorpo in modo identico, che le sostanze presenti nel plasma non influenzino il dosaggio o che tale influenza venga controllata. L'identica r eattività
tra l' ormone standard e quello endogeno rappresenta una condizione essenziale solo n ei casi in cui si desideri una misura assoluta della concentrazione
plasmatica. Differenze n el comportamento dell'ormone standard da quello
endogeno, s~ attribuibili a diver se cause. In alcuni casi, mancando dell'ormone della steaÌJa specie di quello che si intende misurare, si utilizzano ormoni
di spP-cie diversa. In tal caso, è n ecessario controllare molto accuratamente
l'identità immunologica per ogni, nuovo antisiero, poichè è stato provato
che alcuni antisieri riescono a distinguer e differenze in immunoreattività
anche tra ormoni che,' pur appartenendo a sp ecie diverse, hanno la stessa sequenza di amminoacidi.
Alterazioni dell'ormone standard duran t e il processo di isolamento e
purificazione, possono rappresentare un altro motivo di differenze nella immunoreattività .
La maggiore difficoltà che si incontra nell' assicurare la specificità del dosaggio, è in realtà dovuta alla presenza n el plasma di polipeptidi ormonali
di struttura vicina a quella dell'ormone da dosare e che danno r eazioni cro·
ciate con l' antisiero, o di cataboliti dell' ormone stesso che mantengono pro·
prietà antigeniche. Il primo tipo di effetto si può riscontrare nei sistemi proinsulina-insulina, glucagone pancreatico-principio glucagone-simile, ormone
luteinizzante (LH) e ormon e follicolo-stimolante (FSH).
Il risultato del dosaggio può ancora essere influenzato da altri fattori.
Tra questi, quello da tenere maggiormente sotto controllo è la demolizione
dell' ormone marcato durante l'incubazione, ad opera di enzimi proteolitici.
Alcuni ormoni, come ormone adrenocorticotropo (ACTH), tirocalcitonina e
glucagone devono essere protetti dalla demolizione enzimatica m ediante
opport uni inihitori.
In conclusione, lo sviluppo del procedimento di dosaggio di un det er minato ormone richiede un accurato controllo dei reagenti, l'ormone marcato, l'ormone standard e l'antisiero, oltre ad una minuziosa verifica delle
variabili di r eazion e.
Una volta verificato che l e condizioni da cui di pende la validità del dosaggio siano soddisfatte, il metodo può essere con tranquillità utilizzato
correntemente almeno fino a quando non si renda n ecessario il rinnovo dei
reattivi. Va ricordato come ogni dosaggio impegni microquantità di st andard
e di· antisiero. Poichè l mi di antisiero può far fronte a un gran numero di
determinazioni (da 100.000 a qualche milione), pochi milligrammi di stan·
dard e qualche millilitro di antisiero bast ano a soddisfare le necessità di un
laboratorio per molti anni.
A nn. lat. StUlBT. Sa nit4 {1971) 7, 20S-222
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L'_\.1\"AI.lSI l'EH SATUH \ ZlO~E 1'\E U .. \ CHDilC.\. CT.I:\ 1\.A
Vi ;.ono ali ualmPnll· poch i C S ~'lllJii di d o::,agg i per s aturaziou• · eh •·
abbiano tronl lo una po,;izione precisa tra i t <'S l dinici di routinc. i\'lt·nlrt·
il te~ l di ca ptaziorl4' della triiodotiro;.ina ( T~ ) cd il d o"'al!g:io ddla t e l raindotiro:;ina (T 4) ci rcolanln, la cui imp ort nnza diagno>"tit•a è univer;;alrnt·ntt•
ri('onol'ciuta- vengon o utilizzati correntt·mente in m olti laboratori clinici.
p er la maggior parte i dosaggi radio immun olo~ ic i mant e n~ono il caratter e
eli mrtodi an:tlitici avanzati, risrrYati ai lahorutori di r icerca. Conw :-i ì·
Jcllu in pn·ct·Jl'uza. sia il Jo:>a ggio r adioimnnmolog ico dw, in gen er e, gli
altri dosaggi }Wl' satura:t.ione, non si } HJ:o.~ on o consider an· mrtotli annlitir i
d efinitiva mente sviluppati: oetOt'1't' progr(·din• n d lo svilupp o di nuo,·e tt·cniclw di :>ep araziorw l ' n ella prcparazionr di r eatti' i standardizzati prima ch e
qut·:sto formidabil e strum Pnt o analitico po;;;;a !'"'~e r r utilizzato twlla pra1 iea
eol'Te ntc dd laboratorio clinil'o.
È quin d i utile discutNc la ('\'entu ah· com t'rsion e dl·i dosaggi p rr saturazione, c in particolari' del dm,aggio rudioimm nnologi('o. in metod i pratici
<li labo.ratorio. Tnle <'OllYersionr i~ infatti la nf'<'rssaria prrme~sa a lfapplicazione su larga scala di 1ali m et odi n ella pratica corrente dd laboratorio o~p c ­
tl aliero.
Vien e in gen er(' am m <•sso che un procrdimento ana litiro, per poter c~s en·
consideralo un metodo clin ico di routiuc di generale u tilizzazion e. dd)ba
aver raggiunto lo stadio d ella massima s emplicità, possa c~ scr e r eali7.:t.ato
mediante apparccchiaturc serniautomatiche o automatich e- faecia H"o di
rcattivi standardizzati e fornisca risultati suscrt tibili d i esser!' da b or ati con
la massima accuratezza t' nel ll•mpo piLt breve possihilt·.
In r ealtù solo da quando si dispon e d ella tecnica dci r ea ttiYi fi ssati ai tubi
da incuhaziunr e di simili m et odich e in «fase l'olida » è possibil1• p ensa re ai
metodi radioimmunologi!'i Ìl1 trrmini di ::<empliciu't operativa c di automaziotH'. II grande int eresse d elle tecnich e in fase ~olida i· quello di non ri<·hicd r re tr asferimenti del eampinnt' o procl'dim f•nti di separazione, opPrn:t.iuni
che a ccrescono sia la comp lcssitit che il <'Os to d ell'automazione, dal m om rnto
clw il dosaggio aYvien e interauwnte n t·l tubo da incubaziorw cui t> fi ssata la
proteina ~ p('cifi ca.
E sist ono qttindi k condizioni prr intraprr ndt·r e Wl programma pianitirato e b en coordinato, Yolto nlrautomaziont' <il-i d o,.;aggi p t' r saturazione.
Ya t enuto present l ' ch e l!' basi 1eoriclw cl ... l mf'todo, in t ermini di scnsibilitù
c prccisionr , ed i problemi tecnici da risoh-er e, sono com wti, salYo difl'cren zr
di scarso rilieYo, a tutti i procerlirn('nti fondati su l principio drlr analis i p er
sa tura:.-.ione . La sequen za d ei p a ssaggi analitici è sempre la stessa, almeno
n ei casi 111 ctù la s p ecifi!'i t~L del n ·attivo ~ aturato s ia t ale da n on r ichieder e
operazioni di e~ tt·azionf' c purifì eazionP p rr il'olare cl a p ot enziali competiA nn. h t. Suoer. Sanitò C1971J 7,
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toasil\ composto da dosare. t in realtà diflìcile individuare oggi, nella
chimica clinica, un altr o campo in cui un programma « mirato» di
automazione apra la stradf al dosaggio di un numero altrettanto grande
di composti di cosi rilevante interesse biologico. Va aggiunto, sempre a
proposito di automazione, come un pregio non indifferente dell'analisi per
saturazione sia quello che le misure di radioattività si fondano su tecniche già
largamente automatizzate, per quanto riguarda sia il tr attamento dei cam·
pioni, sia l'elaborazione dei dati di uscita. ~ chiaro che, se i dosaggi per satu·
razione sono destinati ad un impiego su scala sempre più vasta, occorre trovare una soluzione al problema di rendere disponibili in forma standardizza·
ta i reattivi occorrenti. Nel caso di alcuni ormoni, come insulina, ormone
della crescita, ormone lattogeno placentare e angiotensina II, sono attuai·
mente disponibili sul mercato i reattivi adatti al dosaggio, standardizzati
sulla base di un procedimento operativo scelto dal produttore.
Molto è stato scritto circa l'attendibilità dei dosaggi che vengono ese·
guiti mediante i kits per il dosaggio radioimmunologico in laboratori ospe·
dalieri o indipendenti. Effettivamente vi sono casi in cui una verifica dei ri·
sultati ba dimostrato come l' utilizzazione dei reattivi « pronti», vada a sca·
pito della accuratezza e della oggettiva validità. Questo fenomeno non va
attribuito, in genere, alla qualità dei reattivi, ma riflette il fatto che l'impiego di procedimenti analitici avanzati come il dosaggio radioimmunolo·
gico richiede un bagaglio conoscitivo adeguato. L'adozione prematura di
queste tecniche si traduce in perdita di t empo e in spreco di materiale, se
manca la capacità di identificare le sorgenti di errore e di valutare critica·
mente il significato dei risultati.
Ria88un to. - La tecnica radioimmunologica di dosaggio degli ormoni
proteici ha preso origine dalla combinazione di tecniche radiochimiche (diluizione isotopica) e immunologiche. La tecnica è infatti fondata sulla competi·
zione tra l'antigene da dosare ed il suo analogo marcato nei confronti dell'an·
ticorpo specifico, quando questo sia presente in difetto rispetto alla quanti·
tà necessaria a legare tutto l'antigene presente. L'entità della competizione,
ovviamente correlabile alla concentrazione dell'antigene da dosare contenuto
nel campione, viene valutata all'equilibrio misurando la quota della radioat·
tività totale legata all'anticorpo oppure la quota ancora presente come anti·
gene libero.
La corretta utilizzazione del metodo richiede, oltre alla disponibilità
dei reattivi in forma pura, la conoscenza di alcuni aspetti delle tecniche mi·
crochimiche. L'importanza di questa metodologia risiede nella sp ecificità,
nella elevata sensibilità e nella possibilità che essa offre di eseguire simultaneamente l'analisi di larghe serie di campioni. La specificità dipende da quella
dell'anticorpo, utilizzato in questa tecnica come r eattivo di separazione. La
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lat. SU2l61'. Sanità (1971) 7, 208-222
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llf.l 11 11•:"\ 1
S('llSiiJiJitù è J(•gat U, tra r alt CO •. alle l'Olltlizioni in CUÌ YÌl' IH' mi"urala }a radioat ·
tiYit;'t e alla ~ tabilitù dell'ormone marcato. utilizzato in qu«>:- ta tt·eniea co·
m•· r catth·o di riconoscimelllO.
Gli Autori dopo ll\'er ùrscritt o i fomlamt'nti dt'lln tecnica di do:,aggio t'
i problemi r clati\ i alla pn·parazionc cd ali t· proprirtù dei n ·a t t i' i. ne discu·
t ono gli a sp r tti m etodologici piil signiftcati,·i r lr po, i'ibilit o'l di impiego nella
ricerca c ne lla diagnostica clinica.
Sununary (ThPm·Nirnl fllld terhnical basis of w dioilm11unuussuy in
dinical biochemi$try). - Tlw rudioimmunonssay for the drtcrmination
of proteic hormone;, originated from t he comltination of radiocbcmica l
(isotopic dilution) an d immunologica! t ('('bniquc;;. l n fa et, thi" method
is bascd on the <'OllijH'tition ht·twccu tbc antigt·n to be d el l'rmincd ami il '
labrlctl analog for thr spreifì c antibod). whcu th1• amouut of antibotl~
is not cnough to bind ali the antigen pr<·>'ent. The <·x tent of competitiou .
wbich, of course, dcpcnds on thc conce ntration in thc sample of tbt• antigcn
to b e dctermincd, is cvaluatrcl at st cad y state, m ea>-uring tb c amount of
total radioacth·ity bound to tbc antiliody. or the aruount of radioacti,·ity
s tili pn'Scnt in the form of free antigeu.
Tbc corn~ct u~c of thc m etbod r equirc!:i, h t•sides r cagcnts in pure form.
thc knowletlgc of somr aspect s of micr ochrmical tedmique:.;. The importam' t'
of tlùs mcthotl lie::; in its specilicit y, Ù1 its high sensitivity and in thc possi·
bili t y of ru11ning tbc an alysis of largc serie1- of sampl .-,. simultancousl).
Tbc sp eciftcity of thr m ethod depcnds on that of the antibody. which is used
as a reagcut for scparation. Thc :;:en sitivity drpPnds also on the dfìricnc~
of raùioactidty m casurem ents and on thc s tability of thr labrled hormotw.
which is uscd a;. a r cagcnt for r ceognition .
Aft•· r d c~cribing thr ba>H'l> of da c dosagl' t<•rhnique an d t be prohlcm"
connct:tcd to tlw preparation :111cl tlu• propntÌP>- of tbc r cagent,. , thl' Author,.
discuss thc more oignificant ml·thudolugil'al a;.pe<'l:- :llld the pn~s ibl c applications of tht· nwthod in clinica! r csearda aud diagnosis.
HIBLJOGH AF I..\
( 1)
EKI:'(S, R. 1'. C/in. Clrim. A cta , 5. 453 (1960).
e)
DIIOWN , D. L. H. P. E KI 'i~. s. ~l. F.U.l!> . .'ì. " '· s. R E IT il . l'ror. Sn11p. ' In , ·itroo
procedures u·itlr radioisotoprs i11 mrdicinr». \ Ìl'nnn. l%\1. l \E:\. S'f·l2~ 3:.
(3)
EK1:"15.
R. P. Proc. Symp . «ln , ·itro proced,,·,·s
1969,. LAE.\ , S\f-121 105.
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Clin. It11·cst .. 39. %0 ( 1937).
Biodtenl. ) .. 88. 131 (l\163).
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