Interazioni molecolari
tra cellule del cumulo
e ovocita
Zona pellucida
Composta da 4 glicoproteine
prodotte esclusivamente dall’
oocita in via di crescita:
- ZP2 e ZP3 si assemblano in
lunghi filamenti
- ZP1 collega i filamenti in una rete
tridimensionale.
Presenta
pori
formati
da
microfilamenti che le conferiscono
un
aspetto
spugnoso
e
consentendo
l'attacco
dello
spermatozoo all'ovocita.
La zona induce lo spermatozoo a
subire la reazione acrosomiale
Matrice glicoproteica che circonda l'ovocita
Barriera protettiva e selettiva alla fecondazione tra le specie
Media gli scambi metabolici tra ovocita con il microambiente
circostante
Oolemma
Membrana specializzata con microvilli che, al momento
della fecondazione, mediano il contatto iniziale e la
fusione dello spermatozoo
Spazio perivitellino
Racchiude il primo globulo polare di 8-10 μm che presenta
una superficie ricca di microvilli, un citoplasma in cui sono
visibili cromosomi, microtubuli e granuli corticali
Tubuli (SER) e vescicole (V) del reticolo
endoplasmatico liscio sono associati con i
mitocondri (M) per formare aggregati M-SER
e complessi MV.
Ruolo nei meccanismi di stoccaggio e rilascio
di Ca2+
Ooplasma
Caratterizzato da mitocondri, che possono essere sferici o di
forma ovale e che contengono una matrice densa e creste
nella parte esterna.
Il contenuto dei GC viene rilasciato nello
spazio
perivitellino
(REAZIONE
CORTICALE)
al
momento
della
fecondazione
e
a
ciò
segue
la
compattazione e l'indurimento della parte
interna della zona pellucida (REAZIONE
DELLA ZONA) per evitare la polispermia
Ooplasma
Presenza di granuli corticali contenenti mucopolisaccaridi,
proteasi, fosfatasi acida e perossidasi.
L'ovocita MII è privo di membrana nucleare. I 23 cromosomi sono
localizzati sulla piastra equatoriale del fuso meiotico. Il fuso meiotico
è formato da microtubuli che si estendono da un polo all' altro, è
anastrale, privo di centrioli e ha una forma a barile.
Complesso cumulo ooforo-ovocita (COC)
Le cellule del cumulo si associano
con l'ovocita a formare una matrice
extracellulare visco-elastica estesa
che appare come una struttura
unica. Tale matrice COC è ricco di
acido ialuronico (HA).
HA è la spina dorsale strutturale di
questa matrice, che viene
ulteriormente stabilizzata da una
complessa rete di proteine leganti,
tra cui TSG-6 , inibitore della
tripsina α e PTX3.
Cellule del cumulo ooforo (CC)
Foto a microscopio elettronico a scansione
(SEM) di un complesso cumulo-ovocita
canino. (a) Le cellule del cumulo sono tonde
e disposte regolarmente intorno all'ovocita
(scala grafica: 17μm). (b) Le cellule del
cumulo sono collegate tra di loro mediante
brevi prolungamenti (scala grafica: 3,4μm).
(c) In prossimità della zona pellucida le
cellule del cumulo presentano un unico
prolungamento che raggiunge il poro della
zona pellucida (scala grafica: 2μm). (d) La
zona pellucida presenta numerosi pori che si
restringono verso il centro (scala grafica:
2μm) .
Cellule del cumulo ooforo
Alto tasso di proliferazione cellulare
Livelli di espressione di AMH più alti
Capacità steroidea inferiore
Livelli di espressione di LHR inferiore
Capacità di secernere acido ialuronico per
l'espansione COC
Cumulo Compatto:
le cellule strettamente collegate che circondano
l'ovocita come una superficie unica
Espansione Cumulo Ooforo
Poco prima dell'ovulazione si assiste a un'espansione del cumulo
ooforo dovuta a secrezione, in seguito al picco di LH, da parte
delle cellule che lo costituiscono di matrice amorfa contenente
alti livelli di acido ialuronico, un glicosamminoglicano non
solforato con proprietà adesive, che seppure allontanando le
cellule del cumulo le mantiene adese tra loro.
Alcune delle cellule del cumulo ooforo accompagnano l'ovocita
quando esso è rilasciato nell'antro e anche quando esso è
ovulato.
Le ialuronidasi rilasciate dallo spermatozoo degradano la matrice
di acido ialuronico permettendo allo spermatozoo di superare il
cumulo ooforo.
Cumulo Espanso:
cellule staccate dal ovocita con matrice visibile tra cellule
del cumulo
Interazioni cellule del cumulo e ovocita
L'ovocita e le cellule somatiche dipendono strutturalmente e
metabolicamente le une dalle altre, e l'instaurarsi di questa
relazione è indispensabile per il corretto sviluppo ed il
benessere del futuro embrione.
Perché è importante questa
comunicazione bidirezionale?
1. Maturazione ovocitaria
2. Ripresa da parte dell'ovocita della fase meiotica
3. Ovulazione
Interazioni cellule del cumulo e ovocita
Tra le CC e l’ovocita esiste una stretta
interdipendenza strutturale e funzionale,
garantita da gap junction e fattori paracrini
La comunicazione bidirezionale tra cellule del cumulo e ovocita è
mediata dallo scambio di piccole molecole grazie a gap junction e a
fattori paracrini secreti sia dall'ovocita che dalle cellule del cumulo.
GAP JUNCTION
FATTORI PARACRINI
1. Gap junction
Giunzioni intercellulari che consentono lo
scambio diretto di piccoli metaboliti, molecole di
segnale e ioni tra le CC e l’ovocita.
Questi scambi sono essenziali alla crescita
dell'ovocita
sia
perché
garantiscono
l'assorbimento di sostanze nutritive sia perché
permettono
il trasferimento di molecole
importanti, come per esempio l'adenosina
monofosfato ciclico (cAMP), indispensabile per
la maturazione dell'ovocita.
Gap junction
I canali sono formati da due unità dette connessoni formati a
loro volta da proteine trans-membrana chiamate connessine.
2 loops extracellulari di legame (EL1,
EL2)
4 domini transmembrana (TM1-4)
1 loop citoplasmatica (CL)
1 coda C-terminale (CT) e una Nterminale (NT) citoplasmatiche
Le proprietà di permeabilità dei
canali gap junction dipendono da
che
tipo
di
connessina
sono
costituiti.
Gap junction
• Nei follicoli ovarici almeno due tipi di connessine contribuiscono alla
formazione di gap-junction
• Le estensioni delle cellule del cumulo (proiezioni trans-zonali)
attraversano tutta la zona pellucida sino ad entrare in contatto con
l'ovocita, a livello del quale formano gap-junction.
Connessina 37
(CX37)
Responsabile della
connessione tra
cellule del cumulo
e ovocita
Connessina 43
(CX43)
Responsabile della
connessione tra
cellule del cumulo
adiacenti.
CX37
Mutazione a carico del gene codificante per
la connessina CX37:
non permette la formazione dei follicoli
di Graaf
si sviluppano molti corpi lutei
si blocca l'accrescimento dell'ovocita
prima che esso raggiunga la competenza
evolutiva
Coinvolgimento nel processo di acquisizione della maturità ovocitaria
Non solo trasmettere metaboliti dalle cellule del cumulo necessari
al ovocita, ma anche uno o più segnali dal ovocita per mantenere
lo stato di differenziazione delle cellule della granulosa, impedendo
loro di luteinizzante prima dell'ovulazione
CX43
Influenza la capacità di sviluppo
dell’ovocita
•
•
La riduzione dell’espressione del gene cx43
nel giorno del prelievo dell’ovocita è
essenziale per lo sviluppo dell’ovocita stesso
ruolo post fertilizzazione.
Mutazioni a carico del gene codificante CX43
inibiscono la maturazione ovocitaria e
l'ovocita non è in grado di acquisire la
competenza
meiotica,
influendo
negativamente sull'esito della gravidanza e
sulla fertilità femminile.
Consente il rilascio di molecole di segnalazione ATP che agendo
attraverso i recettori pirinergici P2 induce rilascio di Ca2+ con
conseguente aumento di Ca2+ nell ‘ovocita.
2. Fattori paracrini
Fattori paracrini
FF-MAS
FF-MAS (FF meiosis-activating sterol) è uno sterolo presente nel
microambiente follicolare dell'ovocita, che si forma a partire dallo
lanosterolo grazie alla lanosterolo 1,4 alfa demetilasi.
Ruolo fondamentale nel promuovere la
maturazione
nucleare e citoplasmatica
dell'ovocita e migliorare il tasso di
fertilizzazione.
PEPTIDI EGF-LIKE
AREG (Amphiregulin)
EREG (Epiregulin)
BTC (Betacellulin)
Stimolano l'espansione delle cellule del cumulo, la ripresa
meiotica e l'ovulazione
LH induce l' espressione di AREG nel follicolo preovulatorio, e AREG agisce in
modo autocrino e paracrino per mediare gli effetti dell’ LH sul follicolo,
compresa la ripresa della meiosi ovocitaria e l'espansione del cumulo ooforo.
PEPTIDI EGF-LIKE
LH
ERK1/2
EREG
AREG
BTC
EGF-R
HAS2
PTX3
TNFAIP 6
Acido ialuronico
COC espansione
Stabilizza la
matrice
GDF-9 e BMP15
Regolano le funzioni delle cellule del
cumulo attraverso il processo della
mitosi, la proliferazione,
l'apoptosi e il meccanismo di
trasduzione del segnale
1.
Stimolano MPF e MAPK e quindi positivamente associati
con la maturazione ovocitaria e la qualità embrionale.
2.
Promuovono la sopravvivenza e la proliferazione cellulare
sopprimendo l'espressione di Ddit4l (inibitore di mTOR)
BMP15
Un’alterata espressione di BMP-15
durante la follicologenesi può essere
causa di sterilità femminile.
Elevati livelli di BMP-15 nel liquido
follicolare di donne sottoposte a
tecniche di fecondazione in vitro è
strettamente
correlata
con
una
migliore qualità ovocitaria e tassi
di
fertilizzazione
e
sviluppo
embrionale maggiori
BMP-15 potrebbe essere un buon indicatore della maturità
dell' ovocita e del suo potenziale di fecondazione.
Interazioni metaboliche tra le ovociti e CC
L’ovocita pratica uno scarso metabolismo del glucosio, mentre le CC
possono metabolizzare anche substrati alternativi, come amminoacidi,
colesterolo ed altri, sostenendo lo sviluppo ovocitario.
Grazie a microarray di DNA è stato eseguito
lo screening di migliaia di geni delle CC, per
identificare marcatori associati a
competenza dell’ovocita * , qualità
dell’embrione ed esito della gravidanza.
*
capacità intrinseca di andare incontro a meiosi, fecondazione e
sviluppo embrionale.
Confrontando l’espressione genica di CC
prelevate da ovociti per i quali la IVF non è
andata a buon fine con quella di CC da
ovociti regolarmente sviluppatisi in embrioni
(Giorno 3), si è osservata una differenza
d’espressione di 160 geni!
Inoltre, delineando il profilo di espressione
genica delle CC, si è visto che 45 geni
sono associati all’esito positivo di una
gravidanza, di cui 36 up-regolati e 9 downregolati.
ptx3
se up-regolato stabilizza le CC espanse
ed è associato ad esito positivo di gravidanza.
bcl2-l
II coinvolto nell’innesco della morte
cellulare in caso di anomalie, se up-regolato
permette di prevedere la qualità di ovocita ed
embrione.
cx43
consente il passaggio di metaboliti da
CC ad ovociti e il mantenimento della
“quiescenza” dell’ovocita, se down-regolato
influenza negativamente lo sviluppo
ovocitario
Apoptosi e cellule del cumulo
Elevato tasso di apoptosi
nelle cellule del cumulo
Scarsa
maturazione
ovocitaria
Scarso
sviluppo
embrionale
Scarsa qualità
ovocitaria
Tassi bassi di
fecondazione
Valutazione della qualità embrionale e conseguente previsione dell'esito delle
tecniche di fecondazione in vitro
Pazienti poor responders trattate con r-FSH+r-LH al giorno 1 del
ciclo di stimolazione ovarica con GnRH-ant mostrano un DFI inferiore
valutato con tecnica TUNEL
DNA
non
frammentato
50
45
40
35
% DFI
DNA
frammentato
30
r-FSH
25
r-FSH+r-LH
20
15
10
5
0
*
Pazienti poor responders trattate con r-FSH+r-LH al giorno 1 del
ciclo di stimolazione ovarica con GnRH-ant mostrano una
modulazione dei geni BAX e BCL2 valutati con qRT-PCR
Decremento del livello di espressionedi BAX e un incremento
dell'espressione
di BCL-2 nelle pazienti stimolate con r-FSH+r-LH.
(p≤0,05)
Percentuali di fertilizzazione e qualità embrionale maggiori rispetto
alla sola somministrazione di FSH.
In pazienti poor responders la supplementazione di LH al
giorno 1 di stimolazione ovarica con GnRH-ant:
●
Riduzione del tasso di apoptosi nelle cellule del cumulo
●
MODULAZIONE GENICA DELL' APOPTOSI
Aumento tassi di fertilizzazione
dell'ovocita e numero di embrioni
di grado I analizzati in 3a giornata
Conclusioni
Le CC, utilizzabili come mezzi non invasivi
per la valutazione della qualità degli ovociti,
della competenza dell’embrione ed anche
per la previsione dell’esito di una
gravidanza.
