Diapositiva 1 - CRA Centro Riproduzione Assistita

CRA – Centro Riproduzione Assistita - Catania
www.cragroup.it
19-20-21 Giugno 2012
Harvest e coltura degli ovociti
Dott.ssa Raffaella Cavallaro
Dott.ssa Giovanna Tomasi
Il laboratorio di Fecondazione Assistita
Stimulation
PATIENT
Oocyte
quality
N° of Incubator
Oil
overlay
CULTURE SYSTEM
Gas
phase
Gardner and Lane, 2007
LABORATORY
Embryo transfer and
luteal support
N° of Embryologist
and training level
Air quality
N° of
embryos/drop
Tissue culture- ware /
contact supplies
Culture
media
Oocyte/Embryo handling
outside the incubator
OUTCOME
QC &
QA
Il timing del Laboratorio di Fecondazione Assistita
DAY -2
 Preparare la documentazione
 Allestire le piastre per la coltura oil
overlay
DAY -1
 Preparare gocce con terreno di coltura
nelle piastre di olio
 Incubare i terreni
Tracciabilità: codice univoco per la coppia e utilizzo del doppio cognome
Il timing del Laboratorio di Fecondazione Assistita
DAY 0
 Valutazione e preparazione del liquido
seminale
 Harvest degli ovociti
 Denuding e OCTAX (solo per ICSI)
 ICSI o FIVET
Tracciabilità: codice univoco per la coppia e utilizzo del doppio cognome
Il timing del Laboratorio di Fecondazione Assistita
Pick up
Stadio ovocitario
Stadio di prima
divisione cellulare
Stadio di seconda
divisione cellulare
Stadio cellulare
pre-transfer
Stadio
pronucleare
0
Transfer
+1
+2
Blastocisti
+3
+5
Il gamete femminile
È l’unica cellula dotata delle caratteristiche
per fondersi e incorporare lo spermatozoo al
momento della fertilizzazione e sostenere le
prime fasi dello sviluppo embrionale
Ovocita in Metafase II
È lo stadio di maturità dell’ovocita
perchè possa essere fertilizzato
Il gamete femminile
La maturazione dell’ovocita si compone
di
una
complicata
serie
di
eventi
molecolari e strutturali non ancora del
tutto noti.
Maturazione ovocitaria
Dott.ssa G. Tomasi
Il gamete femminile
Oocyte assessment
VG
PI
MI
MII
Allo stadio di Metafase II i cromosomi
disposti
in
piastra
meiotico o spindle.
organizzano
il
fuso
Il gamete femminile
Il gamete femminile
FSH-independent
FSH-dependent
LH
primary
antral
secondary
small-middle antral
< 2mm
Prophase I (GV)
meiotically
incompetent
oocytes
preovulatory
> 20mm
MIIcompetent
GVBD-competent oocytes
early embryonic development
full embryonic development
cytoplasmic
matured
Upon LH
n 2C
n 2C
Metaphase II
n 2C
Telophase I
2n4C
Metaphase I
2n4C
GVBD
Meiosis
resumption
Il gamete femminile
Per definizione un ovocita di ottima qualità in grado di
“produrre” un embrione a massima potenzialità di
impianto ha le seguenti caratteristiche:
Citoplasma incolore e uniforme nell’aspetto
Granulosità assente o moderata, comunque uniforme
Nessuna inclusione
Ovocita in Metafase I - MI

Non ha ancora espulso il primo Polar Body

Ha già realizzato la GVBD

Le cellule del complesso cumulo corona sono generalmente ben espanse

I cromosomi omologhi sono organizzati a formare il primo fuso

Al di sotto dell’oolemma si sono già organizzati uno o due strati di granuli corticali
Sathananthan et al 1993
Ovocita in Profase I - PI

Non ha ancora espulso il primo Polar Body

È visibile la vescicola germinale

Le cellule del complesso cumulo corona non sono generalmente ben
espanse, appaiono compatte tra loro

Al di sotto dell’oolemma i granuli corticali sono disposti disordinatamente
Sathananthan et al 1993
Ultrastruttura dell’ovocita
Mitochondria

Sono gli organelli più evidenti
nell’ooplasma

Hanno aspetto sferico o ovale

Il loro aspetto mostra un’elevata
attività
Modified from Sathananthan et al 1993
Ultrastruttura dell’ovocita

Piccoli aggregati distribuiti sER
uniformemente nell’ooplasma

Grandi aggregati costituiti da
elementi tubulari o di forma
irregolare in periferia
Reticolo
Endoplasmatico
liscio e rugoso

Generalmente assente nell’ovocita maturo

Compaiono al momento dell’attivazione del
genoma dello zigote
Modified from Sathananthan et al 1993
rER
Ultrastruttura dell’ovocita
SPINDLE
Modified from Sathananthan et al 1993

È localizzato al polo animale
dell’ovocita, ha forma “barrel-shaped”,
è allineato perpendicolarmente alla
superficie dell’ovocita

È composto da microtubuli ma manca
di un centrosoma funzionante, che nello
zigote sarà di origine paterna
Prelievo ovocitario o Pick-up
Screening del fluido
follicolare per la ricerca
dell’ovocita…
…visione allo
stereomicroscopio di
ovociti recuperati dal
fluido follicolare
Mantenimento della qualità ovocitaria
Manipolazione di gameti e
embrioni
Qualità embrionale
Minimizzare lo stress durante la manipolazione in vitro di
gameti ed embrioni
Mantenere costante il pH
Un aumento del pH sull’ovocita sembra avere effetto
sull’assemblaggio/disassemblaggio dei microtubuli.
J. Swain, 2010 - RBM OnLine
D.Gardner & M.Lane – Textbook of Assisted Reproductive Techniques
Handling Medium e Mantenimento del pH
Scala logaritmica
equilibrio tra concentrazione
di CO2 e concentrazione di
bicarbonato
pH extracellulare
Sistemi di trasporto nelle
membrane
pH intracellulare
co2
D.Gardner & M.Lane – Textbook of Assisted Reproductive Techniques
Handling Medium e Mantenimento del pH
pH extracellulare
pH ottimale per le colture
embrionali è 7.2
pH intracellulare
acidi monocarbossilici nel
terreno (lattato e piruvato) e
dalla presenza di amminoacidi
Gli stadi di sviluppo embrionale più avanzati (morula e blasto) regolano il pHi più
rigorosamente degli ovociti e degli embrioni in cleavage stage.
Handling Medium
I cosiddetti handling medium sono quei terreni di coltura formulati per resistere ai
cambiamenti nella concentrazione di CO2, cioè quei terreni grazie ai quali è possibile
manipolare gameti ed embrioni al di fuori dell’incubatore.
D.Gardner & M.Lane – Textbook of Assisted Reproductive Techniques
Good’s Buffers
 pKa compreso tra pH 6.0 e 8.0
 Atossicità
 effetti limitati sulle reazioni biochimiche
 bassa assorbanza
 stabilità idrolitica e enzimatica
 elevata stabilità ai cambiamenti di temperatura e concentrazione di ioni e sali
nella soluzione
 ridotta capacita di interazione con i cationi minerali
 limitata permeabilità alle membrane biologiche
(di Norman Good e colleghi, 1996)
Buffer
HEPES
Supporta con successo lo sviluppo
embrionale in presenza di bicarbonato nel
medesimo terreno di coltura (in assenza
tassi di fertilizzazione più bassi).
Iwasaki ha osservato un aumento della
frammentazione (studi condotti sui maiali)
se la concentrazione supera i 35mmol/l.
Tendenza ad alterare canali ionici delle
membrane e fototossicità, produce
perossido di idrogeno se esposto alla luce
ambientale (Lepe-Zuniga et al.).
J. Swain, 2010 - RBM OnLine
MOPS
Più
“embryo-friendly”
all’hepes.
rispetto
Effetti ben documentati, sugli animali.
Assenza di letteratura su embrioni
umani.
Lavora meglio a 25°C
HEPES
MOPS
Valutazione della maturità ovocitaria
Gli ovociti prelevati sono circondati dalle cellule del cumulo ooforo
che insieme alle cellule della corona radiata (le cellule più interne),
formano il complesso cumulo corona – CCO.
Sathananthan et al 1993
Valutazione della maturità ovocitaria
CCO compatto
Profase1
CCO atresico? post maturo?
!?!
?
C.O. espanso
Corona radiata
Stadio ovocitario
Maturità CCO - nucleare
Metafase 2
Stadio ovocitario
Maturità CCO - nucleare
 Il 28 % degli ovociti dimostra asincronia tra il
 CCO e la maturità nucleare
 Grading del CCO
(Ng, 1999)
(Wolf, 1988 ; Ng, 1999)
Grado 1
Maturo :
preovulatorio
Cumulo espanso, corona radiata , ZP distinta, cellule della granulosa
ben espanse.
Grado 2
Quasi maturo
Cumulo espanso, corona leggermente compatta, cellule della
granulosa ben espanse.
Grado 3
Immaturo
Cumulo compatto ( se presente ) ,corona molto compatta, cellule
della granulosa compatte.
Grado 4
Post maturo
Cumulo espanso con aggregati di cellule scure , corona anch’essa
con gruppi di cellule,cellule della granulosa piccole e non aggregate,
molto scure.
Grado 5
Atresico
Raramente associato al cumulo, corona quasi del tutto composta di
cellule agglutinate come le cellule della granulosa.
Lin et al., 2003
CCO - ovocita
Ovocita /
Cellule del
cumulo ooforo
 Comunicazione paracrina
 Comunicazione tramite
gap-junction
GDF-9
Bidirezionale
Follicologenesi
e ovogenesi
GDF-9B
SIERR Update, 2011
CCO - ovocita
Durante la follicologenesi:
Aumenta la concentrazione di proteine (più alta della concentrazione plasmatica);
Aumenta la glicolisi e la produzione di lattato
Si riduce la concentrazione di acidi grassi ad eccezione del Meiosis-Activating-Strerols
Processi citoplasmatici
trans-zonali
(TZP)
Via paracrina
SIERR Update, 2011
Good quality oocyte
MII
ZP chiara
Citoplasma
uniforme
Ovocita
“competente”
Maturazione citoplasmatica: produzione di specifici fattori,
ridistribuzione degli organelli e modifica della attività posttrascrizionale in preparazione alla fertilizzazione e allo sviluppo
embrionale
Maturazione
nucleare:
breackdown
della
vescicola
germinale,condensazione della cromatina per formare i bivalenti e
loro capacità di separarsi.
Qualità ovocitaria e stile di vita
La qualità ovocitaria è influenzata negativamente da fattori fisici, ambientali,
comportamentali e socio-economici.
Obesità determina una diminuzione
della vascolarizzazione del follicolo,
con un conseguente aumento della
temperatura.
Elevati livelli di colesterolo
alterano la distribuzione dei
mitocondri nell’ovocita
La nicotina inibisce la formazione
del fuso meiotico.
Il fumo di sigaretta altera la
steroidogenesi
e
la
vascolarizzazione follicolare
Varghese, AC et al., 2011
Grazie per l’attenzione