CRA – Centro Riproduzione Assistita - Catania www.cragroup.it 19-20-21 Giugno 2012 Harvest e coltura degli ovociti Dott.ssa Raffaella Cavallaro Dott.ssa Giovanna Tomasi Il laboratorio di Fecondazione Assistita Stimulation PATIENT Oocyte quality N° of Incubator Oil overlay CULTURE SYSTEM Gas phase Gardner and Lane, 2007 LABORATORY Embryo transfer and luteal support N° of Embryologist and training level Air quality N° of embryos/drop Tissue culture- ware / contact supplies Culture media Oocyte/Embryo handling outside the incubator OUTCOME QC & QA Il timing del Laboratorio di Fecondazione Assistita DAY -2 Preparare la documentazione Allestire le piastre per la coltura oil overlay DAY -1 Preparare gocce con terreno di coltura nelle piastre di olio Incubare i terreni Tracciabilità: codice univoco per la coppia e utilizzo del doppio cognome Il timing del Laboratorio di Fecondazione Assistita DAY 0 Valutazione e preparazione del liquido seminale Harvest degli ovociti Denuding e OCTAX (solo per ICSI) ICSI o FIVET Tracciabilità: codice univoco per la coppia e utilizzo del doppio cognome Il timing del Laboratorio di Fecondazione Assistita Pick up Stadio ovocitario Stadio di prima divisione cellulare Stadio di seconda divisione cellulare Stadio cellulare pre-transfer Stadio pronucleare 0 Transfer +1 +2 Blastocisti +3 +5 Il gamete femminile È l’unica cellula dotata delle caratteristiche per fondersi e incorporare lo spermatozoo al momento della fertilizzazione e sostenere le prime fasi dello sviluppo embrionale Ovocita in Metafase II È lo stadio di maturità dell’ovocita perchè possa essere fertilizzato Il gamete femminile La maturazione dell’ovocita si compone di una complicata serie di eventi molecolari e strutturali non ancora del tutto noti. Maturazione ovocitaria Dott.ssa G. Tomasi Il gamete femminile Oocyte assessment VG PI MI MII Allo stadio di Metafase II i cromosomi disposti in piastra meiotico o spindle. organizzano il fuso Il gamete femminile Il gamete femminile FSH-independent FSH-dependent LH primary antral secondary small-middle antral < 2mm Prophase I (GV) meiotically incompetent oocytes preovulatory > 20mm MIIcompetent GVBD-competent oocytes early embryonic development full embryonic development cytoplasmic matured Upon LH n 2C n 2C Metaphase II n 2C Telophase I 2n4C Metaphase I 2n4C GVBD Meiosis resumption Il gamete femminile Per definizione un ovocita di ottima qualità in grado di “produrre” un embrione a massima potenzialità di impianto ha le seguenti caratteristiche: Citoplasma incolore e uniforme nell’aspetto Granulosità assente o moderata, comunque uniforme Nessuna inclusione Ovocita in Metafase I - MI Non ha ancora espulso il primo Polar Body Ha già realizzato la GVBD Le cellule del complesso cumulo corona sono generalmente ben espanse I cromosomi omologhi sono organizzati a formare il primo fuso Al di sotto dell’oolemma si sono già organizzati uno o due strati di granuli corticali Sathananthan et al 1993 Ovocita in Profase I - PI Non ha ancora espulso il primo Polar Body È visibile la vescicola germinale Le cellule del complesso cumulo corona non sono generalmente ben espanse, appaiono compatte tra loro Al di sotto dell’oolemma i granuli corticali sono disposti disordinatamente Sathananthan et al 1993 Ultrastruttura dell’ovocita Mitochondria Sono gli organelli più evidenti nell’ooplasma Hanno aspetto sferico o ovale Il loro aspetto mostra un’elevata attività Modified from Sathananthan et al 1993 Ultrastruttura dell’ovocita Piccoli aggregati distribuiti sER uniformemente nell’ooplasma Grandi aggregati costituiti da elementi tubulari o di forma irregolare in periferia Reticolo Endoplasmatico liscio e rugoso Generalmente assente nell’ovocita maturo Compaiono al momento dell’attivazione del genoma dello zigote Modified from Sathananthan et al 1993 rER Ultrastruttura dell’ovocita SPINDLE Modified from Sathananthan et al 1993 È localizzato al polo animale dell’ovocita, ha forma “barrel-shaped”, è allineato perpendicolarmente alla superficie dell’ovocita È composto da microtubuli ma manca di un centrosoma funzionante, che nello zigote sarà di origine paterna Prelievo ovocitario o Pick-up Screening del fluido follicolare per la ricerca dell’ovocita… …visione allo stereomicroscopio di ovociti recuperati dal fluido follicolare Mantenimento della qualità ovocitaria Manipolazione di gameti e embrioni Qualità embrionale Minimizzare lo stress durante la manipolazione in vitro di gameti ed embrioni Mantenere costante il pH Un aumento del pH sull’ovocita sembra avere effetto sull’assemblaggio/disassemblaggio dei microtubuli. J. Swain, 2010 - RBM OnLine D.Gardner & M.Lane – Textbook of Assisted Reproductive Techniques Handling Medium e Mantenimento del pH Scala logaritmica equilibrio tra concentrazione di CO2 e concentrazione di bicarbonato pH extracellulare Sistemi di trasporto nelle membrane pH intracellulare co2 D.Gardner & M.Lane – Textbook of Assisted Reproductive Techniques Handling Medium e Mantenimento del pH pH extracellulare pH ottimale per le colture embrionali è 7.2 pH intracellulare acidi monocarbossilici nel terreno (lattato e piruvato) e dalla presenza di amminoacidi Gli stadi di sviluppo embrionale più avanzati (morula e blasto) regolano il pHi più rigorosamente degli ovociti e degli embrioni in cleavage stage. Handling Medium I cosiddetti handling medium sono quei terreni di coltura formulati per resistere ai cambiamenti nella concentrazione di CO2, cioè quei terreni grazie ai quali è possibile manipolare gameti ed embrioni al di fuori dell’incubatore. D.Gardner & M.Lane – Textbook of Assisted Reproductive Techniques Good’s Buffers pKa compreso tra pH 6.0 e 8.0 Atossicità effetti limitati sulle reazioni biochimiche bassa assorbanza stabilità idrolitica e enzimatica elevata stabilità ai cambiamenti di temperatura e concentrazione di ioni e sali nella soluzione ridotta capacita di interazione con i cationi minerali limitata permeabilità alle membrane biologiche (di Norman Good e colleghi, 1996) Buffer HEPES Supporta con successo lo sviluppo embrionale in presenza di bicarbonato nel medesimo terreno di coltura (in assenza tassi di fertilizzazione più bassi). Iwasaki ha osservato un aumento della frammentazione (studi condotti sui maiali) se la concentrazione supera i 35mmol/l. Tendenza ad alterare canali ionici delle membrane e fototossicità, produce perossido di idrogeno se esposto alla luce ambientale (Lepe-Zuniga et al.). J. Swain, 2010 - RBM OnLine MOPS Più “embryo-friendly” all’hepes. rispetto Effetti ben documentati, sugli animali. Assenza di letteratura su embrioni umani. Lavora meglio a 25°C HEPES MOPS Valutazione della maturità ovocitaria Gli ovociti prelevati sono circondati dalle cellule del cumulo ooforo che insieme alle cellule della corona radiata (le cellule più interne), formano il complesso cumulo corona – CCO. Sathananthan et al 1993 Valutazione della maturità ovocitaria CCO compatto Profase1 CCO atresico? post maturo? !?! ? C.O. espanso Corona radiata Stadio ovocitario Maturità CCO - nucleare Metafase 2 Stadio ovocitario Maturità CCO - nucleare Il 28 % degli ovociti dimostra asincronia tra il CCO e la maturità nucleare Grading del CCO (Ng, 1999) (Wolf, 1988 ; Ng, 1999) Grado 1 Maturo : preovulatorio Cumulo espanso, corona radiata , ZP distinta, cellule della granulosa ben espanse. Grado 2 Quasi maturo Cumulo espanso, corona leggermente compatta, cellule della granulosa ben espanse. Grado 3 Immaturo Cumulo compatto ( se presente ) ,corona molto compatta, cellule della granulosa compatte. Grado 4 Post maturo Cumulo espanso con aggregati di cellule scure , corona anch’essa con gruppi di cellule,cellule della granulosa piccole e non aggregate, molto scure. Grado 5 Atresico Raramente associato al cumulo, corona quasi del tutto composta di cellule agglutinate come le cellule della granulosa. Lin et al., 2003 CCO - ovocita Ovocita / Cellule del cumulo ooforo Comunicazione paracrina Comunicazione tramite gap-junction GDF-9 Bidirezionale Follicologenesi e ovogenesi GDF-9B SIERR Update, 2011 CCO - ovocita Durante la follicologenesi: Aumenta la concentrazione di proteine (più alta della concentrazione plasmatica); Aumenta la glicolisi e la produzione di lattato Si riduce la concentrazione di acidi grassi ad eccezione del Meiosis-Activating-Strerols Processi citoplasmatici trans-zonali (TZP) Via paracrina SIERR Update, 2011 Good quality oocyte MII ZP chiara Citoplasma uniforme Ovocita “competente” Maturazione citoplasmatica: produzione di specifici fattori, ridistribuzione degli organelli e modifica della attività posttrascrizionale in preparazione alla fertilizzazione e allo sviluppo embrionale Maturazione nucleare: breackdown della vescicola germinale,condensazione della cromatina per formare i bivalenti e loro capacità di separarsi. Qualità ovocitaria e stile di vita La qualità ovocitaria è influenzata negativamente da fattori fisici, ambientali, comportamentali e socio-economici. Obesità determina una diminuzione della vascolarizzazione del follicolo, con un conseguente aumento della temperatura. Elevati livelli di colesterolo alterano la distribuzione dei mitocondri nell’ovocita La nicotina inibisce la formazione del fuso meiotico. Il fumo di sigaretta altera la steroidogenesi e la vascolarizzazione follicolare Varghese, AC et al., 2011 Grazie per l’attenzione