PROGETTI A CONCORSO 2009-2010 - VINCITORI
PROGETTO N. 31
CDR / 719/04
RESPONSABILE PROGETTO: GIORGIO BOLIS
FINANZIAMENTO: € 40.000,00
Ricerca di geni espressi nelle cellule del cumulo ooforo, che possano essere utilizzati come marker
per la valutazione della qualità e la selezione degli ovociti nel corso delle procedure di fecondazione
assistita, in accordo alla legge 40/2004 sulla Procreazione Medicalmente Assistita.
La Legge 40 obbliga a fecondare al massimo tre ovociti. La loro selezione è quindi cruciale nella
fecondazione in vitro per aumentare le probabilità di gravidanza. Attualmente la scelta si basa solamente su
valutazioni morfologiche non molto efficienti. Lo studio di ulteriori parametri costituisce un passo importante
per
selezionare
gli
ovociti
con
una
maggiore
possibilità
di
sviluppo.
Le cellule del cumulo durante lo sviluppo follicolare e l’ovulazione sono connesse all’ovocita tramite gapjunction che creano una reciproca interconnessione. Nell’ICSI (iniezione intracitoplasmatica dello
spermatozoo) queste cellule vengono rimosse dall’ovocita maturo prima della fecondazione, quindi si
prestano
all’analisi
senza
alterare
il
protocollo
d’inseminazione.
Obiettivo del lavoro è verificare eventuali differenze di espressione di alcuni geni nelle cellule del cumulo
ooforo e correlarle con la possibilità di sviluppo dei relativi ovociti. A tal fine si confronteranno i livelli di
espressione sia nei campioni prelevati dagli oociti che portano ad embrioni di buona qualità, sia in quelli che
danno
embrioni
di
scarsa
qualità.
In letteratura sono riportati vari studi che indagano nelle cellule del cumulo l’espressione dei geni a valle del
GDF9 (growth differentation factor 9), un prodotto dell’ovocita che attiva diversi geni in queste cellule. Tra
questi vi sono GREM1, HAS2 e PTX3, già precedentemente studiati da questo gruppo di ricerca. Un recente
lavoro ha invece individuato, tramite analisi con microarrays, geni appartenenti ad altri pathways, che
mostrano differenze di espressione statisticamente significative tra cellule del cumulo di ovociti da cui
originano embrioni con maggiori possibilità di impianto e quelle di ovociti da cui originano embrioni di scarsa
qualità: CCND2 (cyclin D2), CTNND1 (catenin delta-1), CXCR4 (chemokine receptor 4), DHCR7 (7dehydrocholesterol reductase), DVL3 (dishevelled dsh homolg 3), GPX3 (glutathione peroxidase 3), HSPB1
(heatshock 27 kDa protein 1) e TRIM28 (tripartite motif-containing 28). Non ci sono in letteratura altri dati che
supportino o smentiscano tali risultati. Per questo motivo, verranno indagati alcuni di questi geni in modo da
confermarne o meno la correlazione con i processi coinvolti nella fecondazione e/o nello sviluppo
embrionale.
I campioni saranno costituiti da cellule del cumulo ooforo di donne che si sottopongono a fecondazione
assistita
con
induzione
della
superovulazione
e
fecondazione
tramite
ICSI.
Il materiale sarà prelevato dalle pazienti previo consenso informato. Saranno escluse dal progetto le donne
di età superiore ai 38 anni o che abbiano a disposizione un solo ovocita maturo, inoltre saranno incluse
quelle sottoposte a stimolazione ormonale con rFSH e soppressione dell’attività del GnRH tramite analogo o
antagonista del GnRH stesso. Le cellule del cumulo saranno isolate dai singoli ovociti mantenendo
corrispondenza univoca tra l’ovocita inseminato e le cellule del cumulo ad esso associate. Nei tre giorni di
sviluppo in vitro, saranno quotidianamente registrate le caratteristiche morfologiche dello zigote e degli
embrioni sviluppatisi.
Per la raccolta dei campioni, dopo il prelievo degli oociti, le cellule da sottoporre ad analisi saranno prelevate
tramite dissezione di una parte del cumulo ooforo da ogni ovocita scelto per essere fecondato. Tutti i
campioni verranno identificati in modo da poter risalire facilmente all’oocita da cui derivano e stoccati nella
maniera
opportuna
(a
-80°C
oppure
in
azoto
liquido).
Per lo studio saranno necessari almeno 200 oociti provenienti da circa 70 donne diverse. Gli oociti saranno
fecondati tramite ICSI dopo circa 3 ore dal pick up; per il tempo dello sviluppo in vitro (3 giorni) lo zigote sarà
valutato per le sue caratteristiche morfologiche che si tradurranno nella definizione di “embrioni di buona
qualità” oppure “embrioni di cattiva qualità” secondo il sistema Veeck (An Atlas of Human Gametes and
Conceptus: An Illustrated Refernce for Assisted Reproductive Technology, essenzialmente basato
sull’osservazione morfologica).
Tutte le caratteristiche delle pazienti, degli oociti da cui saranno raccolte le cellule del cumulo e degli
embrioni da essi derivati, saranno riunite in un database. In seguito verranno valutati eventuali fattori di
confondimento
(es.
stimolazione
ormonale,
fattore
di
infertilità).
Dalle cellule del cumulo sarà estratto l’RNA, retrotrascritto ed in seguito analizzato utilizzando la metodica
della Real-Time PCR, con sonde TaqMan per ognuno dei geni che si intende indagare (Assay on Demand,
Applied Biosystems). Il valore dell’espressione relativa sarà calcolato con il metodo del 2 -ΔCt impiegando
come
endogeno
il
gene
HPRT
(hypoxanthine
phosphoribosyltransferse
1).
Infine i risultati saranno elaborati tramite test statistici per verificare la presenza di differenze di espressione
statisticamente significative tra i due gruppi di ovociti dai quali si formano embrioni di buona o scarsa qualità.
Tra i geni candidati si valuterà la possibilità di individuare uno o più “marcatori” che possano essere utili
predittori
dell’esito
della
fecondazione
e
dello
sviluppo
embrionale.
In merito ai risultati raggiunti si potrebbe sviluppare una metodica di biologia molecolare, basata sull’analisi
dell’espressione genica, che possa essere prognostica per la riuscita della fecondazione e di un buon
sviluppo embrionale da affiancare alla scelta morfologica e inoltre, che sia in grado di essere effettuata nel
tempo che intercorre tra la raccolta degli oociti e la loro fecondazione.
