IRFMN
DIPARTIMENTO
DI MEDICINA MOLECOLARE
PERSONALE
Capo Dipartimento
Ariela BENIGNI, Dr. Sci. Biol. Ph. D.
Unità di Terapia Genica
Capo Unità
Susanna TOMASONI, Dr. Sci. Biol. Ph. D.
Laboratorio di Biologia Cellulare e Xenotrapianto
Capo Laboratorio
Marina MORIGI, Dr. Sci. Biol.
Unità dell’Interazione Piastrine-Endotelio Vascolare
Capo Unità
Miriam GALBUSERA, Dr. Sci. Biol.
Laboratorio di Immunologia e Genetica del Trapianto e Malattie Rare
Capo Laboratorio
Marina NORIS, Dr. Chim. Farm.
Laboratorio di Modelli Sperimentali di Malattie Renali
Capo Laboratorio
Carla ZOJA, Dr. Sci. Biol. Ph. D.
Unità di Patologia e Immunopatologia
Capo Unità
Mauro ABBATE, Dr. Med.
RAPPORTO ATTIVITA’
1
2005
IRFMN
CURRICULA
Ariela Benigni si è laureata in Scienze Biologiche nel 1979 presso l’Università degli Studi di Milano e
ha conseguito il titolo di Ph.D. presso l’Università di Maastricht, Groningen, Olanda, nel 2001.
Attività formative: nel 1979 Post Doctoral Fellow, Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri
(IRFMN), Laboratorio di Chemioterapia Antitumorale in vivo, Milano, Italia; nel 1980-1981 Post
Doctoral Fellow, Associazione Bergamasca per lo Studio delle Malattie Renali, Laboratorio della
Divisione di Nefrologia e Dialisi, Ospedali Riuniti di Bergamo, Bergamo; nel 1980 Post Doctoral Fellow,
Guy’s Hospital, London; nel 1982 Titolare di una borsa di studio della Comunità Europea, Centre
Regional de Transfusion Sanguigne de Strasbourg, Strasbourg, Francia; nel 1989 stage al Brigham and
Women’s Hospital, Laboratory of Prof. Barry Brenner, Boston.
Aree di interesse: mediatori vasoattivi e proinflammatori nella progressione delle malattie renali con
particolare riguardo all'endotelina; trattamento combinato di farmaci antiipertensivi e renoprotettivi per
rallentare la progressione della malattia renale cronica; utilizzo di cellule staminali per riparare il tessuto
renale in modelli di insufficienza renale acuta; tecniche di trasferimento genico in vitro e in vivo;
prevenzione del rigetto acuto del trapianto attraverso trasferimento genico all’organo da trapiantare;
induzione della tolleranza al trapianto attraverso tecniche di trasferimento genico.
Ruoli: nel 1983 Ricercatore, IRFMN, Laboratorio di Malattie Renali, Bergamo; tra 1990-1994 Capo
Laboratorio del Metabolismo di Prostaglandine e Leucotrieni, IRFMN, Bergamo; da Gennaio 1991 è
Segretario Scientifico, IRFMN, Bergamo, Italia; tra 1994 e 1999 è Capo Laboratorio dei Mediatori
Vasoattivi e Infiammatori di Danno Tissutale, IRFMN, Bergamo, Italia; da Gennaio 2000 è Capo
Dipartimento di Medicina Molecolare, IRFMN, Bergamo.
1996-1998: Associate Editor, Journal of Nephrology; 2003-2005: Associate Editor, Kidney International.
Principali pubblicazioni:
1.
S. Tomasoni, N. Azzollini, F. Casiraghi, M.C. Capogrossi, G. Remuzzi, A. Benigni. CTLA4Ig gene transfer prolongs survival
and induces donor-specific tolerance in a rat renal allograft. J Am Soc Nephrol 2000;11:747-752.
2.
G. Remuzzi, N. Perico, A. Benigni. New therapeutics that antagonize endothelin: promises and frustrations. Nature Reviews
Drug Discovery 2002;1:986-1001.
3.
Benigni, E. Gagliardini, S. Tomasoni, M. Abbate, P. Ruggenenti, R. Kalluri, G. Remuzzi. Selective impairment of gene
expression and assembly of nephrin in human diabetic nephropathy. Kidney International 2004; 65: 2193-2200.
4.
Benigni, D. Corna, C. Zoja, L. Longaretti, E. Gagliardini, N. Perico, T.M. Coffman, G. Remuzzi. Targeted deletion of
angiotensin II type 1A receptor does not protect mice from progressive nephropathy of overload proteinuria. J Am Soc
Nephrol 2004;15:2666-2674.
5.
M. Morigi, S. Buelli, S. Angioletti, C. Zanchi, L. Longaretti, C. Zoja, M. Galbusera, S. Gastoldi, P. Mundel, G. Remuzzi, A.
Benigni. In response to protein load podocytes reorganize cytoskeleton and modulate endothelin-1 gene: implication for
permselective dysfunction of chronic nephropathies. Am J Pathol 2005;166:1309-1320.
RAPPORTO ATTIVITA’
2
2005
IRFMN
Marina Morigi si è laureata in Scienze Biologiche nel 1987 presso l’Università degli Studi di Milano, Milano,
Italia.
Attività formative: 1984–1987 tesista presso IRFMN, Bergamo; nel 1987-1995 Borsista, IRFMN, Bergamo;
1991 Stage al Brigham and Women’s Hospital, presso il laboratorio del Dr. P. Marsden, Boston.
Aree di interesse: ruolo della Shigatoxin nella patogenesi del danno endoteliale tipico della forma epidemica di
Sindrome Emolitico uremica; Studio dei mediatori/meccanismi coinvolti nel modello in vitro di rigetto
iperacuto da xenotrapianto (endotelio porcino esposto a siero umano come fonte di complemento e
xenoanticorpi); tossicità renale delle proteine plasmatiche: studi per identificare i segnali intracellulari,
l’espressione e la produzione di mediatori pro-infiammatori in cellule epiteliali del tubulo prossimale e del
glomerulo in vitro; terapia cellulare e rigenerazione del tessuto renale: Studio della capacità delle cellule
staminali adulte di rigenerare il tessuto renale in modelli sperimentali di danno renale acuto e cronico; terapia
cellulare con cellule staminali embrionali murine per correggere il difetto genetico caratteristico della malattia
di Fabry in un modello murino.
Ruoli: dal 1995 Ricercatrice, IRFMN, Bergamo, Italy; 1996-1999 Capo, Unità di Biologia della Cellula Renale
ed Endoteliale; dal 2000 Capo, Laboratorio di Biologia Cellulare e Xenotrapianto, IRFMN, Bergamo, Italy.
Principali pubblicazioni:
1. M. Morigi, B. Imberti, C. Zoja, D. Corna, S. Tomasoni, M. Abbate, D. Rottoli, S. Angioletti, A. Benigni, N. Perico, M. Alison,
G. Remuzzi. Mesenchymal Stem Cells Are Renotropic, Helping to Repair the Kidney and Improve Function in Acute Renal
Failure. J Am Soc Nephrol 2004;15:1794-1804.
2. C. Zoja, M. Morigi, A. Benigni, G. Remuzzi. Genetics of rare diseases of the kidney: learning from mouse models. Cytogenet
Genome Research 2004;105: 479-484.
3. A. Remuzzi, S. Mantero, M. Colombo, M. Morigi, E. Binda, D. Camozzi, B. Imberti. Vascular smooth muscle cells on
hyaluronic acid: culture and mechanical characterization of an engineered vascular construct. Tissue Eng 2004;10:699-710.
4. M. Galbusera, S. Buelli, S. Gastoldi, D. Macconi, S. Angioletti, C. Testa, G. Remuzzi, M. Morigi. Activation of porcine
endothelium in response to xenogeneic serum causes thrombosis independently of platelet activation. Xenotransplantation
2005:12;110-120.
5. M. Morigi, S. Buelli, S. Angioletti, C. Zanchi, L. Longaretti, C. Zoja, M. Galbusera, S. Gastoldi, P. Mundel, G. Remuzzi, A.
Benigni. In response to protein load podocytes reorganize cytoskeleton and modulate endothelin-1 gene: implication for
permselective dysfunction of chronic nephropathies. Am J Pathol 2005;166:1309-1320.
Marina Noris si è laureata in Chimica e Tecnologie Farmaceutiche nel novembre 1986 presso l’Università
degli Studi La Sapienza di Roma.
Attività formative: nel 1984-1986 Borsista, Istituto di Chimica Farmaceutica e Tossicologica, Università di
Roma; nel 1986-1987 Borsista, Istituto di Chimica Farmaceutica e Tossicologica, Università di Roma;
nel 1987-1994 Borsista, IRFMN, Unità di Mediatori dell’infiammazione e del danno tessutale, Laboratorio di
Malattie Renali, Bergamo.
Aree di interesse: Immunologia del trapianto e induzione della tolleranza, genetica della sindrome emolitico
uremica, della porpora trombotica trombocitopenica, della glomerulosclerosi focale segmentale e della
nefropatia diabetica, alterazioni dell’arginina e dell’ossido d’azoto nell’uremia e nella pre-eclampsia.
Ruoli: nel 1992 ricercatrice, Laboratorio di Nefrologia IRFMN, Bergamo; nel 1994 Capo Unità di
Patofisiologia dell’endotelio, IRFMN, Bergamo; nel 1996-1999 Capo, Laboratorio di Biologia Cellulare e
Molecolare della Risposta Immune e dell'Autoimmunità, IRFMN, Bergamo; da gennaio 2000 Capo,
Laboratorio di Immunologia e Genetica di Malattie Rare e Trapianti, Dipartimento di Medicina Molecolare,
IRFMN, Bergamo.
Principali pubblicazioni:
1.
Manuelian T, Hellwage J, Meri S, Caprioli J, Noris M, Heinen S, Jozsi M, Neumann HP, Remuzzi G, Zipfel PF. Mutations in
factor H reduce binding affinity to C3b and heparin and surface attachment to endothelial cells in haemolytic uremic
syndrome. J Clin Invest 2003; 111: 1181-1190.
2.
Noris M, Brioschi S, Caprioli J, Todeschini M, Bresin E, Porrati F, Gamba S, Remuzzi G, on behalf of the International
Registry of Familial and Recurrent HUS/TTP. Familial haemolytic uraemic syndrome and an MCP mutation. Lancet 2003;
362:1542-1547.
3.
Caprioli J, Castelletti F, Bucchini S, Bettinaglio P, Bresin E, Pianetti G, Gamba S, Brioschi S, Daina E, Remuzzi G, Noris M,
on behalf of the International Registry of Familial and Recurrent HUS/TTP. Complement factor H mutations and gene
polymorphisms in haemolytic uraemic syndrome: the C-257T, the A2089G and the G2881T polymorphisms are strongly
associated with the disease. Hum Mol Genet 2003; 12:3385-3395.
4.
Noris M, Bucchioni s, Galbusera M, Donadelli R, Bresin E, Castelletti F, Caprioli J, Brioschi S, Scheiflinger F, Remuzzi G
and the International Registry of Recurrent and Familial HUS/TTP. Complement factor H mutation in familial thrombotic
thrombocytopenic purpura with ADAMTS13 deficency and renal involvement. J Am Soc Nephrol 2005; 16:1177-1183
5.
G. Remuzzi, P. Ruggenenti, D. Codazzi, M. Noris, J. Caprioli, G. Locatelli, B. Gridelli. Combined kidney and liver
transplantation for familial haemolytic uraemic syndrome. Lancet 2002; 359:1671-1672.
6.
M. Noris, D. Cugini, F. Casiraghi, N. Azzollini, L. De Deus Viera Moraes, M. Mister, A. Pezzotta, R. Aparecida Cavinato, S.
Aiello, N. Perico, G. Remuzzi. Thymic microchimerism correlates with the outcome of tolerizing protocols for solid organ
transplantation. J Am Soc Nephrol, 2001;12:2815-2826.
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IRFMN
Carlamaria Zoja si è laureata in Scienze Biologiche presso l’Università degli Studi di Milano, nel 1979.
Ha conseguito il titolo di Ph.D presso l’Università di Maastricht, Olanda nel 2001.
Attività formative: nel 1979-1981 Borsista “Associazione per lo Studio delle Malattie Renali” presso il
Laboratorio della Divisione di Nefrologia e Dialisi degli Ospedali Riuniti di Bergamo; nel 1981-1983
titolare di una borsa di studio della Comunità Europea presso il Center for Thrombosis and Vascular
Research, Department of Medical Research, Katholieke Universiteit, Leuven, Belgio; nel 1983-1985
Borsista, Laboratorio di Malattie Renali, IRFMN, Bergamo.
Aree di interesse: modelli sperimentali di malattie renali; mediatori di danno nella progressione delle
malattie renali; ruolo della proteinuria nella progressione delle nefropatie; nuove terapie per rallentare la
progressione delle malattie renali; ruolo della Shigatoxin nella patogenesi del danno endoteliale nella
Sindrome Emolitico Uremica.
Ruoli: nel 1985-1989 Ricercatrice, Laboratorio di Malattie Renali, IRFMN, Bergamo; nel 1990-1994
Capo Unità Modelli Sperimentali di Malattie Renali, IRFMN, Bergamo; dal 1995 Capo Laboratorio
Modelli Sperimentali di Malattie Renali, IRFMN, Bergamo.
Principali pubblicazioni:
1.
C.Zoja, S. Angioletti, R. Donadelli, C. Zanchi, S. Tomasoni, E. Binda, B. Imberti, M. te Loo, L. Monnens, G.Remuzzi, M.
Morigi. Shiga toxin-2 triggers endothelial leukocyte adhesion and transmigration via NF-kB dependent up-regulation of IL-8
and MCP-1. Kidney Int 2002;62:846-856.
2.
C. Zoja, D. Corna, D. Camozzi, D. Cattaneo, D. Rottoli, C. Batani, C. Zanchi, M. Abbate, G. Remuzzi. How to fully protect
the kidney in a severe model of progressive nephropathy: a multidrug approach. J Am Soc Nephrol 2002;13:2898-2908.
3. A. Benigni, C. Zoja, D. Corna, C. Zatelli, S. Conti, M. Campana, E. Gagliardini, D. Rottoli, C. Zanchi, M.
Abbate, S.
Ledbetter, G. Remuzzi. Add-on anti-TGF-b antibody to ACE inhibitor arrests progressive diabetic nephropathy in the rat. J
Am Soc Nephrol 2003;14:1816-1824.
4. R. Donadelli, C. Zanchi, M. Morigi, S. Buelli, C. Batani, S. Tomasoni, D. Corna, D. Rottoli, A. Benigni, M. Abbate, G.
Remuzzi, C. Zoja. Protein overload induces fractalkine upregulation in proximal tubular cells through NF-kB and p38 MAPK
dependent pathways. J Am Soc Nephrol 2003; 14:2436-2446.
5. M.Morigi, B.Imberti, C. Zoja, D. Corna, S.Tomasoni, M. Abbate, D. Rottoli, S. Angioletti, Ariela Benigni, N: Perico, M.
Alison, G. Remuzzi. Mesenchymal stem cells are renotropic, helping to repair the kidney and improve function in acute renal
failure. J Am Soc Nephrol 2004; 15: 1794-1804.
6.
C.Zoja, M.Campana, D.Corna, S..Tomasoni, E..Garofano, C..Zanchi, E..Gagliardini, T..Ito, G..Remuzzi, A.Benigni.
Transcriptional regulation of nephrin gene by peroxisome proliferator activated receptor- PPAR- agonists: molecular
mechanism of the antiproteinuric effect of pioglitazone. J Am Soc Nephrol 2005; 16: 673.
Mauro Abbate si è laureato in Medicina e Chirurgia nel 1988 presso l’Università degli Studi di Brescia.
Attività formative: nel 1984-1988 Studente tesista, IRFMN, Bergamo; nel 1989 - 1992 Borsista, IRFMN,
Bergamo. 1992 - 1994: Training di ricerca, The Renal Unit, Massachusetts General Hospital, Boston,
USA. 1995-1966, Borsista, IRFMN, Bergamo.
Aree di interesse: progressione delle nefropatie, ruolo di proteinuria, complemento e mediatori di danno
nella progressione delle nefropatie; meccanismi di danno glomerulare; nefrite anti-GBM; meccanismi di
danno tubulare; fibrosi interstiziale; biopsia renale, glomerulopatia membranosa.
Ruoli: nel 1996 - 2000 Ricercatore, IRFMN, Bergamo. Dal 2000: Capo Unità di Patologia e
Immunopatologia renale, IRFMN, Bergamo.
Principali pubblicazioni
1.
Abbate M, Zoja C, Rottoli D, Corna D, Tomasoni S, Remuzzi G: Proximal tubular cells promote fibrogenesis by TGF- 1mediated induction of peritubular myofibroblasts. Kidney International 2002;61,2066-2077.
2.
Abbate M, Zoja C, Morigi M, Rottoli D, Angioletti S, Tomasoni S, Zanchi C, Longaretti L, Donadelli R, Remuzzi G:
Transforming Growth Factor- 1 Is Up-Regulated by Podocytes in Response to Excess Intraglomerular Passage of Proteins: A
Central Pathway in Progressive Glomerulosclerosis. Am J Pathol.2002;161,2179-93.
3.
Ruggenenti P, Chiurchiu C, Brusegan V, Abbate M, Perna A, Filippi C, Remuzzi G: Rituximab for idiopathic membranous
nephropathy: a one year prospective study. J Am Soc Nephrol. 2003; 14,1851-1857.
4.
Benigni A, Gagliardini E, Tomasoni S, Abbate M, Ruggenenti P, Kalluri R, Remuzzi G.: Selective impairment of gene
expression and assembly of nephrin in human diabetic nephropathy. Kidney Int. 2004; 65:2193-200.
5.
Morigi M, Imberti B, Zoja C, Corna D, Tomasoni S, Abbate M, Rottoli D, Angioletti S, Benigni A, Perico N, Alison M,
Remuzzi G.:Mesenchymal stem cells are renotropic, helping to repair the kidney and improve function in acute renal failure. J
Am Soc Nephrol. 2004;15:1794-804.
6.
Abbate M, Corna D, Rottoli D, Zanche C, Cassis P, Morigi M, Zoja C, Remuzzi G: An intact complement pathway is not
dispensable for glomerular and tubulointerstitial injury induced by protein overload. J Am Soc Nephrol 2004;15:479A.
RAPPORTO ATTIVITA’
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IRFMN
Miriam Galbusera si è laureata in Scienze Biologiche nel 1981 presso l’Università degli Studi di
Milano.
Attività formative: nel 1981-1983 tirocinante, Istituto di Patologia Speciale Medica dell'Università degli
Studi di Milano; nel 1985-1989 Borsista, IRFMN, Bergamo; nel 1989-1991 Borsista, Scripps Clinic and
Research Foundation, Laboratory of Thrombosis and Hemostasis, La Jolla, CA, USA; nel 1991-1995
Borsista, IRFMN, Bergamo.
Aree di interesse: ADAMTS-13 e VWF nelle microangiopatie trombotiche, biochimica del VWF,
xenotrapianto, interazione piastrine-endotelio in condizioni di flusso, difetti piastrinici nell’uremia,
recettori renali e piastrinici.
Ruoli: nel 1995-1999 Ricercatrice, IRFMN, Bergamo, dal 2000 Capo Unità dell’InterazionePiastrineEndotelio Vascolare, IRFMN, Bergamo.
Principali pubblicazioni
1.
Tripodi, A., Chantarangkul, V., Bohm, M., Budde, U., Dong, J.-F., Friedman, K.D., Galbusera, M., Girma, J.-P., Moake, J.,
Rick, M.E., Studt, J.-D., Turecek, P.L., Mannucci, P.M.: Measurement of von Willebrand factor cleaving protease (ADAMTS13): results of an international collaborative study involving 11 methods testing the same set of coded plasmas. J Thromb
Haemost 2004; 2:1601-1609.
2.
Galbusera, M., Morigi, M., Buelli, S., Gastoldi, S., Macconi, D., Testa, C., Angioletti, S., Remuzzi, G.: Xenogeneic seruminduced thrombus formation on porcine endothelium is mediated by vitronectin receptor and P-selectin: role of reactive
oxygen species. Xenotransplantation 2005;12:110-120.
3.
Ruiz-Torres, M.P., Casiraghi, F., Galbusera, M., Macconi, D., Gastoldi, S., Todeschini, M., Porrati, F., Belotti, D., Pogliani,
E.M., Noris, M., Remuzzi, G.: Complement activation: the missing link between ADAMTS13 deficiency and microvascular
thrombosis of thrombotic microangiopathies. Thromb Haemost 2005; 93:443-452.
4.
Noris, M., Bucchioni, S., Galbusera, M., Donadelli, R., Bresin, E., Castelletti, F., Caprioli, J., Brioschi, S., Scheiflinger, F.,
Remuzzi, G.: Complement factor H mutation in familial thrombotic thrombocytopenic purpura with ADAMTS13 deficiency
and renal involvement. J Am Soc Nephrol 2005; 16:1177-1183.
5.
Galbusera, M., Bresin, E., Noris, M., Gastoldi, S., Belotti, D., Capoferri, C., Daina, E., Perseghin, P., Scheiflinger, F.,
Fakhouri, F., Grunfeld, J-P., Pogliani, E., Remuzzi, G.: Rituximab prevents recurrence of thrombotic thrombocytopenic
purpura: a case report. Blood 2005;106:925-928.
6.
Rieger, M., Mannucci, P.M., Kremer Hovinga, J.A., Herzog, A., Gerstenbauer, G., Konetschny, C., Zimmermann, K.,
Scharrer, I., Peyvandi, F., Galbusera, M., Remuzzi, G., Böhm, M., Plaimauer, B., Lämmle, B., Scheiflinger, F.: ADAMTS13
autoantibodies in patients with thrombotic microangiopathies and other immunomediated diseases. Blood 2005;106:12621267.
Susanna Tomasoni si è laureata in Scienze Biologiche nel 1991 presso l’Università degli Studi di
Milano.
Attività formative: nel 1989-1991 Studente tesista, Università degli Studi di Milano; nel 1991-1994
Studente di dottorato, Università degli Studi di Milano; nel 1994 Borsista, Renal Division, Brigham &
Women’s Hospital, Harvard Medical School, Boston, USA; nel 1995 Titolo di Dottore in Ricerca in
Scienze Fisiologiche, Università di Bologna; nel 1995-1998 Borsista, IRFMN, Bergamo.
Aree di interesse: costruzione di vettori adenovirali per terapia genica; trasferimento genico al rene nel
contesto del trapianto; trasfezione di cellule dendritiche per terapia cellulare applicata al trapianto;
progressione delle malattie renali.
Ruoli: 1998-2000: Ricercatrice, IRFMN, Bergamo. Dal 2000: Capo Unità di terapia genica, IRFMN,
Bergamo.
Principali pubblicazioni:
1. Tomasoni S, Azzollini N, Casiraghi F, Capogrossi M C, Remuzzi G, Benigni A. CTLA4Ig gene transfer prolongs survival and
induces donor-specific tolerance in a rat renal allograft. J Am Soc Nephrol 2000; 11: 747-752.
2. Tomasoni S, Benigni A. Gene therapy: How to target the kidney. Promises and pitfalls. Curr Gene Ther 2004; 4: 115-122.
3. Tomasoni S, Longaretti L, Azzollini N, Gagliardini E, Mister M, Buehler T, Remuzzi G, Benigni A. Favorable effect of
cotransfection with TGF-beta and CTLA4Ig of the donor kidney on allograft survival. Am J Nephrol 2004; 24: 275-283
4. Morigi M, Imberti B, Zoja C, Corna D, Tomasoni S, Abbate M, Rottoli D, Angioletti S, Benigni A, Perico N, Alison
M, Remuzzi G. Mesenchymal stem cells are renotropic, helping to repair the kidney and improve function in acute renal
failure. J Am Soc Nephrol 2004; 15: 1794-1804
5. Benigni A, Gagliardini E, Tomasoni S, Abbate M, Ruggenenti P, Kalluri R, Remuzzi G. Selective impairment of gene
expression and assembly of nephrin in human diabetic nephropathy. Kidney Int 2004; 65: 2193-2200.
6. Tomasoni S, Aiello S, Cassis L, Noris M, Longaretti L, Cavinato R, Azzollini N, Pezzotta A, Remuzzi G, Benigni A. Dendritic
cells genetically engineered with adenoviral vector encoding dnIKK2 induce the formation of potent CD4+ T-regulatory cells.
Transplantation 2005; 79: 1056-1061.
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IRFMN
INTRODUZIONE ALLE ATTIVITA' DEL DIPARTIMENTO
Il Dipartimento di Medicina Molecolare è stato istituito nel 1999 presso i laboratori del Mario
Negri di Bergamo con lo scopo di coordinare il lavoro di tre laboratori e tre unità.
L’attività del Dipartimento di Medicina Molecolare è strettamente collegata a quella del
Dipartimento di Medicina Renale del Centro di Ricerche Cliniche per le Malattie Rare “Aldo e
Cele Daccò”.
Questi i principali obiettivi del Dipartimento:
1) Identificazione di mediatori e di meccanismi d’azione responsabili della perdita irreversibile
di funzionalità renale nelle malattie renali; sviluppo di strategie terapeutiche volte a rallentare o
bloccare la progressione della malattia renale verso l’insufficienza renale terminale.
2) Analisi dei processi responsabili del danno della cellula endoteliale nelle microangiopatie
trombotiche e nel rigetto iperacuto dei trapianti allogenici.
3) Sviluppo di nuove strategie, tra cui la terapia genica, per modulare la risposta immunitaria
post-trapianto e per prevenire il rigetto acuto e cronico del trapianto d’organo; studio di possibili
vie immunologiche che portino alla tolleranza dell’organo trapiantato.
4) Studio delle basi molecolari e genetiche di malattie rare come la sindrome emolitico uremica/
porpora trombotica trombocitopenica e la preeclampsia; valutazione di alterazioni genetiche
responsabili dello sviluppo di malattie rare e caratterizzazione di polimorfismi genetici che
predicono la risposta dei pazienti alla terapie farmacologiche per malattie mono e poligeniche.
Questi obiettivi sono perseguiti grazie all’impiego di svariati approcci metodologici:
1) modelli sperimentali di malattie renali, di tipo immunologico e non, rappresentativi di
malattie umane, per studiare i mediatori vasoattivi e infiammatori e per testare nuovi farmaci
che riducano la proteinuria e conferiscano renoprotezione.
2) Valutazione “in vitro” dell’effetto tossico di un sovraccarico proteico su colture di cellule
renali.
3) Modelli “in vitro” per studiare l’interazione delle cellule dell’endotelio vascolare con
leucociti e piastrine in condizioni di flusso controllato.
4) Modelli sperimentali di allotrapianto di rene per studiare i processi immunologici
responsabili del rigetto acuto e cronico, la tossicità renale di farmaci immunosoppressori e per
identificare strategie di induzione della tolleranza.
5) Trasferimento genico di costrutti virali contenenti geni per molecole immunomodulatorie
come strategia per impedire il rigetto acuto del trapianto e ridurre o evitare la terapia
immunosoppressiva.
6) Analisi di linkage, ricerca di mutazioni e studio di polimorfismi genetici per identificare i
geni responsabili o predisponenti allo sviluppo di malattie genetiche rare.
RAPPORTO ATTIVITA’
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IRFMN
SCOPERTE/RISULTATI PRINCIPALI
La progressione della nefropatia diabetica sperimentale è rallentata dal trattamento con anticorpi
anti-TGF beta. L’effetto renoprotettivo dipende dalla fase della malattia in cui la terapia ha
inizio.
Nuovo meccanismo molecolare responsabile dell’effetto renoprotettivo di pioglitazone.
L’eccessivo carico di proteine induce un’alterazione del citoscheletro dei podociti che attiva il
gene dell’endotelina.
Xenoanticorpi e complemento provocano l’attivazione delle cellule endoteliali e la formazione
di trombi indipendentemente dall’attivazione piastrinica.
Le cellule staminali mesenchimali proteggono le cellule epiteliali del tubulo prossimale in
risposta al danno da cisplatino in un modello in vitro.
Cellule dendritiche rese immature dopo manipolazione genetica per bloccare l’NF-kB inducono
la formazione di cellule T regolatorie che sono in grado di prolungare la sopravvivenza del
trapianto di rene allogenico.
La tolleranza indotta nell’animale dall’infusione pretrapianto di leucociti mononucleati isolati
dal sangue del donatore è mediata dalla formazione di cellule T regolatorie donatore specifiche.
Il rigetto acuto del trapianto è dovuto alla presenza di cellule T della memoria.
Mutazioni in geni per ADAMTS13 e fattore H predispongono alla manifestazione della porpora
trombotica trombocitopenica (PTT) familiare.
Lo screening delle mutazioni dei geni del fattore H (CFH), il fattore I (IF) e la proteina cofattore
di membrana (MCP) aiuta a prevedere l’esito di trapianto di rene in pazienti con forme di SEU
non causate da Stx toxin (Stx).
RAPPORTO ATTIVITA’
7
2005
IRFMN
COLLABORAZIONI NAZIONALI
International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology, Molecular Medicine Group,
Trieste
U.O. di Ostetricia e Ginecologia, Ospedale San Gerardo di Monza
U.O. di Ostetricia e Ginecologia, Azienda Ospedaliera Ospedali Riuniti di Bergamo
I.R.C.C.S. Ospedale Pediatrico Bambino Gesù, Roma
I.R.C.C.S. Policlinico San Matteo, Pavia
Azienda Sanitaria Ospedaliera O.I.R.M. - S. Anna, Torino
U.O. Reumatologia, Azienda Ospedaliera Spedali Civili di Brescia
COLLABORAZIONI INTERNAZIONALI
Academisch Ziekenhuis Maastricht, Interne Geneeskunde, Maastricht, Olanda
Beth Israel Deaconess Medical Center and Harvard Medical School, Boston, USA
Children's Hospital and Regional Medical Center, University of Washington, Seattle, USA
Erasmus University of Rotterdam, Olanda
Hans-Knoll Institute for Natural Products Research, Jena, Germania
Inselspital, University of Bern, Svizzera
INSERM, Paris, Francia
Max Delbruck Center for Molecular Medicine, Berlin, Germania
Monash Medical Center, Melbourne, Australia
National Institute of Health, Bethesda, USA
Osaka University School of Medicine, Osaka, Giappone
Pediatric Nephrology and Hypertension, University of Utah, USA
Rosalind Franklin University of Medicine and Science, Chicago, USA
The Scripps Research Institute, La Jolla, USA
Universitaet Hamburg, Institut fur Molekulare Neuropathobiologie, Hamburg, Germania
University of Colorado Cardiovascular Institute, Denver, USA
University of Groningen, Olanda
University of Pittsburgh School of Medicine, Pittsburgh, USA
PRESENZA IN COMITATI EDITORIALI
Kidney International (Ariela Benigni)
Journal of American Society of Nephrology (Carla Zoja)
RAPPORTO ATTIVITA’
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2005
IRFMN
ATTIVITA' DI REVISIONE
American Journal of Pathology
American Journal of Physiology-Renal Physiology
American Journal of Transplantation
Blood
Cancer Research
Clinical Journal of American Society of Nephrology
Current Diabetes Reviews
Diabetes
Experimental Biology and Medicine
Export Review of Cardiovascular Therapy
Kidney International
Journal of American Society of Nephrology
Journal of Clinical Investigation
Journal of Immunology
Molecular Therapy
Nature Medicine
Nephrology, Dialysis and Transplantation
Nephron
New England Journal of Medicine
PloS Medicine
Renal Failure
The Lancet
Transplantation
Thrombosis and Haemostasis
Thrombosis Research
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IRFMN
PARTECIPAZIONE AD EVENTI CON CONTRIBUTI DEL
DIPARTIMENTO
Telethon Scientific Convention - 6-8 Marzo, 2005 - Salsomaggiore Terme, Parma
European School of Human Genetic- 5th Course of Bioinformatics, 20 Marzo, Bertinoro di
Romagna, Forlì,
Specialized course on renal transplant: nephroprotection. “Goals and achievements of intragraft
gene therapy”, 8-9 aprile 2005, Ranica (Bergamo), Italy.
Keystone Symposium “Roles of TGF-beta in disease pathogenesis: novel therapeutic
strategies”. “Role of anti-TGF-beta antibodies in treatment of glomerular injury” 28 marzo-2
aprile 2005, Keystone, Colorado, USA.
International Workshop on Regenerative Medicine, 21 aprile 2005, ISMETT Palermo
Simposio: Sperimentazione “in vitro” e “in vivo”. Percorsi complementari nella ricerca
biomedica. 12-13 maggio 2005, Milano
European School of Human Genetic- 18th Congress of Medical Genetics, 15 Maggio,, Bertinoro
di Romagna, Forlì
Fifth Bari International Conference on Hemophilia and Allied Disorders, von Willebrand factor
(including ADAMTS-13) and Platelet Glycoproteins –22-25 Maggio, 2005 - Vieste del
Gargano, Foggia
9th Basic Science Symposium of the Transplantation Society, “Dendritic cells (DCs) genetically
engineered to block NF-kB Pathway induce the formation of potent T regulatory cells (Treg)”
19-22 Giugno, La Baule, Francia
18th Congress of the International Society of Nephrology, “Genetics of Haemolytic Uremic
Syndrome (HUS)”, 26-30 Giugno 2005, Singapore.
3rd World Congress of Nephrology. 26-30 June 2005, Singapore
10th European Meeting on Complement in Human Disease, “Combined mutations in factor H
(CFH) and membrane cofactor protein (MCP) in Haemolytic Uremic “Syndrome (HUS) “,
“Mutations in complement receptor 1 (CR1) gene in recurrent Thrombotic Thrombocytopenic
Purpura (TTP)”, 9-13 Settembre 2005, Heidelberg, Germania.
Ninth International Conference on Endothelin (ET-9). “Endothelin as a critical mediator of renal
function and failure” , 11-14 settembre 2005, Park City, Utah.
Joint mini-symposia Weizman-Mario Negri Institite, 27-29 settembre 2005, Rehovot, Israel.
38th Annual American Society of Nephrology Meeting. “Transcriptional regulation of nephrin
gene by peroxisome proliferator activated receptor-gamma agonists: molecular mechanism of
the antiproteinuric effect of pioglitazone”, 10-13 novembre 2005, Philadelphia, USA.
RAPPORTO ATTIVITA’
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2005
IRFMN
Genzyme Renal Innovation Program Meeting, ‘Role of complement in tubulointerstitial injury
of proteinuric nephropathy’. 13-14 novembre 2005, Philadelphia, U.S.A.
XVIII Corso di aggiornamento in Nefrologia Medica. Progressione del danno cardiovascolare e
renale. Confronto tra diverse culture. 25-26 novembre 2005, Milano.
CONTRIBUTI E CONTRATTI
Associazione Amitiè Sans Frontieres Onlus
Associazione Ricerca Trapianti
Comitato Telethon Fondazione ONLUS
Commissione Europea
Fondazione Aiuti per la Ricerca sulle Malattie Rare
Fondazione Cariplo
Istituto Superiore di Sanità
Johnson & Johnson Pharmaceutical
Roche Organ Transplantation Research Foundation
Amgen Inc
ACRAF (Aziende Chimiche Riunite Angelini Francesco Spa)
AstraZeneca Ltd
Cyclacel Ltd
Farmaceutici Damor Spa
Genzyme Corporation
Novartis Farma SpA
SPA - Società Prodotti Antibiotici SpA
Speedel Pharma Ltd
Takeda Italia Farmaceutici SpA
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2005
IRFMN
SELEZIONE PUBBLICAZIONI SCIENTIFICHE APPARSE
NELL'ANNO 2005
M. Galbusera, S. Buelli, S. Gastoldi, D. Macconi, S. Angioletti, C. Testa, G. Remuzzi, M. Morigi. Activation of
porcine endothelium in response to xenogeneic serum causes thrombosis independently of platelet activation.
Xenotransplantation 2005:12;110-120.
P. Boccardo, G. Remuzzi, M. Galbusera. Platelet Dysfunction in Renal Failure. Seminars in Thrombosis and
Haemostasis 2005;30:579-589.
D. Cugini, N. Azzollini, E. Gagliardini, P. Cassis, R. Bertini, F. Colotta, M. Noris, G. Remuzzi, A. Benigni.
Inhibition of the chemokine receptor CXCR2 prevents kidney graft function deterioration due to
ischemia/reperfusion. Kidney Int 2005;67:1753-1761
M. Morigi, S. Buelli, S. Angioletti, C. Zanchi, L. Longaretti, C. Zoja, M. Galbusera, S. Gastoldi, P. Mundel, G.
Remuzzi, A. Benigni. In response to protein load podocytes reorganize cytoskeleton and modulate endothelin-1 gene:
implication for permselective dysfunction of chronic nephropathies. Am J Pathol 2005;166:1309-1320
G. Remuzzi, P. Ruggenenti, M. Colledan, B. Gridelli, A. Bertani, P. Bettinaglio, S. Bucchioni, A. Sonzogni, E.
Bonanomi, V. Sonzogni, J.L. Platt, N. Perico, M. Noris. Hemolytic uremic syndrome: a fatal outcome after kidney
and liver transplantation performed to correct factor H gene mutation. Am J Transpl 2005;5:1146-1150.
R. Aparecida Cavinato, F. Casiraghi, N. Azzollini, P. Cassis, D. Cugini, M. Mister, A. Pezzotta, S. Aiello, G.
Remuzzi, M. Noris. Pretransplant donor peripheral blood mononuclear cells infusion induces transplantation
tolerance by generating regulatory T cells. Transplantation 2005;79:1034-1039.
S. Tomasoni, S. Aiello, L. Cassis, M. Noris, L. Longaretti, R.A. Cavinato, N. Azzollini, A. Pezzotta, G. Remuzzi, A.
Benigni. Dendritic cells genetically engineered with adenoviral vector encoding dnIKK2 induce the formation of
potent CD4+ T-regulatory cells. Transplantation 2005;79:1056-1061.
M. Noris, S. Bucchioni, M. Galbusera, R. Donadelli, E. Bresin, F. Castelletti, J. Caprioli, S. Brioschi, F. Scheiflinger,
G. Remuzzi. Complement factor H mutation in familial thrombotic thrombocytopenic purpura with ADAMTS13
deficiency and renal involvement. J Am Soc Nephrol 2005;16:1177-1183.
P. Hill, E. Gagliardini, P. Ruggenenti, G: Remuzzi. Severe early humoral rejection resulting in allograft loss in a renal
transplant recipient with Campath-1H induction therapy. Nephrol Dial Transplant 2005;20:1741-1744.
P. Boccardo, C. Zoja, G. Remuzzi: Coagulation disorders. In: Oxford Textbook of Clinical Nephrology (Third
Edition), edit by: M. Davison, J. S. Cameron, J-P. Grunfeld, C. Ponticelli, E. Ritz, C. G. Winearls and C. van
Ypersele 2005;3: 1875-1878.
C. Zoja, M. Campana, D. Corna, S. Tomasoni, E. Garofano, C. Zanchi, E. Gagliardini, T. Ito, G. Remuzzi, A.
Benigni. Transcriptional regulation of nephrin gene by peroxisome proliferator activated receptor-y (PPAR-y)
agonists: molecular mechanism of the antiproteinuric effect of pioglitazone. 38th Annual Meeting of the American
Society of Nephrology. Philadelphia, Pennsylvania, November 8-13, 2005.
A. Pezzotta, M. Mister, P. Cravedi, N. Azzolini, L. Cassis, V. Ruggiero, R. De Santis, P. Carminati, G. Remuzzi, M.
Noris. Effect of a novel immunosuppressant, ST1959, on the immune system and renal allograft survival in rats.
Transplantation 2005;80:231-236.
RAPPORTO ATTIVITA’
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2005
IRFMN
ATTIVITA' DI RICERCA
Laboratorio di Biologia Cellulare e Xenotrapianto
L’attivazione dell’endotelio porcino in risposta a siero xenogenico causa
trombosi indipendentemente dall’attivazione piastrinica
In collaborazione con il Dipartimento di Ingegneria Biochimica, Laboratorio di Biofisisca
Renale
L’attivazione delle cellule endoteliali e la trombosi microvascolare sono caratteristiche del
rigetto iperacuto in seguito a xenotrapianto. I fattori principali che stanno alla base
dell’interazione piastrine-endotelio e della formazione di trombi sono tuttavia poco conosciuti.
Questo studio ha valutato come il complemento in vitro modula l’interazione tra l’endotelio
porcino e le piastrine umane in un modello vascolare di xenotrapianto in condizioni di flusso
usando livelli di shear stress tanto alti da mimare quelli presenti a livello della
microcircolazione. I risultati hanno mostrato che concentrazioni sublitiche di siero umano
(xenogenico), ma non di siero porcino, promuovevano l’adesione piastrinica e la formazione di
trombi su cellule endoteliali porcine (PAEC) in coltura in condizioni di flusso. Le piastrine
aderivano principalmente sulla superficie delle cellule endoteliali poiché l’integrità cellulare era
completamente preservata dopo la perfusione con il sangue. Bloccando l’attivazione e la
deposizione del complemento sulle PAEC con sCR1, una proteina ricombinante che inibisce la
cascata del complemento a livello di C3 e C4, veniva completamente inibita la formazione di
trombi sulle cellule endoteliali indotta dal siero umano. Le piastrine attivate non erano in grado
né di promuovere la formazione di trombi su cellule endoteliali in condizioni di controllo né di
aumentare ulteriormente la deposizione piastrinica su PAEC stimolate con siero xenogenico
dimostrando che l’endotelio attivato gioca un ruolo principale nel processo trombotico. Per
identificare le proteine adesive coinvolte nell’interazione endotelio-piastrine, abbiamo valutato
il ruolo del recettore per la vitronectina e di P-selettina che potrebbero agire come ligandi
endoteliali per il fattore di von Willebrand. I risultati hanno mostrato che il siero umano
aumentava l’espressione sulla superficie cellulare del recettore per la vitronectina e di Pselettina e che un loro blocco funzionale grazie all’utilizzo di anticorpi specifici preveniva la
deposizione piastrinica e la formazione di trombi. Questi dati suggeriscono che le molecole
adesive endoteliali hanno un ruolo diretto nei processi trombotici. Inoltre abbiamo documentato
che la produzione di perossido d’idrogeno da parte delle PAEC aumentava significativamente in
condizioni xenogeniche. Sostanze antiossidanti e sCR1 prevenivano completamente la
formazione di trombi riducendo sia l’eccessiva produzione di specie reattive dell’ossigeno che
l’espressione del recettore per la vitronectina e di P-selettina. Questi risultati ci permettono di
comprendere meglio la patofisiologia della trombosi microvascolare nel rigetto in seguito a
xenotrapianto e ci aiutano adidentificare possibili interventi terapeutici mirati a bloccare
l’attivazione dell’endotelio senza compromettere la funzionalità piastrinica.
Le cellule staminali mesenchimali stimolano la proliferazione delle cellule
epiteliali del tubulo prossimale in risposta al danno da cisplatino
In collaborazione con l’Unità di Terapia Genica
Abbiamo recentemente documentato che cellule staminali mesenchimali (MSC) isolate dal
midollo osseo e iniettate in topi con insufficienza renale acuta indotta da cisplatino
proteggevano dalla perdita della funzione renale e dal danno tubulare. Le cellule staminali
mesenchimali migrando nel tessuto renale danneggiato, erano in grado di differenziarsi in
cellule epiteliali tubulari e di accelerare la rigenerazione tubulare in risposta al danno indotto da
cisplatino. Sulla base dei dati ottenuti nel modello animale, abbiamo voluto studiare i
meccanismi alla base dell’effetto protettivo delle MSC, mettendo a punto un modello in vitro di
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2005
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tossicità da cisplatino sulle cellule prossimali tubulari epiteliali (PTEC). PTEC sono state
esposte a cisplatino per 6 ore e la vitalità cellulare è stata analizzata a diversi intervalli di tempo.
La massima tossicità del cisplatino è stata osservata dopo 4 giorni dall’incubazione (75% di
mortalità). Quando le MSC sono state messe in co-coltura per 4 giorni con PTEC pre-trattate
con ciplatino, il numero totale delle cellule è aumentato significativamente. Per identificare la
natura delle cellule che proliferavano, le cellule tubulari sono state marcate con
bromodeossiuridina prima del trattamento con cisplatino e della co-cultura con MSC. L’analisi
citofluorimetrica ha indicato che le cellule tubulari positive per il BrdU ed esposte al cisplatino
raddoppiavano di numero dopo 4 giorni di co-coltura con le MSC. Usando un sistema di
Transwell nel quale le due popolazioni cellulari sono fisicamente separate da una membrana
porosa, abbiamo osservato che le MSC stimolavano la proliferazione delle cellule tubulari senza
bisogno del contatto cellula-cellula, suggerendo probabilmente il coinvolgimento di fattori
solubili. Sono attualmente in corso esperimenti per identificare quali citochine o fattori di
crescita prodotti dalle MSC possano essere responsabili dell’effetto mitogenico sulle cellule
tubulari, con due diversi approcci metodologici. Gli esperimenti verranno effettuati utilizzando
anticorpi specifici in grado di bloccare l’attività delle citochine o trasfettando le MSC con small
interfering RNA (siRNA) in grado di inibire specificatamente l’espressione del RNA
messaggero. Tali tecniche saranno poi utilizzate in vivo per confermare il ruolo dei fattori
renoprotettivi nella rigenerazione delle cellule tubulari.
Laboratorio di Modelli Sperimentali di Malattie Renali
L’effetto renoprotettivo del trattamento con anticorpi anti-TGFbeta nella
nefropatia diabetica nel ratto dipende dalla fase della malattia in cui il
trattamento ha inizio
Abbiamo precedentemente documentato che in un modello di diabete accelerato nel ratto
caratterizzato da massima attivazione del sistema renina-angiotensina indotta da nefrectomia
unilaterale, il trattamento in fase tardiva della malattia con un anticorpo anti-TGFbeta limitava il
danno renale purchè in associazione con ACE inibitore. Nel presente studio abbiamo valutato se
nel modello di diabete “due reni “ il tempo di inizio del trattamento possa influenzare la risposta
all’inibizione di TGFbeta. Si è studiato l’effetto sulla proteinuria e il dannno renale di
trattamento precoce e tardivo con un anticorpo diretto contro le tre isoforme di TGFbeta.
L’ACE inibitore enalapril è stato utilizzato per confronto quale terapia renoprotettiva standard.
Ratti resi diabetici mediante iniezione di streptozotocina, dopo 27 settimane, quando
presentavano lieve proteinuria, sono stati trattati fino a 52 settimane (trattamento precoce) con:
anticorpo irrilevante (13C4), anticorpo anti-TGFbeta murino, 1D11, (0.5 mg/kg i.p- 3 volte alla
settimana), enalapril (5mg/kg p.o). Il trattamento con 1D11 aveva potente effetto
antiproteinurico e antiipertensivo. Il grado di glomerulosclerosi era ridotto significativamente:
dopo il trattamento si osservava un’alta percentuale di glomeruli non affetti da sclerosi. Il
numero di podociti, ridotto negli animali diabetici, era normalizzato da 1D11. L’effetto
renoprotettivo di 1D11 era paragonabile a quello ottenuto dopo terapia con enalapril. Quando i
ratti venivano trattati con 1D11 o enalapril in una fase di malattia conclamata, da 52 fino a 61
settimane (trattamento tardivo), nonostante uno stretto controllo della pressione sistolica, i
farmaci non erano in grado di ridurre in maniera significativa la proteinuria. Glomerulosclerosi
e perdita dei podociti erano limitati solo parzialmente. Una completa protezione veniva invece
ottenuta con il trattamento combinato di 1D11 ed enalapril. In conclusione, l’effetto
renoprotettivo di anticorpo anti-TGFbeta dipende in maniera cruciale dal tempo di inizio della
terapia. L’efficacia del trattamento precoce con 1D11 sulla progressione della malattia renale
indica che il TGFbeta è un mediatore importante di danno nella fase iniziale del diabete. Per
arrestare il danno renale nella fase conclamata della nefropatia diabetica sperimentale è
necessario combinare 1D11 con ACE inibitore.
RAPPORTO ATTIVITA’
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2005
IRFMN
Meccanismi molecolari coinvolti nell’effetto antiproteinurico di
pioglitazone: regolazione trascrizionale del gene della nefrina
In collaborazione con l’Unità di Terapia Genica
PPAR-gamma è un recettore nucleare che gioca un ruolo critico nell’adipogenesi e nella
sensibilità all’insulina. Evidenze suggeriscono inoltre un’azione diretta su sistemi intracellulari
coinvolti nella proliferazione cellulare, infiammazione e produzione di matrice extracellulare.
PPAR-gamma è attivato da ligandi come i tiazolidinedioni, una classe di farmaci antidiabetici a
cui appartiene il pioglitazone. Abbiamo valutato l’effetto renoprotettivo di pioglitazone in un
modello immunologico di nefropatia progressiva, la nefrite passiva di Heymann (PHN), che
mima le fasi avanzate della nefropatia membranosa dell’uomo. L’antagonista del recettore di
angiotensina II candesartan è stato utilizzato per confronto quale terapia renoprotettiva standard.
I ratti PHN sono stati trattati per os con: veicolo, pioglitazone (10mg/kg b.i.d), candesartan
(1mg/kg b.i.d), combinazione dei due farmaci iniziando 2 mesi dopo l’induzione della malattia
quando gli animali avevano sviluppato severa proteinuria fino a 8 mesi. Pioglitazone aveva un
effetto antiproteinurico simile al candesartan riducendo del 50% i livelli di proteinuria rispetto
al veicolo. L’associazione dei farmaci era più efficace ed era in grado di ridurre la proteinuria a
livelli più bassi di quelli misurati prima del trattamento. La perdita della funzione renale era
limitata dai singoli trattamenti e ancora di più dalla combinazione. L’espressione del gene di
nefrina e della proteina era ridotta nel rene degli animali con PHN rispetto a ratti normali.
Pioglitazone e candesartan prevenivano parzialmente, ma significativamente, la perdita di
nefrina che era addirittura normalizzata dalla terapia combinata.
PPAR e recettori dell’acido retinoico (RXR) sono fattori trascrizionali che attivati dai ligandi
formano eterodimeri e modulano la trascrizione di geni bersaglio. Studi avevano dimostrato che
l’espressione del gene della nefrina è aumentata dai retinoidi. In questo lavoro abbiamo valutato
se anche pioglitazone fosse in grado di modulare la trascrizione del gene della nefrina. Cellule
tubulari HK-2 sono state trasfettate mediante SuperFect con plasmidi contenenti il gene della
luciferasi sotto diverse porzioni (2kb or 325bp) del promotore del gene della nefrina umana e
successivamente incubate con pioglitazone. Le porzioni del promotore contenevano possibili
sequenze di legame con PPAR/RXR. L’attività trascrizionale del gene della luciferasi
aumentava dopo 3 ore e l’espressione più elevata si otteneva con il frammento di 325bp.
L’effetto di pioglitazone era specifico dato che l’aumento dell’attività della luciferasi era
prevenuto da un antagonista sintetico di PPAR-gamma. In conclusione, in un modello
immunologico di nefropatia progressiva, pioglitazone esercita un importante effetto
antiproteinurico simile a quello dell’antagonista recettoriale di angiotensina II. L’aumento della
trascrizione del gene di nefrina grazie alla presenza nel suo promotore di specifiche sequenze di
legame per PPAR/RXR potrebbe essere il nuovo meccanismo molecolare responsabile
dell’effetto renoprotettivo degli agonisti di PPAR-gamma.
Evidenza di rigetto acuto dopo trattamento con campath-1H
Uno dei maggiori obiettivi nel campo dei trapianti è indurre la tolleranza dell’organo trapiantato
per evitare al paziente la dipendenza da farmaci immunosopressivi altamente tossici.
L’eliminazione dei T linfociti rappresenta una via per indurre tolleranza e può essere perseguita
attraverso l’utilizzo di campath-1H, un anticorpo monoclonale che riconosce CD52, antigene
presente sulla superficie di T e B linfociti, cellule natural killer e, in misura minore, di monociti.
Nel trapianto renale l’utilizzo del solo campath-1H si associa a una percentuale molto elevata di
rigetto acuto. Campath-1H somministrato come terapia d’induzione in combinazione a basse
dosi di diversi agenti immunosoppressivi risulta più efficace anche se sempre si associa a casi di
rigetto (da 9 a 27%). Il caso di una paziente è arrivato alla nostra osservazione. La paziente in
uno stadio terminale della malattia renale dovuta a glomerulonefrite mesangioproliferativa era
stata sottoposta a un trapianto di rene. Il trapianto era stato effettuato dopo infusione di
campath-1H e di metilprednisolone. Dopo una settimana dall’intervento era stato evidenziata
una perdita della funzionalità renale. L’analisi istologica aveva rivelato glomeruli con estesa
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IRFMN
trombosi ma senza accumulo di leucociti polimorfonucleati, necrosi tubulare acuta e accumulo
di C4d nei capillari peritubulari e glomerulari. Il quadro clinico era quello di un rigetto acuto
umorale. Dopo 30 giorni la paziente era stata sottoposta a nefrectomia. L’analisi istologica
aveva rivelato un quadro di rigetto acuto cellulare con presenza di un denso infiltrato
infiammatorio interstiziale e severa tubulite. I capillari peritubulari risultavano positivi per C4d.
Questo studio ha dimostrato che, nonostante la deplezione dei linfociti dal sangue periferico
indotta dal campath-1H, il rigetto acuto può comunque manifestarsi probabilmente grazie alla
presenza di cellule T della memoria che, come recentemente dimostrato, sono più resistenti al
trattamento.
Laboratorio di Immunologia e Genetica del Trapianto e Malattie
Rare
L’infusione pretrapianto di leucociti mononucleati isolati dal sangue del
donatore induce tolleranza al trapianto di rene attraverso la formazione di
linfociti T regolatori
Il nostro laboratorio aveva in precedenza documentato che una singola iniezione endovenosa
pretrapianto di leucociti mononucleati (PBMC) isolati dal sangue di ratti donatori in ratti
riceventi MHC-incompatibili era in grado di indurre tolleranza donatore-specifica a un
successivo trapianto di rene. Studi sperimentali in letteratura hanno suggerito che la tolleranza al
trapianto d’organo dipende dalla formazione di linfociti T con attività regolatrice (Treg).
Tuttavia sono stati riportati risultati controversi per quanto riguarda il fenotipo dei Treg e il loro
meccanismo d’azione, a seconda del modello sperimentale e del protocollo utilizzato per indurre
tolleranza. Questo studio è stato disegnato con i seguenti obiettivi:1) valutare se la tolleranza
indotta dall’infusione di PBMC del donatore fosse associata alla formazione di Treg; 2)
caratterizzare il fenotipo e la funzione di questi Treg ex vivo and in vivo; e 3) verificare se i
Treg si accumulano nell’organo trapiantato degli animali tolleranti.
Ratti Lewis (LW) sono stati resi tolleranti a un trapianto di rene Brown Norway attraverso
l’infusione pretrapianto di PBMC del donatore. A più di 90 giorni dal trapianto l’alloreattività
dei linfociti isolati dai linfonodi (LN) e dal rene trapiantato (GIL) degli animali riceventi è stata
valutata in reazioni linfocitarie miste (MLR), in MLR in co-coltura e in transwell. Il fenotipo dei
GIL è stato analizzato con il FACS. Inoltre abbiamo valutato, nei linfociti CD4+ isolati dai LN,
i livelli di mRNA per varie citochine e per altri markers di attività. Infine è stato valutato il
potere tollerogenico in vivo dei linfociti isolati dagli animali tolleranti, mediante la tecnica
dell’adoptive transfer in ratti naive.
I risultati ottenuti mostrano che i linfociti isolati dai LN degli animali tolleranti, hanno una
ridotta attività proliferativa nei confronti degli antigeni del donatore, mentre proliferano
normalmente se stimolati con antigeni third-party. In co-coltura questi linfociti mostrano attività
regolatrice in quanto sono in grado di inibire l’alloreattività di linfociti naive verso gli antigeni
del donatore, mentre non modificano la risposta verso gli antigeni third-party. L’espressione di
mRNA per interleuchina-10 e FasL è up-regolata nei linfociti CD4+ degli animali tolleranti,
tuttavia l’aggiunta di un anticorpo anti IL-10 alle co-colture blocca solo parzialmente l’attività
inibitrice dei Treg. L’attività immunoregolante dei Treg è concentrata nella sottopopolazione
CD4+ CD25+. In un sistema di co-cultura in transwell, i Treg degli animali tolleranti hanno una
minore capacità di inibire una MLR naive rispetto a una co-coltura standard. I Treg inoltre sono
in grado di trasferire in vivo la tolleranza se infusi in ratti riceventi naive. Le cellule CD4+
isolate dai reni trapiantati di animali tolleranti hanno una ridotta alloreattività verso gli antigeni
del donatore e inibiscono la risposta di linfociti naive. Questi risultati indicano che la
formazione di Treg donatore-specifici gioca un ruolo importante nella tolleranza al trapianto
indotta nel ratto dall’infusione di PBMC del donatore. L’attività regolatrice è concentrata nella
frazione CD4+ CD25+ e richiede il contatto tra cellula e cellula. Inoltre i Treg si accumulano
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2005
IRFMN
nell’organo trapiantato dove probabilmente giocano un ruolo protettivo nei confronti della
risposta immune dell’ospite.
Effetto della somministrazione di eritropoietina sui danni provocati dal
rigetto cronico in un modello di trapianto allogenico di rene nel ratto.
L’anemia è un fattore coinvolto nella progressione delle malattie renali croniche, a sostegno di
ciò è stato infatti dimostrato che nei pazienti la correzione dell’anemia tramite la
somministrazione di eritropoietina è in grado di assicurare una maggiore sopravvivenza e di
ritardare il ricorso alla dialisi.
Nel presente studio abbiamo valutato gli effetti protettivi dell’eritropoietina sui danni causati dal
rigetto cronico in un modello di trapianto allogenico di rene nel ratto. A tale scopo abbiamo
scelto una combinazione completamente MHC-incompatibile (Wistar Furth in Lewis).
Un gruppo di animali ha ricevuto l’eritropoietina murina (30_g/kg, dati il giorno del trapianto,
seguiti da una somministrazione di 2.5_g/kg ogni settimana) ed un secondo gruppo (controllo)
ha ricevuto solo veicolo (salina). Inoltre per prevenire il rigetto acuto dell’organo trapiantato, gli
animali sono stati trattati per i primi 10 giorni dopo il trapianto con ciclosporina
(5mg/kg/giorno, i.m.). Gli animali sono stati seguiti per 180 giorni fino al sacrificio.
L’ematocrito, l’emoglobina e la funzione renale (come cretinina sierica e proteinuria) sono state
monitorate periodicamente. Al sacrificio il rene è stato raccolto ed è stata effettuata l’analisi
istologica, immunoistochimica e l’espressione genica mediante real-time PCR quantitativa. I
risultati ottenuti dimostrano che la somministrazione di eritropoietina è in grado di correggere
l’anemia già a partire dal settimo giorno dopo il trapianto. La dose settimanale di eritropoietina
è stata di volta in volta modificata al fine di mantenere normali i livelli di emoglobina (14-17
gr/dl). Sebbene alla fine dello studio circa la metà degli animali, sia quelli trattati sia quelli
controllo, sono morti di uremia, solo gli animali trattati con eritropoietina sopravvissuti fino a
180 giorni mostrano una funzione renale normale. In questi animali anche la glomerulosclerosi,
il danno tubulointerstiziale e la presenza nel rene di cellule infiltranti infiammatorie (ED1+,
CD4+, CD8+, OX6+, OX62+) risultano minori rispetto a quelli riscontrati nei ratti controllo.
Per valutare se l’eritropoietina fosse in grado di indurre la produzione di fattori di crescita
coinvolti nella rigenerazione delle cellule dei tubuli e nell’angiogenesi, abbiamo analizzato
mediante real-time PCR l’espressione genica di EGF (epithelial growth factor) e VEGF
(vascular endothelial growth factor) nei reni degli animali sacrificati a 180 giorni.
Abbiamo osservato che nei reni degli animali controllo vi è una diminuzione dell’espressione di
EGF e VEGF rispetto ai livelli riscontrati negli animali che hanno ricevuto un trapianto
singenico. L’eritropoietina è in grado di correggere completamente il difetto, infatti gli animali
trattati con eritropoietina presentano livelli di espressione di EGF e VEGF paragonabili agli
animali isotrapiantati.
In conclusione abbiamo dimostrato che la somministrazione cronica di eritropoietina protegge il
rene trapiantato dallo sviluppo di danni cronici. Il meccanismo attraverso il quale
l’eritropoietina agisce potrebbe essere legato sia a una migliore perfusione dell’organo, data da
una completa correzione dell’anemia già nelle prime fasi dopo il trapianto, sia alla rigenerazione
dell’epitelio tubulare e all’angiogenesi microvascolare mediate dall’espressione di EGF e VEGF
nel rene.
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IRFMN
Mutazioni nel gene del fattore H del complemento in una paziente con
porpora trombotica trombocitopenica, deficit di ADAMTS13 e insufficienza
renale
La porpora trombotica trombocitopenica (PTT) è una malattia rara che coinvolge i vasi di
piccolo calibro ed è associata al deficit di ADAMTS13, la proteasi specifica per i multimeri del
fattore di von Willebrand. Questo deficit favorisce l’adesione e l’aggregazione piastrinica e la
formazione di trombi nei vasi della microcircolazione. La malattia si presenta con sintomi
prevalentemente a carico del sistema nervoso centrale, tuttavia sono stati riportati rari casi con
un importante coinvolgimento renale. Queste ultime forme sono spesso clinicamente
indistinguibili dai casi di sindrome emolitico uremica (SEU), un’altra microangiopatia
trombotica caratterizzata da un prevalente coinvolgimento renale. Nella maggior parte dei casi
la SEU è causata da particolari ceppi di E. coli che producono una potente tossina, la Shiga-like
toxin (Stx), e si manifesta inizialmente con una diarrea emorragica (Stx-SEU). Esistono tuttavia
rare forme di SEU che non sono causate da Stx (non-Stx-SEU) e possono insorgere all’interno
di famiglie o sporadicamente. Studi genetici recenti hanno documentato che mutazioni nel gene
del fattore H, una proteina plasmatica che ha un ruolo importante nel regolare l’attivazione della
cascata del complemento, possono predisporre allo sviluppo delle forme non-Stx di SEU.
In questo studio abbiamo valutato le basi genetiche dell’eterogeneità fenotipica della PTT.
Abbiamo studiato due sorelle con microangiopatia trombotica ma con manifestazioni cliniche
molto diverse: una aveva manifestato un severo coinvolgimento renale, mentre l’altra
presentava esclusivamente sintomi neurologici. Entrambe le pazienti avevano un deficit di
ADAMTS13 (con una attività proteasica nel plasma <6% del normale) a causa di due mutazioni
eterozigoti (che causano i cambi V88M e G1239V). Inoltre nella paziente che aveva sviluppato
insufficienza renale cronica, abbiamo trovato una mutazione eterozigote (che causa un cambio
S890I) nel gene del fattore H, mentre la sorella con soli sintomi neurologici non aveva
alterazioni nel fattore H. Questi risultati suggeriscono che mutazioni in geni diversi possano
contribuire a determinare il fenotipo della malattia nei soggetti portatori di mutazioni in
ADAMTS13. E’ da notare che all’interno di questa famiglia uno dei fratelli delle due pazienti,
un maschio adulto che non aveva mai manifestato segni della malattia, è risultato portatore delle
due mutazioni in ADAMTS13 e della mutazione nel fattore H, esattamente come la sorella
affetta, il che indica che tali mutazioni predispongono ma non causano direttamente la PTT e
che ulteriori fattori genetici e ambientali sono necessari perché la malattia si manifesti.
Esito del trapianto di rene nei pazienti con sindrome emolitico uremica
non associata a Shiga-toxin: significato prognostico delle alterazioni
genetiche
La sindrome emolitico uremica (SEU) è una malattia rara che si manifesta con un’anemia
emolitica microangiopatica, trombocitopenia e insufficienza renale. Nella maggior parte dei casi
la SEU è causata da particolari ceppi di E. coli che producono una potente tossina, la Shiga-like
toxin (Stx), e si presenta inizialmente con una diarrea emorragica (Stx-SEU). Esistono tuttavia
rare forme di SEU che non sono causate da Stx (non-Stx-SEU) e possono insorgere all’interno
di famiglie o sporadicamente. L’esito clinico di queste forme è sfavorevole, infatti circa il 50%
dei pazienti affetti sviluppa insufficienza renale terminale (ESRD) e il 25% muore durante la
fase acuta della malattia. Studi genetici recenti hanno documentato che mutazioni nei geni che
codificano per alcune proteine regolatrici della cascata del complemento, il fattore H (CFH) , il
fattore I (IF) e la proteina cofattore di membrana (MCP), una proteina plasmatica che ha un
ruolo importante nel regolare l’attivazione della cascata del complemento, possono predisporre
allo sviluppo delle forme non-Stx di SEU. Nei pazienti con non-Stx SEU che sviluppano ESRD,
il trapianto di rene spesso fallisce perchè la malattia si ripresenta sull’organo trapiantato. Per
questo motivo è sorto un dibattito acceso sulla possibilità che il trapianto di rene sia o no
appropriato in questi pazienti. Lo scopo del nostro studio è stato quello di identificare dei
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possibili fattori prognostici, che potessero aiutare a prevedere l’esito di un trapianto di rene in
pazienti con non-Stx-SEU. In particolare ci siamo focalizzati sulle anomalie genetiche associate
alla malattia. Abbiamo rivisto tutte le pubblicazioni in letteratura che descrivevano l’esito di
trapianti di rene in pazienti con ESRD-secondaria a non-Stx-SEU, che erano stati genotipizzati
per CFH, MCP and IF. Inoltre abbiamo esaminato i dati non pubblicati dei pazienti del nostro
Registro Internazionale della SEU/PTT ricorrente e familiare e di una coorte di pazienti
segnalata da un gruppo di ricercatori di Newcastle. I risultati ottenuti confermano che, se si
considerano insieme i dati di tutti i pazienti, l’esito del trapianto di rene è negativo: infatti il
60% dei pazienti ha avuto ricorrenza della malattia nel rene trapiantato e di questi il 91.6% ha
perso l’organo. Non abbiamo trovato alcun fattore clinico prognostico che potesse identificare i
soggetti a rischio di fallimento del trapianto. D’altra parte abbiamo osservato che la presenza di
una mutazione nel CFH era associata a un’ elevata incidenza di fallimento del trapianto (77.8%
vs. 54.9% nei pazienti senza mutazione al CFH). Poichè il CFH è una proteina plasmatica
prodotta principalmente dal fegato, il trapianto di rene non è in grado di correggerne il difetto
genetico e quindi la malattia si ripresenta sul rene trapiantato. Risultati simili sono stati osservati
nei pazienti con mutazioni al IF, un’altra proteina plasmatica sintetizzata dal fegato. D’altra
parte abbiamo osservato che tutti pazienti trapiantati portatori di mutazioni all’MCP (una
proteina di membrana altamente espresso nel rene) avevano avuto un esito favorevole,
mantenendo una buona funzionalità dell’organo per più di 10 anni dal trapianto. Questi risultati
potrebbero avere importanti implicazioni cliniche. I pazienti con non-Stx-SEU con ESRD
dovrebbero essere genotipizzati prima di decidere per un trapianto di rene: se il paziente
presenta mutazioni nei geni CFH o IF, il trapianto dovrebbe essere sconsigliato a causa
dell’elevato rischio di ricorrenza della malattia; d’altra parte, se il paziente è portatore di
mutazioni nel gene MCP è ragionevole ipotizzare che possa beneficiare di un trapianto di rene
in quanto a basso rischio di ricorrenze.
Unità di Terapia Genica
Cellule dendritiche rese immature mediante infezione con l’adenovirus
codificante per dnIKK2 inducono la formazione di linfociti T regolatori
In collaborazione con il Laboratorio di Immunologia e Genetica del Trapianto e Malattie Rare
Cellule dendritiche (DCs) immature caratterizzate da una bassa espressione sia di antigeni MHC
di classe II che di molecole di costimolazione, possono rappresentare un valido strumento per
indurre uno stato di tolleranza periferica. Abbiamo precedentemente dimostrato che un
adenovirus codificante per la forma dominante negativa della chinasi IKK2, chiamato AdVIKK2, era in grado di bloccare l’attivazione dell’NF-kB e inibiva la maturazione delle cellule
dendritiche. Abbiamo successivamente valutato se dnIKK2-DCs erano in grado di generare
cellule T regolatrici durante una reazione leucocitaria mista (MLR) primaria. Abbiamo
osservato che le dnIKK2-DCs bloccavano la proliferazione di cellule T naïve allogeniche sia in
un rapporto DC/T di 1/100 che di 1/1000. Al termine dell’MLR primaria le cellule T avevano
acquisito un fenotipo CD4+/CD25-/dim, esprimevano alti livelli di IL10 e TGF-beta, livelli
intermedi di interferon-gamma e IL2 e livelli non rilevabili di IL4. I linfociti T, pre-esposti a
dnIKK2-DCs, non erano in grado di proliferare in presenza di uno stimolo secondario dato da
DCs infettate con un adenovirus di controllo, AdV0-DCs. Inoltre messi in co-coltura, i linfociti
T pre-esposti a dnIKK2-DCs bloccavano la proliferazione di linfociti T naïve fino a un rapporto
Treg/T naïve di 1/1000, proliferazione che non veniva ripristinata dall’aggiunta di IL2.
L’inibizione permaneva anche in assenza di contatto tra Treg e linfociti T naïve suggerendo che
regolazione sia legata alla produzione di fattori solubili. Stiamo ora cercando di identificare i
fattori solubili responsabili dell’effetto immunosoppressore.
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