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Profilo di espressione
genica nelle sindromi
mielodisplastiche
Andrea Pellagatti
LRF Molecular Haematology Unit
John Radcliffe Hospital
Oxford
Sindromi mielodisplastiche (MDS)
- Gruppo eterogeneo di disordini clonali della
cellula staminale ematopoietica
- Midollo osseo ipercellulare, citopenia periferica,
ematopoiesi inefficace, frequente evoluzione in
leucemia mieloide acuta
- Terapia di supporto (trasfusioni di sangue) e’
la cura standard
MDS - scopi degli studi basati su
profilo di espressione genica
• Profilo di espressione genica (GEP): uso di microarrays
per misurare il livello di espressione di migliaia di geni
in un signolo esperimento
- Identificazione di geni differenzialmente espressi
- Identificazione di pathways deregolati
- Identificazione di nuovi marcatori diagnostici e
prognostici, e di bersagli terapeutici
- Miglior comprensione della patofisiologia delle MDS
GEP in MDS
• le MDS sono molto eterogenee e includono
pazienti con vari sottotipi e cariotipi
• e’ necessario studiare un ampio numero di
pazienti per ottenere conclusioni solide sulla
deregolazione dell’espressione genica
GEP nelle MDS – primi studi
• Miyazato et al, Blood 2001:
5 MDS
• Hofmann et al, Blood 2002:
19 MDS
• Ueda et al, BJH 2003:
16 MDS
• Chen et al, Blood 2004:
10 MDS
• Sternberg et al, Blood 2005: 14 MDS
GEP su larga scala nelle MDS
• Pellagatti et al, Blood 2006
55 pazienti MDS e 11 controlli
• 183 pazienti MDS e 17 controlli
• cellule CD34+ separate da midollo osseo
• Campioni ibridizzati su Affymetrix GeneChip
Human Plus 2.0 arrays (47,000 trascritti,
39,000 geni)
Affymetrix Microarrays
2x
Biotin
Biotin
RT
IVT
Biotin
Hybridize
Scan
Biotin
Biotin
CD34+
RNA totale cDNA
cRNA
Affymetrix
microarray
Immagine
Analisi dei dati
• immagini dei microarrays acquisite e
quantificate con GeneChip Operating
Software (GCOS)
• normalizzazione e analisi dei dati con
GeneSpring 7.3 software
• analisi dei pathways deregolati con
Ingenuity Pathway Analysis software
Geni up-regolati
• 35 geni con ratio paziente / controlli > 2.0 in almeno 92 / 183 pazienti
Affy ID
Gene
Localizzazione
No. di pazienti con
up-regolazione
up-regolazione (>2-fold, N=183)
203819_s_at
IMP-3
7p11
130
203153_at
IFIT1
10q25-q26
127
214414_x_at
HBA2
16p13.3
120
209560_s_at
DLK1
14q32
116
213515_x_at
HBG1 ; HBG2
11p15.5
116
206772_at
PTHR2
2q33
115
214022_s_at
IFITM1
11p15.5
113
204439_at
IFI44L
1p31.1
112
229450_at
IFIT3
10q24
110
209116_x_at
HBB
11p15.5
107
• frequente up-regolazione nelle MDS di geni stimolati dall’interferone (ISGs)
• analisi dei pathways: il pathway di trasduzione del segnale dell’interferone
e’ risultato quello piu’ significativamente deregolato (p=0.00006)
Livello di espressione di geni
stimolati dall’interferone (ISGs)
•
i profili di espressione genica dei pazienti con MDS
hanno caratteristiche comuni a quelli di cellule
CD34+ normali stimolate con interferone gamma
•
Zeng et al (Blood 2006) – 22 ISGs up-regolati in
cellule CD34+ normali stimolate con interferone
gamma; 15 di questi 22 ISGs sono risultati upregolati nel nostro gruppo di pazienti con MDS
•
ISGs tra cui IFITM1 mediano gli effetti di inibizione
della crescita derivanti dall’interferone gamma
•
l’up-regolazione degli ISGs potrebbe essere alla
base di alcune caratteristiche ematologiche delle
MDS, quali le citopenie periferiche
Geni down-regolati
• 139 geni con ratio paziente / controlli < 0.5 in almeno 92 / 183 pazienti
Affy ID
Gene
Localizzazion
e
No. di pazienti con downregolazione (>2-fold, N=183)
1556599_s_at
ARPP21
3p22.3
168
241679_at
AKAP12/gravin
6q24-q25
164
1568611_at
P4HA2
5q31
161
206637_at
P2RY14
3q21-q25
160
208285_at
OR7A5
19p13.1
159
208650_s_at
CD24
6q21
158
1563849_at
SH2D4B
10q22.3
157
243362_s_at
LEF1
4q23-q25
157
205297_s_at
CD79B
17q23
156
221349_at
VPREB1
22q11.2
156
- gravin e’ down-regolata in vari tipi di tumore tra cui prostata,
mammella, oltre che MDS, AML, CML
MDS - progressione

modello di trasformazione leucemica

progressione “step-wise”
RA
RAEB I
RAEB II
AML
• mancanza di marcatori molecolari associati
a prognosi e progressione della malattia
Clustering gerarchico RA-RAEB2
55 pazienti con RA
vs
43 pazienti con RAEB2
(P-value<0.01)
1,225
geni differenzialmente
espressi e significativi
• la maggior parte dei
casi con RAEB2
mostra un profilo di
espressione simile
RA
RAEB2
RA vs RAEB2 – geni differenzialmente
espressi piu’ significativi
Gene
P-value
Ratio media
MDS RA
Ratio media
MDS RAEB2
LEF1
4.15 x 10-12
0.37
0.07
4q23-q25
CASC5
7.09 x 10-9
0.95
0.51
15q14
RBBP8
6.75 x 10-7
0.95
0.59
18q11.2
RFC3
6.75 x 10-7
1.14
0.66
13q12.3-q13
CDC6
6.75 x 10-7
0.94
0.41
17q21.3
Localizzazione
• LEF1 e’ importante per la granulopoiesi dei neutrofili, ed e’
down-regolato o assente in pazienti con neutropenia congenita
• CASC5 e’ un gene candidato per la suscettibilita’ al cancro
• RBBP8 e’ coinvolto nel controllo dei checkpoint del ciclo
cellulare dopo induzione di danno al DNA alla transizione G2/M
RAEB2 e’ associato con bassi
livelli di LEF1
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
LEF1
RA
RAEB2
Down-regolazione di LEF1 e’ associata con
l’evoluzione della malattia nelle MDS
•
LEF1 e’ il gene differenzialmente espresso piu’
significativo tra casi di MDS iniziale e avanzata
•
marcata down-regolazione di LEF1 (>10-fold) in 27 su 32
pazienti con MDS avanzata e solo in 6 su 35 pazienti con
MDS iniziale
•
livelli di espressione di LEF1 molto bassi (>10-fold) sono
significativamente associati con neutropenia nelle MDS
•
bassa espressione di LEF1 potrebbe contribuire al difetto
maturativo delle cellule progenitrici mieloidi e alla
neutropenia nelle MDS
Pellagatti et al, 2009
Down-regolazione
di LEF1 a livello
proteico
(collaborazione con T. Marafioti)
a) midollo osseo normale
b) MDS iniziale
c) MDS avanzata
• la colorazione
immunoistochimica per
CD34/LEF1 potrebbe
essere un marcatore per
MDS avanzate
Pathways deregolati
in RA e RAEB2
Sottotipo MDS
Pathway deregolati
RA
Apoptosis signalling
Chemokine signalling
Glycolysis
RAEB2
DNA damage response
Cell cycle: G2/M DNA damage
checkpoint regulation
Pyrimidine metabolism
Clustering gerarchico
del(5q) vs -7/del(7q) vs +8
41 del(5q)
vs
5 del(7q)/-7
vs
5 trisomia 8
(P-value<0.05)
582
Geni differenzialmente
espressi significativi
• i diversi gruppi
cariotipici formano
clusters distinti
del(5q)
-7 / del(7q)
+8
Pathways deregolati e ontologia genica
nelle MDS con -7/7q-, +8, 5qGruppo
cariotipico
Ontologia genica
Pathways Deregolati
5q-
Cell death
Protein synthesis
Cellular assembly and
organization
Wnt/
Wnt/β-catenin signalling
Actin Cytoskeleton signalling
Cell cycle: G1/S checkpoint
regulation
+8
Cell-mediated immune
response
Inflammatory response
Cell death
T-cell receptor signalling
Natural killer cell signalling
Mitochondrial dysfunction
-7/7q-
Cellular growth and
proliferation
Cell death
SAPK/JNK signalling
PI3K/AKT signalling
• in accordo con lo studio di Chen et al, Blood 2004: due MDS con
monosomia 7 e tre MDS con trisomia 8
Identificazione di GEP distinti nelle MDS
•
usando GEP e’ possibile identificare profili di
espressione distinti, che implicano specifici
pathways patogenici, nei vari gruppi cariotipici
delle MDS
•
i pathways deregolati identificati potrebbero
rappresentare nuovi bersagli farmacologici
GEP nella sindrome 5q•
la sindrome 5q- e’ un sottotipo distinto di MDS, con
una del(5q) come unica anomalia cromosomica
•
GEP puo’ essere utile per far luce sulla
patofisiologia e i meccanismi della malattia
- geni deregolati in associazione con
aploinsufficienza del gene RPS14
- deregolazione del pathway di p53 in associazione
con stress ribosomale
Sindrome 5q- e RPS14
•
il gene RPS14 ha un ruolo cruciale nella syndrome 5q-
•
RPS14 e’ localizzato nella regione minima comune di
delezione e i pazienti con sindrome 5q- hanno
aploinsufficienza di RPS14 (Boultwood et al, Blood
2002; Boultwood et al, BJH 2007)
•
Studi in vitro hanno dimostrato che RPS14 causa il
difetto eritroide nella sindrome 5q- (Ebert et al, Nature
2008)
•
sindrome 5q- : analogia con l’anemia DiamondBlackfan (DBA) – pazienti con DBA hanno
aploinsufficienza (tramite mutazione) della proteina
ribosomale RPS19
Aploinsufficienza del gene RPS14 e’ associata con
deregolazione di geni ribosomali nella sindrome 5q• le cellule CD34+ di pazienti con DBA presentano
deregolazione di vari geni con funzione ribosomale e
traduzionale
• usando GEP abbiamo trovato che 55 su 579 geni con
funzione ribosomale e traduzionale erano
differenzialmente espressi nelle cellule CD34+ di 15
pazienti con la sindrome 5q- rispetto a 18 pazienti con
RA a cariotipo normale e 17 controlli sani - RPS23,
EIF2A
• questi dati suggeriscono che la sindrome 5q- e’
caratterizzata da un’aberrante biogenesi ribosomale
Pellagatti et al, 2008
Clustering gerarchico di 55 geni con funzione ribosomale e
traduzionale differenzialmente espressi nelle MDS
• i pazienti con
sindrome 5qrisultano separati dai
pazienti con RA a
cariotipo normale a
dai controlli sani
unicamente sulla
base dell’espressione
deregolata di questi
geni ribosomali
Aploinsufficienza di proteine ribosomali e p53
• e’ stato dimostrato che lo stress a livello ribosomale porta
all’attivazione del pathway di p53 con conseguente blocco del
ciclo cellulare e apoptosi
• mutazioni nei geni Rps19 e Rps20 nei topi causano una riduzione
del numero di eritrociti tramite attivazione di p53 e dei geni regolati
da p53; l’inibizione di p53 allevia tale fenotipo (McGowan et al, Nat
Genet 2008)
Geni significativamente up-regolati
nella sindrome 5qAffy ID
Gene
Localizzazione
Ratio
P-value
219628_at
WIG1
3q26.3-q27
2.93
6.62 x 10-7
218007_s_at
RPS27L
15q22.2
1.89
3.19 x 10-6
209295_at
TNFRSF10B
8p22-p21
2.71
2.28 x 10-4
210033_s_at
SPAG6
10p12.2
4.89
5.41 x 10-4
207813_s_at
FDXR
17q24-q25
1.99
1.35 x 10-3
227372_s_at
BAIAP2L1
7q21.3
2.17
1.43 x 10-3
218634_at
PHLDA3
1q31
1.38
1.82 x 10-3
233302_at
BCL11B
14q32.2
1.82
1.88 x 10-3
221081_s_at
DENND2D
1p13.3
2.22
1.91 x 10-3
216252_x_at
FAS
10q24.1
1.46
3.42 x 10-3
211833_s_at
BAX
19q13.3-q13.4
1.97
5.01 x 10-3
217428_s_at
COL10A1
6q21-q22
1.69
5.25 x 10-3
• I geni in rosso sono regolati da p53
• 8 dei 12 geni piu’ up-regolati nella sindrome 5q- sono geni regolati da p53
Il pathway di p53 e’ significativamente
deregolato nella sindrome 5q-
p=0.024
*
I geni con una
sono espressi a livelli significativamente piu’ elevati
in pazienti con sindrome 5q-
GEP nelle MDS - conclusioni
1. identificazione di geni/pathways comunemente deregolati – ad
esempio up-regolazione di ISGs e deregolazione del pathway del
segnale dell’interferone
2. identificazione di geni associati con la progressione della malattia,
che potrebbero rappresentare nuovi marcatori molecolari di MDS
avanzata - LEF1
3. identificazione di profili di espressione distinti nei gruppi cariotipici
piu’ comuni nelle MDS (5q-, +8, -7/7q-)
miglior comprensione dei meccanismi patologici della sindrome
5q- deregolazione di geni con funzione ribosomale e traduzionale
- deregolazione del pathway di p53
4. i geni/pathways deregolati potrebbero rappresentare nuovi bersagli
terapeutici
Ringraziamenti
LRF Unit
J. Boultwood
J. Perry
J. Wainscoat
T. Marafioti
Collaboratori
internazionali
M. Cazzola
L. Malcovati
M. Della Porta
E. Hellström-Lindberg
M. Jädersten
A. Giagounidis
S. Killick
P. Fenaux
P. Vyas
A. McKenzie