In HIV-1

RETROVIRIDAE (Lentivirus)
CARATTERISTICHE GENERALI
- Forma: sferica
- Diametro: 100 nm
- Genoma: 2 molecole uguali di RNA monocatenario lineare
6
peso
4
6
x
10
dalton
- Presenza di involucro esterno derivato dalla membrana plasmatica
- Nucleocapside con simmetria elicoidale
- Assemblaggio: citoplasmatico
- 3 geni sempre presenti ed essenziali: gag – pol – env
L’ordine genico è invariato in tutti i Retrovirus:
5’ – gag – pol – env – 3’
alcuni hanno geni addizionali.
Tre sottofamiglie:
Sottofamiglia Morf.
Oncoviruses Tipo A
Tipo B
Tipo C
Tipo D
Esempi
Intracisternal A Particles (non-infectious)
Mouse Mammary Tumor (MMTV)
Avian Sarcoma and Leukemia
Murine Sarcoma and Leukemia
Human T-cell leukemia virus (HTLV)
Mason Pf izer monkey (MPMV)
Lentiviruses
Visna, HIV, SIV
Spumaviruses
Human Foamy virus
(citopatico in vitro, non associato a malattia)
HIV
(human immunodeficiency virus)
AIDS (Acquired Immuno-Deficiency Syndrome)
1980/81 - Segnalazione di focolai di polmonite da Pneumocystis carinii
associata a segni evidenti di compromissione del sistema immunitario
(immunodeficienza acquisita) in giovani adulti (per lo più maschi
omosessuali: “gay pneumonia”) e definizione “clinica” della sindrome.
1983 - Isolamento in Francia (L. Montagnier) e in U.S.A. (R. Gallo) del
retrovirus oggi denominato HIV (human immunodeficiency virus ) ed
inizialmente etichettato: LAV (Lymphoadenopathy associated virus) o
HTLV-III ( perché erroneamente ritenuto correlato ai retrovirus
oncogeni umani già noti: HTLV-I e HTLV-II).
1985 - Disponibilità dei primi reattivi (preparazioni di antigeni virali) per
la ricerca di anticorpi.
5
I virus responsabili dell’AIDS
•
Oggi sono noti due virus responsabili della sindrome da
immunodeficienza acquisita (AIDS) umana: HIV-1 e HIV-2
•
HIV-1 è diffuso in tutto il mondo ed è responsabile della maggior
parte dei casi di AIDS
•
HIV-2 è presente soprattutto in Africa occidentale, nei Caraibi e
nell’America meridionale ed è di gran lunga meno virulento
•
Virus analoghi, responsabili di sindromi assai simili
(immunodeficienza acquisita), sono stati dimostrati anche in varie
specie animali : scimmie (SIV), felini (FIV), etc.
Caratteri generali di HIV-1
• HIV-1 appartiene alla sottofamiglia Lentivirinae della famiglia
Retroviridae
• I lentivirus hanno i caratteri generali dei retrovirus con i quali
dividono gli aspetti essenziali del ciclo replicativo e
l’organizzazione generale del genoma che presenta, però, in
aggiunta ai “geni” fondamentali gag, pol ed env, una serie di
“geni accessori e regolatori” che svolgono un ruolo essenziale
nel ciclo replicativo del virus.
HIV: ANATOMIA DEL VIRIONE
HIV: ANATOMIA DEL VIRIONE
From Gallo and Montagnier, Scientific American, 259:42, 1988.
Le fasi del ciclo replicativo di HIV-1
comprendono:
• L’attacco dell'antirecettore (gp120) presente all’esterno
dell’envelope, al recettore (CD4) ed ai co-recettori (CCR5, CXR4,
etc) delle cellule sensibili, seguito dalla fusione dell’envelope con
la membrana cellulare e dalla penetrazione del nucleocapside
virale nel citoplasma
TROPISMO
Il tropismo cellulare di HIV-1
In vivo:
• Stipiti con capacità di crescere in CTL (stipiti linfotropi)
• Stipiti con capacità di infettare i MP (stipiti MPtropi),
In vitro
• entrambi crescono bene in colture primarie di linfociti da sangue periferico
Il tropismo cellulare di HIV-1
• Gli stipiti virali macrofago (MP)-tropi sono predominanti durante
la fase asintomatica dell’infezione e si ritrovano costantemente
durante il corso della malattia, il che suggerisce un loro ruolo
essenziale nella persistenza dell’infezione
• La maggior parte del virus presente nei tessuti extra-linfoidi ed
extravascolari è associata ai MP
Il tropismo cellulare di HIV-1
•
Sebbene CD4 sia il recettore cellulare essenziale all’ancoraggio di HIV-1, esso
non è sufficiente a consentirne la penetrazione intracellulare
•
Perchè si attivi il peptide fusogeno (gp41) e si inneschi la fusione dell’envelope
virale con la membrana cellulare, l’antirecettore virale (gp120) ancorato al
CD4 deve reagire con altre molecole di superficie (corecettori)
Il tropismo cellulare di HIV-1
•
Gli stipiti MP-tropi legano alla superficie dei MP il recettore CC-CKR5
(specifico per le chemochine RANTES, MIP 1-alfa e MIP 1-beta) che è
essenziale per l’infettività degli stipiti MP-tropi
•
Analoga funzione anche i recettori 2b (CKR2b) e CKR3 (specifico per la
chemochina “eotaxin”) che però hanno una espressione più ristretta
Il tropismo cellulare di HIV-1
•
Gli stipiti di HIV-1 linfotropi
utilizzano come co-recettore la molecola di superficie già nota come LESTR
(leukocyte expressed-seven transmembrane- domain-receptor) o “fusin” ed
oggi denominata CX CKR4, che è il recettore per la chemochina SDF-1
(stromal cell-derived factor-1)
Il tropismo cellulare di HIV-1
•
Tutti e due i principali co-recettori (CC CKR5 e CX CKR4) sono espressi alla
superficie dei linfociti da sangue periferico in coltura primaria, il che spiega la
loro sensibilità alla infezione sia con stipiti linfo-tropi sia con stipiti MP-tropi
Il tropismo cellulare di HIV-1
•
La necessità di recettori di tipo CC o CX CKR, disponibili alla superficie delle
cellule CD4+, per funzionare da co-recettori che consentano la fusione
dell’envelope virale con la membrana cellulare, spiega perchè alcune
chemochine (RANTES, MIP-alfa, MIP-1beta), legandosi ai rispettivi recettori
ed impedendo l’attacco di gp120, possano avere azione “antivirale”
Schema della
interazione di
HIV-1
con il recettore
CD4
ed i diversi
corecettori
presenti alla
superficie
delle cellule
sensibili
Progenie virale
Acquisizione del pericapside
Rna (+) genoma
Assemblaggio
Trascrittasi
inversa
Endonucleasi/
integrasi
Proteine
strutturali
Trascrizione
AAAA
TAR
SpS
Traduzione
Proteine
regolatrici
Tat
Rev
RRE
Proteasi
Poliproteine
Traduzione
Replicazione
Replicazione
• La retrotrascrizione dell’ RNA del genoma virale in DNA
(provirus) che viene poi circolarizzato ed integrato nel genoma
cellulare, eventi favoriti da
− la replicazione della cellula infetta
− la attivazione della cellula infetta
• La trascrizione del provirus con la produzione di RNA genomico
e dei vari mRNA per la sintesi delle poliproteine virus-specifiche
• La formazione delle varie proteine funzionali (proteasi),
l’assemblaggio e la gemmazione dei virioni neoformati
LTR
vif
LTR
tat vpu
gag
nef
pol
vpr rev
env
Caratteri generali di HIV-1
Organizzazione del genoma
Oltre ai geni “strutturali” gag, pol ed env, HIV possiede almeno
altri sei geni con funzioni accessorie o regolatrici nel ciclo di
replicazione virale
LTR
vif
LTR
tat vpu
gag
nef
pol
vpr rev
env
•
“gag” (“group-Ag”) codifica le proteine del nucleo-capside o “core” virale, e la
proteina della “matrice” virale
•
In HIV-1
− 24-kD (p24) che forma il capside virale
− due proteine RNA-binding (p9/7 e p7/6)
− la proteina (p17) della “matrice” virale ( ruolo nella “gemmazione”)
LTR
vif
LTR
tat vpu
gag
nef
pol
vpr rev
•
env
“pol “, codifica la DNA-polimerasi RNA-dipendente o trascrittasi inversa e gli
altri enzimi (ribonucleasi H, proteasi, integrasi) associati al virione
LTR
vif
LTR
tat vpu
gag
nef
pol
vpr rev
env
Trascrittasi inversa (p51/p66)
• Eterodimero
• Primer: tRNAlys specifico
• Sintesi DNA/RNA
• Prodotto finale: dsDNA (provirale)
LTR
vif
LTR
tat vpu
gag
nef
pol
vpr rev
env
Proteasi PR (p11)
• Omodimero
• Proteasi aspartica
• Asp-Thr-Ser_Gly
• Indispensabile
LTR
vif
LTR
tat vpu
gag
nef
pol
vpr rev
env
Integrasi IN (p32)
• Omodimero
• Indispensabile
LTR
vif
LTR
tat vpu
gag
nef
pol
vpr rev
env
• “env” codifica una poliproteina di 88 kD (p88) che viene glicosilata a gp160
• La proteasi virale scinde il precursore gp160 nelle due glicoproteine dell’
envelope: gp120 e gp41
− gp120 è la glicoproteina esterna coinvolta nel riconoscimento e nel legame al
recettore
− gp41 è una proteina idrofobica che
• garantisce l’ancoraggio di gp120 attraverso legami non covalenti,
• è coinvolta nella fusione dell’envelope virale con la membrana cellulare
LTR
vif
LTR
tat vpu
gag
nef
pol
vpr rev
env
Geni “accessori” e “regolatori” di HIV-1
•
L’espressione dei geni con funzioni accessorie o regolatrici
comporta complesse operazioni di “splicing” dei relativi RNAmessaggeri
LTR
vif
LTR
tat vpu
gag
nef
pol
vpr rev
env
•
“vif” (virion infectivity factor) codifica per p23, indispensabile per la
produzione di virus extracellulare infettante (forse intervenendo nella
elaborazione finale dei prodotti del gene “env” e nell’assemblaggio del
“core” virale)
•
Virioni defettivi in “vif” sono scarsamente infettanti per i linfociti o i
macrofagi umani se aggiunti alle colture come virus libero, ma si
trasmettono ancora efficacemente da cellula a cellula
LTR
vif
LTR
tat vpu
gag
nef
pol
vpr rev
env
• “vpu” (virion protein U) presente solo in HIV-1, codifica una
proteina di 15-16 kD che facilita il trasporto di gp120 verso la
membrana cellulare.
• Sebbene non essenziale per la replicazione di HIV-1, vpu sembra
avere un ruolo nel corretto assemblaggio e nella liberazione dei
virioni neoformati
LTR
vif
LTR
tat vpu
gag
nef
pol
vpr rev
env
•
“vpr” (viral protein R) codifica una proteina di 14 kD che viene associata al
virione neoformato, associata alla proteina p7/6 del nucleocapside
•
Sembra avere un ruolo importante nel favorire il trasporto intranucleare
del complesso nucleoproteico virale (genoma e proteine associate) che
provvederà alla integrazione del DNA provirale nel genoma cellulare
LTR
vif
LTR
tat vpu
gag
nef
pol
vpr rev
env
• “nef” (p27) (negative factor)
− associato ad una minore efficienza della replicazione di HIV in colture
di cellule
− patogenicità attenuata in vivo degli stipiti nef –defettivi
• Associata alla membrana cellulare, causa downregulation di CD4,
provocandone la endocitosi e la degradazione nei fagolisosomi
• Coinvolta nel trasporto di proteine e/o nel signaling di membrana
LTR
vif
LTR
tat vpu
gag
nef
pol
vpr rev
env
• “tat” (trans-activator of transcription) consiste di due distinti
esoni che codificano una proteina di 14 kD
• La proteina Tat è prodotta nella fase iniziale della trascrizione
del provirus e agisce:
− LTR 5’ aumentandone la attività
− Transattivando la trascrizione di numerosi geni cellulari produttori di
citochine, fattori di crescita, etc. anche in cellule non-infette (azione
paracrina)
LTR
vif
LTR
tat vpu
gag
nef
pol
vpr rev
env
• “rev” (regulator of expression of virion proteins) ( due esoni), codificano per p19
che favorisce il trasferimento nucleo-citoplasmatico di RNA-m unspliced
•
La proteina Rev si lega agli m RNA virali in corrispondenza della sequenza RRE
(Rev-responsive element) sita all’interno del gene env, proteggendoli dalle
operazioni di splicing
•
Rev è essenziale per il trasferimento nel citoplasma dell’RNA genomico e degli m
RNA per le proteine strutturali, limitando altresì, indirettamente, (attraverso il
blocco della produzione di RNA-m spliced) l’espressione propria e quella delle
altre proteine accessorie e regolatrici
Variabilità genetica di HIV-1
•
La trascrizione inversa non possiede i meccanismi di”controllo” presenti
nella duplicazione del DNA e compie “errori” che si traducono nella
comparsa di stipiti virali con caratteri diversi (quasi-specie)
− nei diversi individui infetti
− nelle diverse fasi della infezione dello stesso individuo
•
La “variabilità” è particolarmente evidente a livello di alcune zone di
“env” mentre altri geni (ad es. tat) sono molto più “conservati”
Varibilità genetica di HIV-1
•
Genotipi: M (Main), N (New) e O (Outlier)
•
Nell’ M, sottotipi (clades): A-K
•
Elevato tasso di replicazionee di mutazione = variazione di esequenza
•
Fino al 20% di varibilità in env all’interno di un clade
•
La diversità in sequenza  porzioni immunogeniche variate del virus
Distribuzione geografica dei sottotipi di HIV-1
B
B
B
B, C + others
A, B + others
C, B
B
C, E, B
C, A, D, B, E +
B
La patogenesi dell’AIDS
• L’infezione da HIV è ematogena (si trasmette per scambio di
siringhe con tracce di sangue infetto, per via omo- ed eterosessuale, per trasmissione perinatale, attraverso la trasfusione di
sangue o emoderivati infetti, etc.)
Distribuzione dei casi di AIDS notificati in Italia, alla fine del
1° trimestre 1999, a seconda delle modalità di trasmissione
dell’infezione (numero stimato di soggetti infetti: > 130.000)
Tossicod.
Omosess.
Eterosess.
Trasfus.
Perinatal.
Ignota
• Quasi tutti (> 95%) i soggetti infetti sviluppano la malattia
conclamata (con esito letale) dopo un lungo (anni) periodo di
latenza clinica
• Latenza clinica, però, non vuol dire latenza virale
• L’infezione si accompagna ad una progressiva e sostenuta
replicazione del virus (in particolare negli organi linfoidi) che,
per tutto il periodo asintomatico, viene contrastata e contenuta
dalla risposta immune dell’organismo, e ad una progressiva
diminuzione dei linfociti T-CD4+ (normalmente circa 1.000/ l)
Decorso tipico
•
Con la riduzione dei linfociti T-CD4+ al di sotto di una soglia critica (in
genere, < 500/ l) e con la conseguente compromissione della capacità di
risposta immune (soprattutto cellulo-mediata) inizia la fase sintomatica
(AIDS)
•
Le manifestazioni cliniche fondamentali sono rappresentate dalla comparsa
di infezioni “opportunistiche”, dalla comparsa di tumori non usuali (linfomi
cerebrali primitivi, sarcoma di Kaposi epidemico) e dalla compromissione
del SNC (AIDS dementia complex)
La patogenesi dell’AIDS
•
La progressione verso la malattia è in rapporto
− alla quantità di virus infettante
− alla capacità replicativa del virus
− ai caratteri fenotipici del virus (è più rapida con la comparsa di varianti rapid/high)
− alla diminuzione nel numero dei linfociti T CD4+ (lisi dei CD4+ infetti)
•
La patogenesi dell’AIDS è multifattoriale e non è esclusivamente riconducibile
alla diretta distruzione di elementi cellulari ad opera della infezione virale
•
Oltre alla diminuzione dei linfociti T CD4+, i soggetti infetti da HIV-1
presentano una serie di citopenie periferiche in rapporto ad una profonda
compromissione delle capacità di sopravvivenza e di proliferazione dei
progenitori ematopoietici (cellule CD34+) del midollo osseo e del sangue
circolante
•
Le cellule CD34+, tuttavia, non sono suscettibili alla infezione da HIV-1 e la
loro compromissione è soprattutto la conseguenza dell’aumento di TGF 1 endogeno, causato dalla interazione con gp120, e della esposizione al
TGF- 1 esogeno iperprodotto dai MP stimolati da Tat.
• Un meccanismo patogenetico analogo è alla base delle lesioni del
SNC
• I neuroni infatti non sono suscettibili alla infezione da HIV-1 e sono
distrutti come conseguenza dell’azione “tossica” di proteine virusspecifiche (gp120) o di citochine o prodotti tossici elaborati dalle
cellule accessorie (glia, astrociti) infette da HIV-1
• Nella comparsa di tumori non usuali e, in particolare, nella
comparsa del sarcoma di Kaposi (angiosarcoma cutaneo) un
ruolo essenziale sembra giocato dalla proteina Tat per le sue
capacità di transattivare una serie di geni cellulari e di stimolare
la replicazione cellulare attraverso segnali di membrana e da altri
fattori (HHV-8 ?)
I “long-term non progressors”
< 5% di soggetti infetti da più di 10-12 anni non presenta segni di malattia o di
compromissione della risposta immune e possiede un numero normale (o
comunque superiore a 500/ l) di linfociti T CD4+
?
-minore capacità replicativa del virus infettante (ad es.: virus nef-defettivi)
-elevata risposta immune ( MHC-I ristretta) dei linfociti T citotossici (CD8+)
-iperproduzione di chemochine che bloccano i co-recettori
-produzione di “fattori antivirali” (?) da parte dei linfociti T CD8+
-altro?
La diagnosi di infezione da HIV
L’ infezione da HIV, una volta verificatasi, si mantiene costantemente attiva
Sieropositività = diagnosi di infezione "in atto"
La diagnosi di infezione da HIV
La ricerca di anticorpi nei confronti di HIV
Saggio immunoenzimatico
(Enzyme-linked Immuno-sorbent Assay o ELISA)
preparazioni di antigeni virali le cui caratteristiche consentano la rilevazione di
anticorpi nei confronti di HIV-1 e HIV-2 e per il sottotipo O di HIV-1
La diagnosi di infezione da HIV
•
Un risultato positivo all’ELISA va sottoposto ad esame "di conferma"
Immunoblotting
strisce con i diversi peptidi di HIV-1 e gp36 di HIV-2
La diagnosi di infezione da HIV
•
L’immunoblotting negativo o sicuramente positivo non lascia dubbi
interpretativi e non prevede ulteriori indagini diagnostiche.
La diagnosi di infezione da HIV
Limiti della sierologia
•
1) fase iniziale (3-4 settimane): la cosiddetta "finestra" iniziale
•
2) neonati di madri infette da HIV (anticorpi sierici materni)
•
3) in una modesta percentuale di soggetti: risultati "borderline”
Diagnostica Virologica: ricerca del virus.
La diagnosi di infezione da HIV
•
Isolamento del virus in colture di cellule indicata:
− a) nel follow-up del paziente per il monitoraggio del fenotipo (sinciziogeno, a
crescita rapida, etc.) dello stipite virale e/o della sua resistenza ai farmaci
antiretrovirali
− b) nel monitoraggio delle varianti antigeniche circolanti in un determinato
territorio
•
Determinazione dell’ antigenemia (p24 nel sangue)
•
Determinazione dell’ RNAemia (RNA virionico o DNA pro-virale nel sangue)
Il follow-up virologico del paziente
•
“viral load”
il livello e l’ andamento nel tempo, rappresentano il criterio essenziale per:
a) definire la necessità di farmaci antiretrovirali,
b) giudicare l’efficacia del regime terapeutico in atto,
c) valutare l’andamento dell’infezione sotto il profilo prognostico
Per valutare il “viral load”:
•
1 - determinazione quantitativa del DNA provirale mediante PCR (PCR)
Indica l’ampiezza del “reservoir” di virus presente nell’organismo, non sempre
correlata alla intensità della replicazione virale
•
2 - determinazione della quantità di virus infettante presente nel sangue
periferico misurata in colture di cellule in vitro
•
3 - determinazione quantitativa di HIV-1 RNA nel plasma (mediante RT-PCR
o metodi analoghi)
Correlate alla infezione produttiva (replicazione) del virus
Il follow-up virologico del paziente
•
Il numero di molecole di HIV-1 RNA/ml di plasma (insieme alla presenza di
infezione “sintomatica” e/o al numero di linfociti T CD4+) è utilizzato per
− decidere l’inizio della terapia con farmaci antiretrovirali
− valutare l’ efficacia del regime terapeutico in atto,
− valutare la prognosi della malattia
La resistenza di HIV-1 ai farmaci
antiretrovirali
•
Per replicare il genoma di HIV intervengono tre polimerasi:
− Trasciptasi inversa virale
− DNA pol
− RNA pol
3x10-5 errori per base incorporata
•
Durante la prima fase dell’infezione, la popolazione virale sembra essere
monoclonale, con sequenze nucleotidiche virali omogenee
•
In seguito, durante il corso della malattia la popolazione virale è
disomogenea.
Se non fosse per i mutanti resistenti, l’infezione potrebbe essere controllata.
Sviluppo del vaccino - Problematiche
• Varibilità genetica del virus
• Replicazione rapida – elevato tasso di mutazione (mutanti che
sfuggono al sistema immune
• Latenza e persistenza
• Infezione delle CD4 e compromissione immunitaria
The HIV Vaccine Pipeline,
February 2003
Trials completed or in progress
> 30 phase I trials
~12 phase II
2 phase III
1 phase III completed
Multiple phase I
trials with novel
candidates planned
for 2003