RETROVIRIDAE
G. Di Bonaventura
Università di Chieti-Pescara
famiglia Retroviridae
Subfamiglia Gruppo
Oncovirinae Tipo A
(oncògeni)
Tipo B
Tipo C
Tipo D
Lentivirinae
- tassonomia
Esempi
Intracisternal A Particles (non-infectious)
Mouse Mammary Tumor (MMTV)
Avian Sarcoma and Leukemia
Murine Sarcoma and Leukemia
* Human T-cell leukemia virus (HTLV I-II)
Mason Pfizer monkey (MPMV)
Visna, * HIV (1–2), SIV, FIV
(lungo periodo di incubazione)
Spumavirinae
(effetto vacuolizzante)
Human Foamy virus
(citopatico in vitro, non patogeno per l’uomo)
* Oncovirus endògeni
* Retrovirus patogeni per l’uomo
H.I.V.
(Human Immunodeficiency Virus)
AIDS (Acquired Immuno-Deficiency Syndrome)
1980/81- Segnalazione di focolai di polmonite da Pneumocystis carinii associata a
segni evidenti di compromissione del sistema immunitario (immunodeficienza
acquisita) in giovani adulti (per lo più maschi omosessuali: “gay pneumonia”) e
definizione “clinica” della sindrome.
1983 - Isolamento in Francia (L. Montagnier) e in U.S.A. (R. Gallo) del retrovirus
oggi denominato HIV (human immunodeficiency virus). Inizialmente indicato
LAV (Lymphoadenopathy associated virus) o HTLV-III (perché ritenuto,
erroneamente, essere correlato ai retrovirus oncogeni umani già noti HTLV-I e
HTLV-II).
1985 - Disponibilità dei primi reattivi (preparazioni di antigeni virali) per la ricerca di
anticorpi.
I virus responsabili dell’AIDS
Ad oggi, due sono i virus noti per essere causa
della sindrome da immunodeficienza acquisita
(AIDS) umana: HIV-1 e HIV-2
HIV-1 è diffuso in tutto il mondo ed è
responsabile della maggior parte dei casi di AIDS
HIV-2 è presente soprattutto in Africa occidentale,
India, Caraibi, America meridionale; è di gran
lunga meno virulento di HIV-1
Virus analoghi, responsabili di sindromi assai
simili (immunodeficienza acquisita), sono stati
dimostrati anche in varie specie animali: scimmie
(SIV), felini (FIV), etc.
HIV: caratteri generali
HIV appartiene alla sottofamiglia Lentivirinae,
famiglia Retroviridae
I Lentivirus hanno i caratteri generali dei Retrovirus
con i quali dividono gli aspetti essenziali del ciclo
replicativo e l’organizzazione generale del genoma:
forma: sferica (d = 100 nm)
nucleocapside con simmetria elicoidale
presenza di involucro esterno (peplos), derivato dalla
gemmazione della membrana plasmatica
genoma: RNA+, diploide (unicità tra i virus !); sistema «gag-pol-env» e
presenza di geni «regolatori»
HIV: struttura del virione
HIV. Core ed envelope evidenti; le glicoproteine
di superficie appaiono come protrusioni alla
superficie (da: Gallo and Montagnier, Scientific
American, 259:42, 1988)
HIV: organizzazione del genoma
«provirus» (DNA)
Retrotrascrizione
DNApol-RNAdip
(virale)
- 2 x RNA
- polarità +
- 3’-poli-A, in contatto all’estremità 5’
- tRNA («innesco» RT)
LTR (Long Terminal Repeat): contiene promoter/ehnancer per trascrizione provirus
oltre ai 3 geni sempre presenti ed essenziali nei
Retroviridae (gag – pol – env) HIV presenta, in aggiunta,
una serie di “geni accessori e regolatori” che svolgono
un ruolo essenziale nel ciclo replicativo del virus
HIV
ciclo replicativo
HIV - ciclo replicativo: binding
1.
ATTACCO: HIV interagisce, mediante un antirecettore (gp120,
gp41) presente sul peplos, con il recettore (CD4) ed i co-recettori
(CCR5, CXR4) delle cellule sensibili (linfociti T-helper, macrofagi,
microglia, monociti circolanti, cellule dendritiche, etc.)
TROPISMO VIRALE per cellule CD4+:
In vivo
stipiti con capacità di crescere in linfociti T-helper
(stipiti linfotropi) (CCR5 come co-recettore)
stipiti con capacità di infettare i macrofagi
(stipiti macrofagotropi), durante la fase di persistenza
della malattia in sede extra-linfoide e –vascolare (CXCR4 come corecettore)
In vitro
entrambi crescono in colture primarie di linfociti da sangue periferico
(dotati di CCR5 e CXCR4)
La presenza di co-recettori (CCR5 o CXCR4), disponibili alla
superficie delle cellule CD4+, che “cooperano” con CD4 alla
fusione dell’envelope virale con la membrana cellulare, è stata
suggerita da:
insensibilità di cellule murine (transfettate con CD4) all’infezione
azione antivirale di chemochine (RANTES, MIP-1α, MIP-1β) che,
legando i rispettivi co-recettori, ne impediscono l’attacco a gp120
HIV - ciclo replicativo:
fusione, penetrazione, uncoating
2.
FUSIONE e PENETRAZIONE: l’interazione dei
recettori cellulari con le glicoproteine virali
gp120/gp41 provoca un riarraggiamento
conformazionale dell’envelope che ne consente la
fusione con la membrana cellulare. In tal modo, il
nucleocapside virale accede al citoplasma
3.
UNCOATING (SCAPSIDAMENTO): il virione perde il
capside liberando così nel citoplasma il suo
genoma
Linfociti T CD4+ infettati da HIV
contenuti in vacuoli citoplasmatici
(da: Haseltine and Wong-Staal, Scientific American 259:53, 1988)
HIV – ciclo replicativo
4. REPLICAZIONE
Retrotrascrizione (ad opera di una
trascrittasi inversa DNA-polimerasi–RNA
dipendente virale) dell’RNA del genoma
virale in DNA (provirus)
5. INTEGRAZIONE
provirus circolarizza e si integra nel
genoma cellulare
eventi favoriti anche dalle concomitanti:
replicazione della cellula infetta
attivazione della cellula infetta
HIV – ciclo replicativo
6-7-8. REPLICAZIONE GENOMICA - SINTESI
PROTEICA
Trascrizione del provirus con la produzione di
RNA genomico e dei vari mRNA per la sintesi
delle poliproteine strutturali virus-specifiche:
LTR 5’ promoter consente attacco RNA-pol cellulare
migrazione verso il citoplasma di mRNA di piccole
dimensioni (multi-spliced) codificanti per proteine
regolatorie (funzionali). In particolare:
Tat aumenta la velocità di trascrizione
Rev blocca il multi-splicing, consente l’esportazione
di RNA-genomici e mRNA per proteine strutturali
(capside, peplos) ed enzimatiche (proteasi)
Maturazione delle proteine, mediante clivaggio
ad opera di proteasi
Inserimento di proteine del peplos (es. gp120,
gp41) in alcuni segmenti di membrana cellulare
Progenie virale
Acquisizione del pericapside
Rna (+) genoma
Assemblaggio
Trascrittasi
inversa
Endonucleasi/
integrasi
Proteine
strutturali
Trascrizione
AAAA
TAR
SpS
Traduzione
Proteine
regolatrici
Tat
Rev
RRE
Proteasi
Poliproteine
Traduzione
I geni gag, pol, env sono tradotti in poliproteine che, ad opera di proteasi,
verranno semplificate nei singoli prodotti proteici.
In particolare, gag e pol vengono co-tradotti in un singolo polipeptide.
LTR
vif
LTR
tat vpu
gag
nef
pol
vpr rev
env
gag (“group-Ag”) codifica le proteine del nucleocapside o “core”
virale, e della “matrice” virale:
p24 che forma il capside virale
p17 proteina della “matrice” virale
(riconosce il segmento di membrana cellulare
che formerà il peplos)
p9/7 e p7/6, proteine RNA-binding
pX, X = PM proteina
Esempio: p24, PM = 24-kD
LTR
vif
LTR
tat vpu
gag
nef
pol
vpr rev
env
pol («polymerase») codifica la DNA-polimerasi RNA-dipendente o
trascrittasi inversa e gli altri enzimi associati al virione:
proteasi (p9)
trascrittasi-inversa e RNA-si H (p66)
integrasi (p32)
LTR
vif
LTR
tat vpu
gag
nef
pol
vpr rev
env
env («envelope») codifica una poliproteina di 88 kD (p88) che viene glicosilata
a gp160
ad opera di una proteasi virale, gp160 viene scissa nelle due glicoproteine
dell’envelope: gp120 e gp41
gp120 è la glicoproteina esterna coinvolta nel riconoscimento e nel legame
al recettore
gp41 è una proteina idrofobica che:
garantisce l’ancoraggio di gp120 tramite
legami non covalenti
coinvolta nella fusione dell’envelope
con la membrana cellulare
LTR
vif
LTR
tat vpu
gag
nef
pol
vpr rev
env
Geni “accessori” e “regolatori” di HIV-1
A differenza degli altri Retrovirus HIV possiede, oltre ai geni
“strutturali” (gag, pol, env), almeno altre sei sequenze con
funzioni accessorie o regolatrici nel ciclo di replicazione
virale.
LTR
vif
LTR
tat vpu
gag
nef
pol
vpr rev
“tat” (trans-activator of transcription) consiste
di due distinti esoni che codificano una
proteina di 14 kD
La proteina Tat è prodotta nella fase iniziale
della trascrizione del provirus e agisce a livello
nucleare:
potenziando l’attività di LTR 5’
reclutando fattori trascrizionali
env
inducendo cambiamenti conformazionali nella cromatina, così favorendo la
trascrizione del DNA
escreta, può agire sulla stessa cellula (azione autocrina) o su cellule
viciniore non infette (azione paracrina) transattivando la trascrizione di
numerosi geni cellulari produttori di citochine, fattori di crescita, etc.
LTR
vif
LTR
tat vpu
gag
nef
pol
vpr rev
env
“rev” (regulator of expression of virion
proteins) ( due esoni), codificano per p19 che
favorisce il trasferimento nucleocitoplasmatico di RNA-m unspliced
La proteina Rev si lega agli m-RNA virali in
corrispondenza della sequenza RRE (Revresponsive element) sita all’interno del gene
env, proteggendoli dalle operazioni di splicing
Rev è essenziale per il trasferimento nel citoplasma dell’RNA genomico e degli
m-RNA per le proteine strutturali, limitando altresì, indirettamente, (attraverso il
blocco della produzione di RNA-m spliced) l’espressione propria e quella delle
altre proteine accessorie e regolatrici
LTR
vif
LTR
tat vpu
gag
nef
pol
vpr rev
env
“vpu” (viral protein unique) presente solo in HIV-1, codifica una
proteina di 15-16 kD che facilita il trasporto di gp120 e gp41 verso la
membrana cellulare
idrolizza CD4 neosintetizzate a livello del reticolo endoplasmico
non essenziale per la replicazione di HIV-1, ha un ruolo nel corretto
assemblaggio e nella liberazione dei virioni neoformati
LTR
vif
LTR
tat vpu
gag
nef
pol
vpr rev
env
“nef” (p27) (negative factor)
azione simile a quella di vpu: causa downregulation di CD4. Si lega al CD4
di membrana (provocandone la endocitosi) e a quello dell’apparato di Golgi
conducendolo in sede lisosomiale provocandone, così, la degradazione
associato ad una minore efficienza della replicazione di HIV in colture
di cellule
patogenicità attenuata in vivo degli stipiti nef –defettivi
LTR
vif
LTR
tat vpu
gag
nef
pol
vpr rev
env
“vif” (virion infectivity factor) codifica per p23, indispensabile per la
produzione di virus extracellulare infettante, forse intervenendo nella
elaborazione finale dei prodotti del gene “env” e nell’assemblaggio del
“core” virale
Virioni defettivi in “vif” sono scarsamente infettanti per i linfociti o i
macrofagi umani se aggiunti alle colture come virus libero, ma si
trasmettono ancora efficacemente da cellula a cellula
LTR
vif
LTR
tat vpu
gag
nef
pol
vpr rev
env
“vpr” (viral protein R) codifica una proteina di 14 kD che viene associata al
virione neoformato, associata alla proteina p7/6 del nucleocapside
Sembra avere un ruolo importante nel favorire il trasporto intranucleare del
complesso nucleoproteico virale (genoma e proteine associate) che
provvederà alla integrazione del DNA provirale nel genoma cellulare
HIV – ciclo replicativo
9. ASSEMBLAGGIO E DISSEMINAZIONE DEI
VIRIONI
Assemblaggio dei singoli virioni:
2 molecole di tRNA genomico si associano a proteine
regolatorie/strutturali a dare il virione completo
Gemmazione dei virioni neoformati che in tal
modo si dotano del peplos (no lisi cellulare)
Variabilità genetica di HIV-1
La trascrizione inversa non possiede i meccanismi di ”controllo” (proof-reading)
presenti nella duplicazione del DNA. Pertanto, gli “errori” (mutazioni) associati alla sua
attività si traducono nella comparsa di stipiti virali con caratteri diversi (quasi-specie)
nei diversi individui infetti
nelle diverse fasi della infezione dello stesso individuo
La “variabilità” è particolarmente evidente a livello di alcune zone di “env” e “nef”
(mutazioni non silenti ed estese) mentre altri geni (gag, pol, tat) sono molto più
“conservati” (mutazioni silenti e puntiformi)
esistenza di uno stretto rapporto struttura-funzione
elusione della risposta immune mediante modificazioni non silenti delle
glicoproteine di superficie (inefficacia della vaccinazione)
Variabilità genetica di HIV-1
Stipiti di HIV-1 classificabili in 3 gruppi: M, N, O
gruppo M (“main”) comprende la maggior parte degli stipiti; si distinguono
vari sottotipi (cladi): A-K (Italia, sottotipo B)
gruppo O (“outlier”): stipiti infrequenti
gruppo N (“non-M non-O”): struttura genomica molto diversa da M ed O
Elevata velocità di replicazione ed elevato tasso mutazionale = diversità di
sequenza
fino al 20% di diversità in env all’interno di un sottotipo
La diversità di sequenza modula le frazioni immunogene del virus
La patogenesi dell’AIDS
L’infezione da HIV è di natura ematogena
Si trasmette attraverso:
rapporto sessuale
omosessuale
eterosessuale
contatto con sangue infetto
scambio di siringhe (tossicodipendenti, operatori sanitari)
trasfusione (sangue o emoderivati)
contatto perinatale
passaggio attraverso il canale del parto
allattamento
La patogenesi dell’AIDS
All’infezione primaria segue un’incubazione di 3-6
settimane e, quindi, una fase acuta (sindrome
simil-mononucleosica)
Segue una fase asintomatica: la latenza clinica
non equivale alla latenza virale
Infatti, l’infezione si accompagna ad una
progressiva e sostenuta replicazione del virus (in
particolare negli organi linfoidi) - che, per tutto il
periodo asintomatico, viene contrastata e
contenuta dalla risposta immune dell’organismo - e
ad una progressiva diminuzione dei linfociti TCD4+ (normalmente circa 1.000/mm3)
La patogenesi dell’AIDS
Con la riduzione dei linfociti T-helper al di sotto di
una soglia critica (in genere, < 500/mm3) e con la
conseguente compromissione della capacità di
risposta immune (soprattutto cellulo-mediata) inizia
la fase sintomatica (AIDS):
iniziale stadio LAS (lymphoadenopatic
syndrome) con linfoadenopatia persistente
stadio ARC (AIDS-related complex): calo ponderale, diarrea, astenia con netta
diminuzione dei linfociti T-helper circolanti
quando linfociti T-helper < 300 mm3 compare lo stadio di AIDS conclamato, con
massiva viremia (incapacità linfonodale a contenere il virus) e comparsa di infezioni
“opportunistiche” (batteriche, protozoarie, virali) di inusitata gravità, spesso
accompagnate dalla comparsa di tumori non usuali (linfomi cerebrali primitivi,
sarcoma di Kaposi epidemico) e dalla compromissione del SNC (AIDS-related
dementia)
La patogenesi dell’AIDS
La progressione verso la malattia è in rapporto
alla quantità di virus infettante
alla capacità replicativa del virus
ai caratteri fenotipici del virus (è più rapida con la comparsa di varianti rapid/high)
alla diminuzione nel numero dei linfociti T CD4+ (lisi dei CD4+ infetti)
La patogenesi dell’AIDS è multifattoriale e non è esclusivamente riconducibile alla diretta
distruzione linfocitaria ad opera della infezione virale. Infatti, nonostante HIV causi la
totale deplezione dei linfociti T CD4+:
HIV infetta soltanto il 20-30% della popolazione linfocitaria
“rimpiazzo” dei linfociti T ad opera di un turn-over da parte dei precursori della serie linfoide
Esistenza di meccanismi alternativi (indiretti):
Reclutamento di linfociti CD4+ non infetti da parte di HIV, per induzione del
fenomeno apoptotico innescato dall’interazione tra gp120 e CD4
Patogenesi “multifattoriale”
dell’AIDS
Un meccanismo patogenetico alternativo è stato anche proposto per spiegare i
quadri di citopenie periferiche e le lesioni del SNC
Le cellule CD34+ (progenitori ematopoietici) ed i neuroni infatti non sono
suscettibili alla infezione da HIV-1 e sono distrutti come conseguenza della
abnorme produzione di citochine indotta in cellule infette (linfociti, glia, astrociti) e
non (linfociti) in seguito all’azione “tossica” di proteine virus-specifiche (gp120,
Tat)
Nella comparsa di tumori non usuali e, in particolare, nella comparsa del
sarcoma di Kaposi (angiosarcoma cutaneo) un ruolo essenziale sembra giocato
dalla proteina Tat per le sue capacità di transattivare una serie di geni cellulari e
di stimolare la replicazione cellulare attraverso segnali di membrana e da altri
fattori (HHV-8 ?)
I “long-term non progressors”
< 5% di soggetti infetti da più di 10-12 anni non presenta segni di malattia
o di compromissione della risposta immune e possiede un numero
normale (o comunque superiore a 500/mm3) di linfociti T CD4+
?
-minore capacità replicativa del virus infettante (ad es.: virus nef-defettivi)
-elevata risposta immune ( MHC-I ristretta) dei linfociti T citotossici
(CD8+)
-iperproduzione di chemochine che bloccano i co-recettori
-produzione di “fattori antivirali” (?) da parte dei linfociti T CD8+
-altre cause?
La diagnosi di infezione da HIV
L’ infezione da HIV, una volta verificatasi, si mantiene costantemente attiva
Quindi…Sieropositività = diagnosi di infezione "in atto“ (anche se clinicamente silente)
Ricerca di anticorpi anti-HIV mediante saggio immunoenzimatico (Enzyme-linked
Immuno-sorbent Assay o ELISA): utilizzo di preparazioni antigeniche virali che
consentano la rilevazione di anticorpi nei confronti di HIV-1 e HIV-2 e per il sottotipo O di
HIV-1
Conferma sieropositività: un risultato positivo all’ELISA va sottoposto ad esame "di
conferma" tramite immunoblotting, utilizzando supporti adsorbiti con diversi peptidi di HIV1 e gp36 di HIV-2
Tuttavia, la sierologia presenta molti limiti:
fase iniziale (3-4 settimane): il cosiddetto periodo "finestra"
falsa positività in neonati da madri HIV (presenza di anticorpi sierici materni)
in una modesta percentuale di soggetti: risultati "borderline”
La diagnosi di infezione da HIV
Un risultato positivo all’ELISA va sottoposto ad esame "di conferma"
tramite Immunoblotting, utilizzando strisce caricate con i diversi peptidi di
HIV-1 e gp36 di HIV-2
L’immunoblotting negativo o sicuramente positivo non lascia dubbi
interpretativi e non prevede ulteriori indagini diagnostiche.
La diagnosi di infezione da HIV
Diagnostica Virologica = ricerca del virus
Isolamento del virus in colture di cellule
Determinazione dell’antigenemia (p24 nel sangue)
Determinazione di specifiche sequenze nucleotidiche (RNA virionico o
DNA pro-virale nel sangue)
La diagnosi di infezione da HIV
Isolamento del virus in colture di cellule è indicato anche:
a) nel follow-up del paziente per il monitoraggio del fenotipo
(sinciziogeno, a crescita rapida, etc.) dello stipite virale e/o della sua
resistenza ai farmaci antiretrovirali
b) nel monitoraggio delle varianti antigeniche circolanti in un determinato
territorio
Determinazione dell’antigenemia (p24 nel sangue)
Determinazione di specifiche sequenze nucleotidiche (RNA
virionico o DNA pro-virale nel sangue)
Il follow-up virologico del paziente
“viral load”
il livello e l’ andamento nel tempo, rappresentano il criterio essenziale
per:
a) definire la necessità di farmaci antiretrovirali,
b) giudicare l’efficacia del regime terapeutico in atto,
c) valutare l’andamento dell’infezione sotto il profilo prognostico
Per valutare il “viral load”:
1 - determinazione quantitativa del DNA provirale mediante PCR (PCR)
Indica l’ampiezza del “reservoir” di virus presente nell’organismo, non
sempre correlata alla intensità della replicazione virale
2 - determinazione della quantità di virus infettante presente nel sangue
periferico misurata in colture di cellule in vitro
3 - determinazione quantitativa di HIV-1 RNA nel plasma (mediante RTPCR o metodi analoghi)
Correlate alla infezione produttiva (replicazione) del virus
Il follow-up virologico del paziente
Il numero di molecole di HIV-1 RNA/ml di plasma (insieme alla
presenza di infezione “sintomatica” e/o al numero di linfociti T
CD4+) è utilizzato per
decidere l’inizio della terapia con farmaci antiretrovirali
valutare l’ efficacia del regime terapeutico in atto,
valutare la prognosi della malattia
La resistenza di HIV-1 ai farmaci
antiretrovirali
Durante la replicazione del genoma in HIV intervengono tre polimerasi:
Transcrittasi inversa virale
DNA pol
RNA pol
3x10-5 errori per base incorporata
Durante la prima fase dell’infezione, la popolazione virale sembra essere
monoclonale, con sequenze nucleotidiche virali omogenee
In seguito, durante il corso della malattia la popolazione virale è
disomogenea.
La presenza di mutanti resistenti impedisce il controllo dell’infezione
Vaccinazione anti-HIV:
problematiche …
Variabilità genetica del virus
Rapida replicazione, alta velocità di mutazione → mutanti immune-escape
Latenza e persistenza
HIV-1 infetta cellule CD4 alterando l’efficacia della risposta immune
Dubbia capacità del sistema immune a prevenire o controllare l’infezione da HIV-1
