retroviridae
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RETROVIRIDAE RETROVIRIDAE Acido nucleico Simmetria del capside Envelope Struttura del genoma Classificazione di Baltimore Polimerasi virale Diametro del virione (nm) Dimensione del genoma (kb) MLV (Murine Leukemia Virus) RNA Icosaedrica + ss (+) copie VI + 80-130 3,5-9 Three Retroviridae subfamilies: Subfamily Morph. groupExamples Oncoviruses Type A Intracisternal A Particles (non (noninfectious) Type B Mouse Mammary Tumor (MMTV) Type C Avian Sarcoma and Leukemia Murine Sarcoma and Leukemia Human T-cell leukemia virus (HTLV) Type D Mason Pfizer monkey (MPMV) Lentiviruses Visna, HIV, SIV Spumaviruses Human Foamy virus (cytopathic in vitro, no disease association) HIV AIDS (Acquired Immuno mmuno--Deficiency Syndrome) 1980/81- Segnalazione di focolai di polmonite da Pneumocystis carinii associata a segni evidenti di compromissione del sistema immunitario (immunodeficienza acquisita) q ) in ggiovani adulti (p (per lo p più maschi omosessuali: “gay g y pneumonia”) p ) e definizione “clinica” della sindrome. 1983 - Isolamento in Francia (L. Montagnier) e in U.S.A. (R. Gallo) del retrovirus oggi denominato HIV (human immunodeficiency virus ) ed inizialmente etichettato: LAV (Lymphoadenopathy associated virus) o HTLVIII ( perché erroneamente ritenuto correlato ai retrovirus oncogeni umani già ) noti: HTLV-I e HTLV-II). 1985 - Disponibilità dei primi reattivi (preparazioni di antigeni virali) per la ricerca di anticorpi. I virus responsabili dell’AIDS Oggi sono noti due virus responsabili della sindrome da immunodeficienza acquisita (AIDS) umana: HIV-1 e HIV-2 HIV-1 è diffuso in tutto il mondo ed è responsabile della maggior parte dei casi di AIDS HIV-2 è presente soprattutto in Africa occidentale, nei Caraibi e nell’America meridionale ed è di gran lunga meno virulento Virus analoghi, responsabili di sindromi assai simili (i (immunodeficienza d fi i acquisita), i it ) sono stati t ti di dimostrati t ti anche h iin varie i specie animali : scimmie (SIV), felini (FIV), etc. Caratteri generali di HIV-1 HIV-1 appartiene alla sottofamiglia Lentivirinae della famiglia Retroviridae I lentivirus hanno i caratteri generali dei retrovirus con i quali dividono gli aspetti essenziali del ciclo replicativo e l’organizzazione generale del genoma che presenta, però, in aggiunta ai “geni” fondamentali gag, pol ed env, una serie di “geni accessori e regolatori” che svolgono un ruolo essenziale nel ciclo replicativo del virus. HIV - The Virus Membrane: host derived T glycoproteins: Two l i gp160 160 gp120 120 andd gp41 41 gp41 is fusogen that spans the membrane sugars: immunosilent vaccine problem HIV - The Virus Group-Specific Antigens p17: inner surface - myristoylated p24: nucleocapsid p9: nucleocapsid associated with RNA GAG gene HIV - The Virus Enzymes y es • Polymerase (reverse transcriptase) • Integrase • Protease (cuts polyproteins) • POL gene HIV - The Virus HIV - Life History A retrovirus • Latency • Specific destruction of CD4+ cells •How does the virus enter the cell? HIV - Life History Entry into the cell T4 ((CD4+)) cells are major j target g Human HeLa Cell Human HeLa Cell transfected with CD4 antigen NOT INFECTED INFECTED But NOT the whole answer since this does not happen if CD4 is transfected into a MOUSE cell HIV - Life History • Fusion at ambient pH • No need for entry into lysosomes • Syncytia Profound significance g for AIDS progression Profound significance for therapy HIV - Life History Why do CD4-transfected human cells become infected but CD4-transfected mouse cells do not? Human cells must possess a co-factor for infection that mouse cells do not Co-Receptors CD8+ Cells MIP-1 alpha MIP-1 beta RANTES Chemokines Block HIV infection of macrophages HIV - Life History HIV chemokine CD4 CD4 CCR5 CCR5 macrophage Mutant CCR5 CD4 Le fasi del ciclo replicativo di HIVHIV-1 comprendono: L attacco dell L’attacco dell’antirecettore antirecettore (gp120) presente all all’esterno esterno dell’envelope, al recettore (CD4) ed ai co-recettori (CCR5, CXR4, etc) delle cellule sensibili, seguito dalla fusione dell’envelope con la membrana cellulare e dalla penetrazione del nucleocapside virale nel citoplasma TROPISMO Il tropismo cellulare di HIV-1 In vivo: Stipiti con capacità di crescere in CTL (stipiti linfotropi) Stipiti con capacità di infettare i MP (stipiti MPtropi), In vitro entrambi crescono bene in colture primarie di linfociti da sangue periferico Il tropismo cellulare di HIV-1 Gli stipiti ti iti virali i li macrofago f (MP)-tropi (MP) t i sono predominanti d i ti durante d t la fase asintomatica dell’infezione e si ritrovano costantemente durante il corso della malattia, il che suggerisce un loro ruolo essenziale nella persistenza dell’infezione La maggior parte del virus presente nei tessuti extra-linfoidi ed extravascolari l i è associata i aii MP Il tropismo cellulare di HIVHIV-1 Sebbene CD4 sia il recettore cellulare essenziale all’ancoraggio gg di HIV-1,, esso non è sufficiente a consentirne la penetrazione intracellulare Perchè si attivi il peptide fusogeno (gp41) e si inneschi la fusione dell’envelope virale con la membrana cellulare, l’antirecettore virale (gp120) ancorato al CD4 deve reagire con altre molecole di superficie (corecettori) Il tropismo cellulare di HIV-1 Gli stipiti MP-tropi legano alla superficie dei MP il recettore CC-CKR5 ( (specifico ifi per lle chemochine h hi RANTES RANTES, MIP 11α e MIP 1β) che h è essenziale i l per l’infettività degli stipiti MP-tropi Analoga funzione anche i recettori 2b (CKR2b) e CKR3 (specifico per la chemochina “eotaxin”) che però hanno una espressione più ristretta: Il tropismo cellulare di HIV-1 Gli stipiti di HIV-1 linfotropi utilizzano tili come co-recettore tt lla molecola l l di superficie fi i già ià nota t come LESTR (leukocyte expressed-seven transmembrane- domain-receptor) o “fusin” ed oggi denominata CX CKR4, che è il recettore per la chemochina SDF-1 (stromal cell-derived factor-1) Il tropismo cellulare di HIV-1 Gli stipiti di linfotropi , utilizzano come co-recettore la molecola di superficie già nota come LESTR (leukocyte expressed-seven transmembrane- domainreceptor) o “fusin” ed oggi denominata CX CKR4, che è il recettore per la chemochina SDF-1 (stromal cell-derived factor-1) Il tropismo cellulare di HIV-1 Tutti e due i principali co-recettori (CC CKR5 e CX CKR4) sono espressi alla superficie dei linfociti da sangue periferico in coltura primaria, il che spiega la loro sensibilità alla infezione sia con stipiti linfo-tropi sia con stipiti MP-tropi Il tropismo cellulare di HIV-1 La necessità di recettori di tipo p CC o CX CKR,, disponibili p alla superficie p delle cellule CD4+, per funzionare da co-recettori che consentano la fusione dell’envelope virale con la membrana cellulare, spiega perchè alcune chemochine (RANTES, MIP-1α, MIP-1β), legandosi ai rispettivi recettori ed impedendo l’attacco di gp120, possano avere azione “antivirale” Schema della interazione di HIV 1 HIV-1 con il recettore CD4 ed i diversi corecettori presenti alla superficie delle cellule sensibili Progenie virale Acquisizione del pericapside Rna (+) genoma Assemblaggio Trascrittasi inversa Endonucleasi/ integrasi Proteine strutturali Trascrizione AAAA TAR SpS Traduzione Proteine regolatrici Tat Rev RRE Proteasi Poliproteine Traduzione CD4 T-lymphocyte with mature HIV CD4 virions in cytoplasmic vacuoles Photo by Gelderblom, from Haseltine and Wong Wong--Staal, Scientific American 259: 259:53, 53, 1988. 1988. Replicazione La retrotrascrizione dell’ RNA del genoma virale in DNA (provirus) che viene poi circolarizzato ed integrato nel genoma cellulare, eventi favoriti da la replicazione della cellula infetta la attivazione della cellula infetta La trascrizione del provirus con la produzione di RNA genomico e dei vari m RNA per la sintesi delle poliproteine virus-specifiche La formazione delle varie proteine funzionali (proteasi), l’assemblaggio e la gemmazione dei virioni neoformati LTR vif LTR tat vpu gag nef pol vpr rev env Caratteri generali di HIVHIV-1 Organizzazione del genoma Oltre ai geni “strutturali” gag, pol ed env, HIV possiede almeno altri sei ggeni con funzioni accessorie o regolatrici g nel ciclo di replicazione virale LTR vif LTR tat vpu gag nef pol vpr rev env “gag” g g ((“group-Ag”) g p g ) codifica le p proteine del nucleo-capside p o “core” virale,, e la proteina della “matrice” virale In HIV-1 24-kD (p24) che forma il capside virale due proteine RNA-binding (p9/7 e p7/6) la proteina (p17) della “matrice” virale ( ruolo nella “gemmazione”) LTR vif LTR tat vpu gag nef pol vpr rev env “pol “, codifica la DNA-polimerasi RNA-dipendente o trascrittasi inversa e gli altri enzimi (ribonucleasi H, proteasi, integrasi) associati al virione LTR vif LTR tat vpu gag nef pol vpr rev env “env” codifica una poliproteina di 88 kD (p88) che viene glicosilata a gp160 La proteasi virale scinde il precursore gp160 nelle due glicoproteine dell’ envelope: gp120 e gp41 gp120 è la glicoproteina esterna coinvolta nel riconoscimento e nel legame al recettore gp41 è una proteina idrofobica che garantisce l’ancoraggio di gp120 attraverso legami non covalenti, è coinvolta nella fusione dell’envelope virale con la membrana cellulare LTR vif LTR tat vpu gag nef pol vpr rev env Geni “accessori” accessori e “regolatori” regolatori di HIV HIV--1 L’espressione dei geni con funzioni accessorie o regolatrici comporta complesse operazioni di “splicing” dei relativi RNAmessaggeri LTR vif LTR tat vpu gag nef pol vpr rev env “vif” vif (virion infectivity factor) codifica per p23, indispensabile per la produzione di virus extracellulare infettante (forse intervenendo nella elaborazione finale dei prodotti del gene “env” e nell’assemblaggio del “core” virale) Virioni defettivi in “vif” sono scarsamente infettanti per i linfociti o i macrofagi umani se aggiunti alle colture come virus libero, ma si ttrasmettono as etto o aancora co a eefficacemente cace e te da ce cellula u a a cellula ce u a LTR vif LTR tat vpu gag nef pol vpr rev env “vpu” p ((virion pprotein U)) presente solo in HIV-1, codifica una proteina di 15-16 kD che facilita il trasporto di gp120 verso la membrana cellulare. Sebbene non essenziale per la replicazione di HIV-1, vpu sembra avere un ruolo nel corretto assemblaggio e nella liberazione dei virioni neoformati LTR vif LTR tat vpu gag nef pol vpr rev env “vpr” p ((viral pprotein R)) codifica una proteina p di 14 kD che viene associata al virione neoformato, associata alla proteina p7/6 del nucleocapside Sembra avere un ruolo importante nel favorire il trasporto intranucleare del complesso nucleoproteico virale (genoma e proteine associate) che provvederà alla integrazione del DNA provirale nel genoma cellulare LTR vif LTR tat vpu gag nef pol vpr rev env “nef” (p27) (negative factor) associato ad una minore efficienza della replicazione di HIV in colture di cellule ll l patogenicità attenuata in vivo degli stipiti nef –defettivi Associata alla membrana cellulare, causa downregulation di CD4, provocandone la endocitosi e la degradazione nei fagolisosomi Coinvolta nel trasporto di proteine e/o nel signaling di membrana LTR vif LTR tat vpu gag nef pol vpr rev env “tat” (trans-activator (t ti t off transcription) t i ti ) consiste i t di due d di distinti ti ti esoni che codificano una proteina di 14 kD La proteina Tat è prodotta nella fase iniziale della trascrizione del provirus e agisce: LTR 5’ aumentandone la attività Transattivando la trascrizione di numerosi geni cellulari produttori di citochine, fattori di crescita, etc. anche in cellule non-infette (azione paracrina) LTR vif LTR tat vpu gag nef pol vpr rev env “rev” (regulator of expression of virion proteins) ( due esoni), codificano per p19 che favorisce il trasferimento nucleo-citoplasmatico di RNA-m unspliced La proteina Rev si lega agli m RNA virali in corrispondenza della sequenza RRE (Rev-responsive element) sita all’interno del gene env, proteggendoli dalle operazioni di splicing Rev è essenziale per il trasferimento nel citoplasma dell’RNA genomico e degli m RNA per lle proteine t i strutturali, t tt li li limitando it d altresì, lt ì iindirettamente, di tt t ((attraverso tt il blocco della produzione di RNA-m spliced) l’espressione propria e quella delle altre proteine accessorie e regolatrici Variabilità genetica di HIV-1 La trascrizione inversa non possiede i meccanismi di”controllo” presenti nella ll duplicazione d li i del d l DNA e compie i ““errori” i” che h sii ttraducono d nella ll comparsa di stipiti virali con caratteri diversi (quasi-specie) nei diversi individui infetti nelle diverse fasi della infezione dello stesso individuo La “variabilità” è particolarmente evidente a livello di alcune zone di “env” mentre altri geni (ad es. tat) sono molto più “conservati” Genetic variability of HIVHIV-1 Genotypes: M, N and O Within Withi M genotype, t subtypes bt ((clades): l d ) A A-K K High replication rate and high mutation rate = sequence diversity ¾ Up to 20% diversity in env within clade Sequence virus diversity affects immunogenic portions of Geographic distribution of HIV HIV--1 Subtypes (Clades) B B B B, C + others A, B + others C, B B C, E, B C, A, D, B, E + B La patogenesi dell’AIDS L’infezione da HIV è ematogena (si trasmette per scambio di siringhe con tracce di sangue infetto, per via omo- ed etero-sessuale, per trasmissione perinatale, attraverso la trasfusione di sangue o emoderivati infetti, etc.) Distribuzione dei casi di AIDS notificati in Italia, alla fine del 1° 1° trimestre 1999, a seconda delle modalità di trasmissione dell’infezione (numero stimato di soggetti infetti: > 130.000) Tossicod. Omosess. Eterosess. Trasfus. Trasfus Perinatal. Ignota Qu s tutti Quasi u ((> 95%) i sogge soggetti infetti e sv sviluppano upp o la malattia conclamata (con esito letale) dopo un lungo (anni) periodo di latenza clinica Latenza clinica, però, non vuol dire latenza virale L’infezione si accompagna p g ad una p progressiva g e sostenuta replicazione del virus (in particolare negli organi linfoidi) che, per tutto il periodo asintomatico, viene contrastata e contenuta dalla risposta immune dell’organismo, e ad una progressiva diminuzione dei linfociti T-CD4+ (normalmente circa 1.000/μl) Con la riduzione dei linfociti T-CD4+ al di sotto di una soglia critica (in genere, < 500/μl) e con la conseguente compromissione della capacità di risposta immune (soprattutto cellulo-mediata) inizia la fase sintomatica (AIDS) Le manifestazioni cliniche fondamentali sono rappresentate dalla comparsa di infezioni “opportunistiche”, dalla comparsa di tumori non usuali (linfomi cerebrali primitivi, sarcoma di Kaposi epidemico) e dalla compromissione del SNC (AIDS dementia complex) La patogenesi dell’AIDS La p progressione g verso la malattia è in rapporto pp alla quantità di virus infettante alla capacità replicativa del virus ai caratteri fenotipici del virus (è più rapida con la comparsa di varianti rapid/high) alla diminuzione nel numero dei linfociti T CD4+ (lisi dei CD4+ infetti) La patogenesi dell’AIDS è multifattoriale e non è esclusivamente riconducibile alla diretta distruzione di elementi cellulari ad opera della infezione virale Inexorable decline of CD4+ T4 cells Why do all of the T4 cells disappear? At early stages of infection only 1 in 10,000 cells is infected Late 1 in 40 Of great importance to therapeutic strategy Virus destroys the cell as a result of budding But few cells are infected: Early stage of infection 1:10,000 Late 1:40 1. PUNCTURED MEMBRANE Why do all T4 cells disappear? Why do all T T4 4 cells disappear? But syncytia not common Infected CD4 cell Most T4 cells are not HIV+ Cells Fuse Gp120 positive Could “sweep up” uninfected cells Killing of CD4 cells 2. Syncytium Formation Uninfected CD4 cell Gp120 negative Why do all T4 cells disappear? Cytotoxic T cell Killing of CD4 cells 3. Cytotoxic T cell-mediated lysis BUT: Most cells are not infected Killing of CD4+ cells 4 Binding 4. Bi di off ffree G Gp120 120 to t CD4 antigen makes uninfected T4 cell look like an infected cell Complement-mediated lysis Could account for the loss of uninfected T4 cells Why do all T T4 4 cells disappear? 5. Apoptosis of T4 cells. Apoptosis of T4 cells is normal in clonal deletion to overcome autoimmunity Also occurs with CD8 cells CD8 cell Macrophage (no CD4 antigen) gp120 HIV chemokine CXCR4 G protein signal i l ? ? Binding to CXCR4 results in expression of TNFalpha receptor II Binding to CXCR4 results in expression i off TNF-alpha on the cell surface Apoptosis of T cells CD8 cell Macrophage CXCR4 D h Death CD8 T cell apoptotic bodies Oltre alla diminuzione dei linfociti T CD4+, i soggetti infetti da HIV-1 presentano una serie di citopenie p p p periferiche in rapporto pp ad una p profonda compromissione delle capacità di sopravvivenza e di proliferazione dei progenitori ematopoietici (cellule CD34+) del midollo osseo e del sangue circolante Le cellule CD34+, tuttavia, non sono suscettibili alla infezione da HIV-1 e la loro compromissione è soprattutto la conseguenza dell’aumento di TGF-β1 endogeno, causato dalla interazione con gp120, e della esposizione al TGFβ1 esogeno iperprodotto dai MP stimolati da Tat. Un meccanismo ppatogenetico g analogo g è alla base delle lesioni del SNC I neuroni infatti non sono suscettibili alla infezione da HIV-1 e sono distrutti come conseguenza dell’azione “tossica” di proteine virus-specifiche (gp120) o di citochine o prodotti tossici elaborati dalle cellule accessorie (glia, astrociti) infette da HIV-1 Nella comparsa p di tumori non usuali e,, in p particolare,, nella comparsa p del sarcoma di Kaposi (angiosarcoma cutaneo) un ruolo essenziale sembra giocato dalla proteina Tat per le sue capacità di transattivare una serie di geni cellulari e di stimolare la replicazione cellulare attraverso segnali di membrana e da altri fattori (HHV-8 ?) I “long “long--term non progressors” < 5% di soggetti gg infetti da più p di 10-12 anni non p presenta segni g di malattia o di compromissione della risposta immune e possiede un numero normale (o comunque superiore a 500/μl) di linfociti T CD4+ ? -minore i capacità ità replicativa li ti del d l virus i infettante i f tt t (ad ( d es.: virus i nef-defettivi) f d f tti i) -elevata risposta immune ( MHC-I ristretta) dei linfociti T citotossici (CD8+) -iperproduzione di chemochine che bloccano i co-recettori -produzione di “fattori antivirali” (?) da parte dei linfociti T CD8+ -altro? La diagnosi di infezione da HIV L’ infezione da HIV, L HIV una volta verificatasi, verificatasi si mantiene costantemente attiva Sieropositività= p diagnosi g di infezione "in atto" La diagnosi di infezione da HIV La ricerca di anticorpi nei confronti di HIV Saggio immunoenzimatico (Enzyme-linked Immuno-sorbent Assay o ELISA) preparazioni di antigeni virali le cui caratteristiche consentano la rilevazione di anticorpi nei confronti di HIV-1 e HIV-2 e per il sottotipo O di HIV-1 La diagnosi di infezione da HIV Un risultato p positivo all’ELISA va sottoposto p ad esame "di conferma" Immunoblotting strisce con i diversi p peptidi p di HIV-1 e gp gp36 di HIV-2 La diagnosi di infezione da HIV L’immunoblottingg negativo g o sicuramente p positivo non lascia dubbi interpretativi e non prevede ulteriori indagini diagnostiche. La diagnosi di infezione da HIV Limiti della sierologia 1) fase iniziale (3-4 settimane): la cosiddetta "finestra" iniziale 2) neonati di madri infette da HIV (anticorpi sierici materni) 3) in una modesta percentuale di soggetti: risultati "borderline” Diagnostica Virologica: ricerca del virus. La diagnosi di infezione da HIV Isolamento del virus in colture di cellule indicata: a) nel follow-up del paziente per il monitoraggio del fenotipo (sinciziogeno, a crescita rapida, etc.) dello stipite virale e/o della sua resistenza ai farmaci antiretrovirali b) nel monitoraggio delle varianti antigeniche circolanti in un determinato territorio Determinazione dell’ antigenemia (p24 nel sangue) Determinazione dell’ RNAemia (RNA virionico o DNA pro-virale nel sangue) Il follow-up virologico del paziente “viral load” il livello e l’ andamento nel tempo, rappresentano il criterio essenziale per: a) definire la necessità di farmaci antiretrovirali, b) giudicare l’efficacia del regime terapeutico in atto, c) valutare l’andamento dell’infezione sotto il profilo prognostico Per valutare il “viral “viral load”: load”: 1 - determinazione quantitativa del DNA provirale mediante PCR (PCR) Indica l’ampiezza del “reservoir” di virus presente nell’organismo, non sempre correlata alla intensità della replicazione virale 2 - determinazione della quantità di virus infettante presente nel sangue periferico misurata in colture di cellule in vitro 3 - determinazione quantitativa di HIV-1 RNA nel plasma (mediante RT-PCR o metodi analoghi) Correlate alla infezione produttiva (replicazione) del virus Il follow-up virologico del paziente Il numero di molecole di HIV-1 RNA/ml di plasma (insieme alla presenza di infezione “sintomatica” e/o al numero di linfociti T CD4+) è utilizzato per decidere l’inizio della terapia con farmaci antiretrovirali valutare l’ efficacia del regime terapeutico in atto, valutare la prognosi della malattia Anti--HIV Strategies Anti Highly g y Active AntiRetroviral Therapy HAART: Two nucleoside analog RT inhibitors and 1 protease inhibitor Now also: Two nucleoside analog RT inhibitors and 1 non nucleoside La resistenza di HIV-1 ai farmaci antiretrovirali Per replicare il genoma di HIV intervengono tre polimerasi: Trasciptasi inversa virale DNA poll RNA pol 3x10-5 errori per base incorporata Durante la prima fase dell’infezione, la popolazione virale sembra essere monoclonale, con sequenze nucleotidiche virali omogenee In seguito, durante il corso della malattia la popolazione virale è disomogenea. Se non fosse per i mutanti resistenti, l’infezione potrebbe essere controllata. HIV poses special problems for vaccine development Genetic variability of the virus Rapid replication, high mutation rate → immune escape mutants Latency and persistence HIV-1 infects CD4 cells and broadly impairs immune responses p Immune evasion by virus Ability of the immune system to prevent or control HIV-1 infection is uncertain
