DIPARTIMENTO DI AREA CRITICA MEDICO CHIRURGICA
PROGETTO
Analisi proteomica della leucemia mieloide cronica
RESPONSABILE SCIENTIFICO: Prof.ssa Valeria Santini
COLLABORATORI: G. Ferrari, A. Gozzini, R. Pastorelli
La resistenza a Imatinib rappresenta un fattore critico per la terapia delle leucemie
mieloidi croniche (LMC). Con lo scopo di comprendere meglio il meccanismo
molecolare della resistenza a questo farmaco è stato intrapreso un approccio
proteomico sulla linea cellulare modello LAMA 84-S (sensibile a Imatinib) e LAMA
84-R (resistente a Imatinib). Gli estratti proteici celulari totali sono stati separati
mediante elettroforesi bidimensionale (2DE), e le mappe bidimensionali ottenute
sono state confrontate per stabilire la presenza di proteine con diverso livello di
espressione, poi identificate attraverso analisi in spettrometria di massa MALDITOF.
Sono state identificate quarantacinque proteine, ripartite in 5 classi funzionali: I)
Heat shock proteins e Chaperonine II) Proteine interagenti con gli Acidi Nucleici,
III) Proteine Strutturali, IV) Cell Signalling e V) Enzmi Metabolici.
In dettaglio, alcune Heat Shock Proteins, note per legare il complesso BcrAbl/Hsp90, sono risultate over espresse nelle cellule Imatinib Resistenti,
mostrando un possibile coinvolgimento nello stesso meccanismo di resistenza.
Al fine di indagare i possibili effetti sulla resistenza a Imatinib di farmaci
antitumorali della classe degli Inibitori delle Iston-Deacetilasi (HDACis), lo studio
proteomico delle LMC è stato ampliato alla caratterizzazione delle modificazioni
del fosfoproteoma e dell’acetiloma in seguito alla somministrazione di tali farmaci
some singoli agenti e in combinazione con Imatinib sulle linee cellulari modello.
Western blot bidimensionali sono stati realizzati con anticorpi specifici e confrontati
con gel bidimansionali relativi per il recupero delle spot di interesse e
l’identificazione tramite spettrometria di massa. Un numero significativo di proteine
è stato individuato modificare il proprio grado di acetilazione /fosforilazione in
seguito al trattamento con Imatinib/HDACis; la maggior parte di esse presenta ruoli
di chaperone o di shuttle.
ANALISI PROTEOMICA
DELLA LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA
Germano
Germano Ferrari,
Ferrari, Antonella
Antonella Gozzini,
Gozzini, Roberta
Roberta Pastorelli,
Pastorelli,
Valeria
Valeria Santini,
Santini, AUO
AUO Careggi
Careggi Dip.
Dip. DAC,
DAC, Unità
Unità Funzionale
Funzionale di
di Ematologia
Ematologia
LAMA 84-S
LAMA 84-R
In Gel
Gel
In
Digestion
Digestion
(Trypsin)
(Trypsin)
2D Gel
Gel
2D
Spot
Spot Excision
Excision
Peptides
Peptides
MS
Mass Spectrometry
Ultraflex MALDI TOF-TOF
MS/MS
MS/MS
(Bruker Daltonics, Bremen, Germany)
Database Search
(Theoretical
(Theoretical PMFs)
PMFs)
Peptide Masses
(Experimental Peptide Mass
Fingerprint)
Protein Identification
Results
8 in LAMA 84 R (HSP90, HSP60, Hsp70..)
3 in LAMA 84 S (gp96…)
7 in LAMA 84 R (hnRNPs, FUSE2)
3 in LAMA 84 S (FUSE bp 1)
Chaperones /HSP
11
Methabolism
11
Nucleic Acid Interacting
10
Structural
7
Cell Signaling
6
Equally represented in
LAMA 84R & S
3 in LAMA 84 R (VCP…)
4 in LAMA 84 S (Actinγ, Vimentin, αTubulin)
S CTRL
S +STI
S +VA
S +STI+VA
24% Vol Tot
S CTRL
18% Vol Tot
S +STI
51% Vol Tot
S +VA
48% Vol Tot
S +STI+VA
2D WB: Acetylated Proteins
SD GEL: Total Proteins
Spots to be identified
