Indagine sulla prevalenza di infezione da Bovine Viral Diarrhea

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Indagine sulla prevalenza di infezione
da Bovine Viral Diarrhea Virus tipo 2 (BVDV-2)
in allevamenti bovini da latte del Nord Italia
203
N
O
S. CAVIRANI1, G.L. ALBORALI2, M. BOLDINI3, C.S. CABASSI1, P. CORDIOLI4,
M. LUINI5, A. NIGRELLI6, S. TADDEI1, F. VEZZOLI5
1
Dipartimento di Scienze Medico-Veterinarie - Università di Parma, Italy
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell’Emilia Romagna,
Sezione Diagnostica di Brescia - Italy
3
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell’Emilia Romagna,
Sezione Diagnostica di Cremona - Italy
4
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell’Emilia Romagna, Sede di Brescia - Italy
5
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell’Emilia Romagna, Sezione Diagnostica di Lodi
Italy
6
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell’Emilia Romagna,
Sezione Diagnostica di Mantova - Italy
2
RIASSUNTO
Lo studio è stato allestito al fine di acquisire dati circa la prevalenza del virus della Diarrea Virale Bovina tipo 2 (BVDV-2) negli allevamenti bovini del Nord Italia, segnatamente della Pianura Padana. L’indagine si è svolta nel periodo 2009-2011 e ha visto il coinvolgimento di cinque laboratori diagnostici ubicati in altrettante province delle Regioni Lombardia ed Emilia Romagna, segnatamente Brescia, Cremona, Lodi, Mantova e Parma. L’area geografica di pertinenza è connotata da un’elevata densità di allevamenti bovini da latte, anche di grandi dimensioni e con animali di alto valore genetico. Pur in assenza di piani di
controllo-eradicazione ufficiali, si rileva da tempo una spiccata sensibilità da parte dei medici veterinari buiatri e degli allevatori nei riguardi della problematica BVD. Questo si traduce nell’allestimento di programmi aziendali, a carattere volontario,
mirati al controllo-eradicazione dell’infezione da BVDV che prevedono, oltre alla vaccinazione, la ricerca sistematica e la successiva eliminazione degli animali immunotolleranti, viremici persistenti.
Campioni di latte di massa, di sangue (in pool o singoli), feti abortiti, organi di animali venuti a morte con sospetta BVD sono stati testati mediante PCR o real-time PCR allestite per la rilevazione di BVDV-1 e 2. Inoltre emosieri da allevamenti non
vaccinati per BVDV sono stati testati mediante sierologia comparativa tramite test di sieroneutralizzazione (SN) verso entrambi i tipi virali. In totale l’indagine ha interessato 4.464 allevamenti da latte.
Le procedure di diagnosi diretta (PCR o real-time PCR) hanno consentito di rilevare la presenza di BVDV-2 nel 2,9% degli allevamenti considerati. La diagnosi indiretta (SN) ha dimostrato la presenza d’infezione da BVDV-2 nel 4% degli allevamenti.
In alcuni casi BVDV-1 e 2 sono risultati co-presenti nello stesso allevamento.
I dati ottenuti consentono di affermare che BVDV-2, introdotto in Italia nel 1999 veicolato da un vaccino contaminato, è tuttora presente ma la prevalenza dell’infezione è da ritenersi bassa. Ciò risulta in accordo con la situazione epidemiologica europea ma è in contrasto con quella statunitense caratterizzata da un’ampia diffusione di BVDV-2 sia tra i bovini da latte che
da carne. Sono state fatte diverse ipotesi per giustificare tale difformità ma ancora non si è pervenuti ad una spiegazione scientificamente esaustiva.
PAROLE CHIAVE
Bovino da latte, BVDV-2, Italia.
INTRODUZIONE
Il virus della Diarrea Virale Bovina (BVDV) appartiene alla
famiglia Flaviviridae, genere Pestivirus. Considerato causa di
considerevoli danni economici per l’allevamento bovino, sia
da latte che da carne, BVDV è oggetto di programmi di eradicazione ufficiali in diversi paesi europei. Si rileva inoltre
una forte, diffusa sensibilità circa il controllo della virosi anche in aree, fra cui l’Italia, dove non sussistono programmi di
controllo-eradicazione strutturati. I danni arrecati dall’infe-
Autore per la corrispondenza:
Sandro Cavirani ([email protected]).
zione sono difficilmente quantificabili in quanto non strettamente riconducibili alla sintomatologia clinica evocata dal
virus, ma piuttosto da ascriversi allo stato di immunodepressione acuta che consegue al patotropismo del virus per le
strutture linfoidi, linfociti circolanti e macrofago alveolare
inclusi1,20. Detta evenienza favorisce la piena espressione patogenetica di altri microrganismi co-presenti ed il manifestarsi della relativa sintomatologia clinica. Ciò, indipendentemente dalla gravità del quadro clinico, è da ritenersi comunque un evento negativo in quanto non necessariamente
induce a formulare una diagnosi di sospetto di BVD, ma può
risultare addirittura fuorviante nel perseguimento della diagnosi di infezione-malattia da BVDV2,10,17.
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Indagine sulla prevalenza di infezione da Bovine Viral Diarrhea Virus tipo 2 (BVDV-2) in allevamenti bovini da latte
Dal punto di vista biotipico si riconoscono ceppi di BVDV
connotati da attività citopatogena in vitro (BVDVcp) e ceppi
sprovvisti di tale caratteristica (BVDVncp). Sul versante tassonomico si riconoscono 3 genotipi virali, segnatamente
BVDV tipi 1, 2 e 3, i quali a loro volta presentano innumerevoli subgenotipi11. Seppur con connotazioni cliniche difformi, tutti e tre i genotipi virali in parola condividono l’attitudine ad evocare patologia primaria nel bovino.
Per quanto attiene all’Italia la prima segnalazione circa la
presenza di BVDV-1 nel bovino risale al 19683. Di recente l’isolamento di BVDV-1 è stato segnalato anche nel bufalo14.
Invece la rilevazione della presenza di BVDV-2 data 1999 ed
è da ricondurre all’utilizzo di un vaccino IBR-marker contaminato da BVDV-2 ncp8.
Da ultimo, nel 2011 è stato rilevato nel bovino BVDV-37, di cui,
stante il recente isolamento, non sono attualmente disponibili
dati circa la sua diffusione nei nostri allevamenti. Diversamente è ben chiara l’entità della diffusione di BVDV-1, sia tra i bovini da latte che da carne. Seppur i dati reperibili in letteratura,
indicativi di un’ampia diffusione dell’infezione da BVDV-1 negli allevamenti bovini italiani, risultino datati4,5,15,17, i riscontri
derivanti dall’attività diagnostica routinariamente eseguita
presso i nostri laboratori confermano l’attuale, elevata prevalenza dell’infezione da BVDV-1. E ciò indipendentemente da
area geografica, attitudine produttiva, stato clinico e regime
vaccinale dei bovini allevati. Attraverso tipizzazione molecolare degli stipiti virali isolati, è stata fatta chiarezza sui diversi subgenotipi di BVDV-1 circolanti nel nostro territorio6,9,13.
BVDV-2, isolato per la prima volta negli USA nel 199416, è
tradizionalmente associato a malattia grave ad elevata mortalità. La malattia, sulla scorta del quadro clinico-ematologico,
viene indicata come sindrome emorragica a carattere trombocitopenico. Successivamente all’introduzione di BVDV-2
in Italia, sono stati segnalati sporadici isolamenti di questo
genotipo virale. Alla stregua di BVDV-1, è da sottolineare il
reperto di ceppi di BVDV-2 nella pecora in corso di malattia
riconducibile clinicamente alla ben più diffusa Border Disesase (BD). Di interesse è la dimostrazione che BVDV-2 ha circolato in Italia tra gli ovi-caprini fin dal 199018.
Ritornando alla questione epidemiologica relativa al binomio BVDV-2 - bovino si rileva che in Italia, come nel resto
d’Europa, e diversamente dagli USA, dove la prevalenza d’infezione è elevata19, il reperto di questo virus in corso di malattia nel bovino è evento infrequente. Attualmente mancano
dati epidemiologici di una certa consistenza che possano
meglio definire il grado di diffusione di BVDV-2 negli allevamenti bovini del Nord Italia. Pertanto, questo studio si è
posto come obiettivo la raccolta di dati relativi alla rilevazione di BVDV-2 in allevamenti bovini ubicati nell’area padana.
I dati di seguito riportati si riferiscono ad attività diagnostica eseguita presso diversi laboratori situati nell’area geografica di riferimento. Tale attività è stata prevalentemente volta
all’individuazione dei bovini immunotolleranti, persistentemente infetti (PI) da BVDV: approccio che rappresenta il
cardine dell’azione di controllo-eradicazione dell’infezione.
MATERIALI E METODI
Animali e allevamenti
L’indagine ha avuto come riferimento temporale il triennio
2009-2011 ed ha visto il coinvolgimento di 5 laboratori dia-
gnostici ubicati nelle province di Brescia, Lodi, Cremona,
Mantova e Parma.
La dimostrazione di BVDV tipi 1 e 2 ha riguardato:
– campioni di latte di massa da 1.572 allevamenti processati mediante real-time Polimerase Chain Reaction (real-time PCR);
– pool di emosieri o sangue in toto (15-20 campioni/pool)
da 993 allevamenti processati mediante real-time PCR;
– campioni singoli di emosiero o sangue in toto di 12.470
animali da 578 allevamenti processati mediante PCR o
real-time PCR;
– feti abortiti in numero di 326 provenienti da 288 allevamenti processati mediante PCR o real-time PCR;
– organi di 455 animali morti a seguito di sintomatologia o
con lesioni riconducibili a BVD, appartenenti a 188 allevamenti e processati mediante PCR o real-time PCR;
– emosieri da 9.670 animali appartenenti a 845 allevamenti
non vaccinati verso BVDV che sono stati sottoposti ad indagine sierologica comparativa mediante sieroneutralizzazione (SN), eseguita in parallelo sullo stesso siero verso
BVDV-1 e BVDV-2.
In totale l’indagine ha riguardato 4.464 allevamenti da latte.
METODICHE DI LABORATORIO
Estrazione dell’RNA
L’estrazione dell’RNA è stata fatta mediante un protocollo di
estrazione tradizionale con guanidina tiocianato-fenolocloroformio.
RT-PCR
Una PCR nested e multiplex, che prevede l’utilizzo di primers che permettono l’amplificazione di una porzione del
gene NS5B, è stata utilizzata per rilevare e genotipizzare
BVDV. La retrotrascrizione e la prima amplificazione sono
state combinate in single-step.
Due microlitri di estratto di RNA sono stati addizionati al volume di reazione (50 µl finali), contenente 2,5 mM MgCl2,
PCR Buffer (20 mM Tris-HCl [pH 8,4], 50 mM KCl), 0,2 mM
dNTPs, (Invitrogen), 0,25 µg dei seguenti primers: 5’ AAGATCCACCCTTATGA(A/G)GC 3’ (posizione 10385-10404
del ceppo NADL) e 5’ AAGAAGCCATCATC(A/C)CCACA 3’
(posizione 11528-11547 del ceppo NADL), 5 U di inibitore di
RNasi (Invitrogen), 50 U di retrotrascrittasi (M-MulV, Invitrogen) e 1.5 U di Taq DNA polimerasi (Invitrogen). Alla retrotrascrizione, effettuata alla temperatura di 37°C per 30
min, sono seguiti una iniziale denaturazione a 94°C per 3
min, 25 cicli di amplificazione (94°C per 20 s, 50°C per 30 s e
72°C per 30 s) ed una fase finale a 72°C per 15 min.
Due microlitri dell’amplificato sono stati quindi utilizzati
per la seconda PCR, effettuata con 40 cicli di amplificazione nelle stesse condizioni della prima, ma in assenza di inibitore di RNasi, retrotrascrittasi e dei primers della prima
amplificazione ed in presenza dei seguenti primers: 5’ TGGAGATCTTTCACACAATAGC 3’ (posizione 10758-10779
del ceppo NADL, specifico per BVDV-1), 5’ GGGAACCTAAGAACTAAATC 3’ (posizione 10514-10533 del ceppo
NADL, specifico per BVDV-2) e 5’ GCTGTTTCACCCAGTT(A/G)TACAT 3’ (posizione 11096-11117 del ceppo
NADL). Controlli di reazione positivi e negativi sono stati
inseriti in ogni prova. Gli amplificati (604 paia di basi per
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entrambi citopatogeni, in ragione di 100 DCP50 per pozzetto. Dopo contatto siero-virus di 2 ore a 37°C, è stata aggiunta una sospensione di cellule della linea MDBK. Trascorso il periodo di incubazione determinato dalla comparsa di effetto citopatico (ECP) nel controllo contenente il solo virus, si è proceduto alla valutazione del titolo anticorpale mediante end point dilution, che individua quale titolo
anticorpale la più alta diluizione del siero in grado di neutralizzare l’ECP virale. La normalizzazione del titolo anticorpale è stata ottenuta mediante conversione logaritmica
(log2) del reciproco della diluizione. In considerazione del
grado di cross-reattività attesa, la reazione sierologica è stata considerata tipo-specifica qualora sia emersa una differenza di titolo di almeno 3 volte verso uno dei due virus oggetto di test.
RISULTATI
Figura 1 - Visualizzazione su gel di agarosio dei risultati della nested-multiplex RT-PCR verso BVDV-1 e 2.
BVDV-1 e 360 paia di basi per BVDV-2) sono stati visualizzati mediante colorazione con bromuro di etidio su gel di
agarosio al 2% (Figura 1).
Real-time RT-PCR
Per la ricerca e la genotipizzazione di BVDV mediante realtime PCR è stata utilizzata una coppia di primers specifici
per regioni conservate della 5’ UTR di BVDV-1 e 2: 5’ CTCGAGATGCCATGTGGAC 3’ (posizione 224-242 del ceppo
NADL) e 5’ CTCCATGTGCCATGTACAGCA 3’ (posizione
391-371 del ceppo NADL). Due sonde TaqMan, 5’ FAM
CAGCCTGATAGGGTGCTGCAGAGGC BHQ-1 3’ e 5’
Texas-Red CACAGCCTGATAGGGTGTAGCAGAGACCTG
BHQ-2 3’, sono state utilizzate per il riconoscimento di
BVDV-1 e 2, rispettivamente.
La retrotrascrizione e l’amplificazione sono state combinate
in single-step. Cinque microlitri di estratto di RNA sono stati addizionati al volume di reazione (25 µl finali), contenente
12,5 µl di 2↔ QuantiTect Probe RT-PCR Master Mix (Qiagen), 0,25 µl di QuantiTect RT Mix (Qiagen), 0,4 µM di ognuno dei primer e 0,2 µM di ognuna delle sonde. Alla retrotrascrizione, effettuata alla temperatura di 50°C per 30 min, sono seguiti una iniziale denaturazione a 95°C per 15 min e 45
cicli di amplificazione (94°C per 15 s, 60°C per 60 s).
Controlli di reazione positivi e negativi sono stati inseriti in
ogni prova. I campioni sono stati considerati positivi per
BVDV-1 con valori di Ct per la sonda FAM compresi tra 5 e
40 e per BVDV-2 con valori di Ct per la sonda Texas Red
compresi tra 5 e 40. Le metodiche indicate hanno subìto modifiche non sostanziali a seconda dei diversi laboratori diagnostici coinvolti nello studio.
Sieroneutralizzazione comparativa
verso BVDV tipi 1 e 2
Ogni siero in esame è stato testato in parallelo nei confronti di BVDV tipi 1 e 2. Allo scopo il siero è stato distribuito
in doppio in pozzetti di piastre microtiter e sottoposto a diluizioni seriali da 1/2 a 1/256. Quindi le singole repliche sono state cimentate rispettivamente contro un ceppo di
BVDV tipo 1 (stipite Singer) e BVDV tipo 2 (stipite 125),
I risultati delle indagini diagnostiche di tipo diretto (PCR e/o
real-time PCR) sono riportati nella Tabella 1. Nel complesso
dette indagini hanno dimostrato una prevalenza di BVDV-2
pari al 2,9% sul totale delle rilevazioni di BVDV.
Le indagini diagnostiche di tipo indiretto (sierologia comparativa) eseguite su 845 allevamenti hanno rilevato positività
di gruppo per BVDV-1 n. 811 (95,9%), BVDV-2 n. 10 (1,2%)
BVDV 1 e 2 n. 24 (2,8%). Il dato complessivo che emerge
dall’indagine sierologica è che BVDV-2 era presente nel 4%
sul totale degli allevamenti sieropositivi per BVDV.
DISCUSSIONE
I dati ottenuti dalle indagini eseguite confermano e meglio
definiscono quanto già emerso in corso di esperienze precedenti condotte su casistiche ben più limitate. Si rafforza
pertanto l’evidenza di una netta prevalenza del genotipo 1
rispetto al genotipo 2 nel contesto dei ceppi di BVDV circolanti negli allevamenti da latte che insistono nell’area di
pertinenza del presente studio. Detto ciò, vale rimarcare
che BVDV-2 ha circolato e continua a circolare nella popolazione bovina domestica. Un aspetto degno di menzione si
riferisce al fatto che in ambito di allevamento la presenza di
BVDV-2 solo raramente si appalesa attraverso la comparsa
di sintomi clinici ritenuti caratterizzanti di detto genotipo
virale, ovvero di sindrome emorragica associata a trombocitopenia. L’infezione infatti generalmente assume i connoTabella 1 - Rilevazione di BVDV tipi 1 e 2 mediante PCR e/o realtime PCR sui campioni testati.
Tipologia
del campione
N. campioni
BVDV tipo 1
BVDV tipo 2
Latte di massa
1.572
141 (8,9%)
10 (0,6%)
993
79 (7,9%)
–
12.470
829 (6,6%)
18 (0,1%)
Feti abortiti
326
37 (11,3%)
–
Organi da
animali morti
455
134 (29,5%)
6 (1,3%)
Pool di emosieri o
sangue in toto
Emosiero o
sangue in toto
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Indagine sulla prevalenza di infezione da Bovine Viral Diarrhea Virus tipo 2 (BVDV-2) in allevamenti bovini da latte
tati tradizionalmente ascrivibili all’infezione-malattia da
BVDV-1.
Ricollegandoci al quadro clinico tradizionalmente evocato
da BVDV-2, va detto che la comparsa di episodi, anche ricorrenti su base aziendale, di sindrome emorragica del vitello, segnalati con frequenza crescente a partire dal 2007,
hanno indotto a intensificare l’attività diagnostica postmortem sui soggetti colpiti da tale forma al fine di discriminare tra l’infezione da BVDV-2 e la pancitopenia neonatale
del bovino, conseguente ad assunzione di colostro proveniente da madri immunizzate con un vaccino inattivato
contenente BVDV-1, oggi peraltro non più disponibile in
commercio. Gli esiti degli accertamenti di laboratorio hanno pressoché costantemente escluso il rapporto di causalità
tra BVDV-2 e la malattia osservata. Con ciò riaffermando
quanto sopra indicato.
Sul versante epidemiologico rimane ancora insoluto il quesito riguardante la difformità del panorama statunitense, connotato da un’ampia diffusione dell’infezione da BVDV-2, rispetto a quella europea, Italia inclusa, dove all’introduzione
di questo tipo virale nella popolazione bovina9 non ha fatto
seguito un’altrettanto ampia diffusione della virosi. Gli
esperti statunitensi imputano l’elevata diffusione di BVDV-2
al pressante utilizzo di vaccini contenenti BVDV-1 che, inducendo una robusta immunità di popolazione verso questo tipo virale, avrebbe favorito la selezione e la diffusione di
BVDV-2. Pur non entrando nel merito di detta ipotesi, va comunque osservato che in molte aree d’Europa, allevamenti
padani inclusi, la vaccinazione verso BVDV-1 è largamente
diffusa e tutti i vaccini impiegati contengono solo BVDV-1.
Quindi il quesito rimane aperto e la spiegazione deve essere
ricercata altrove.
Una possibile spiegazione di questo aspetto potrebbe essere
data dal fatto che la presenza di BVDV-2 assume una significativa rilevanza tra i ceppi di BVDV circolanti negli allevamenti ovi-caprini italiani18. Ciò potrebbe indicare che il virus
presente nei nostri allevamenti bovini abbia in realtà come
ospite elettivo gli ovi-caprini e i bovini rappresentino invece
un ospite incidentale. Pertanto, in questa evenienza il virus
troverebbe, nel caso di quest’ultima specie, una certa difficoltà in termini di trasmissione e diffusione intraspecifica.
Tuttavia tale ipotesi necessita di ulteriori dati a conferma.
❚ Investigation on the prevalence
of BVDV-2 in dairy cattle herds
of Northern Italy
SUMMARY
The study was aimed at obtaining data regarding the prevalence of Bovine Viral Diarrhea Virus type 2 (BVDV-2) in
dairy cattle population of the Po Valley, Northern Italy. The
survey was carried out in the period 2009-2011 and involved five diagnostic laboratories located in five provinces of
Lombardia and Emilia Romagna regions, namely Brescia,
Cremona, Lodi, Mantova e Parma. The area is characterized
for a high density of bovine dairy herds, even large herds
rearing animals with high genetic value. Despite of the lack
of official control-eradication programmes by Authorities,
the consciousness about BVD damages is widespread
among practitioners and dairy farmers. Therefore, voluntary control-eradication programmes to BVDV are set up
on herd level. The programmes, besides the vaccination
practice, provided for detection and cull of persistently infected (PI) animals.
Bulk milk, blood samples, aborted foetuses and specimens
from organs of cattle died for suspected BVD were examined by PCR or real-time PCR to detect BVDV-1 and 2. In
addition blood serum samples from BVDV unvaccinated
herds were submitted to comparative serology through serum neutralization test (SN) to both the viral types. On
the whole 4,464 dairy herds were submitted to diagnostic
investigation.
Direct diagnostic tests (PCR or real-time PCR) allowed
BVDV-2 to be detected in 2.9% of the examined herds. Indirect diagnostic test (comparative SN) showed 4% of the tested herds positive for BVDV-2 infection. Sometimes both
the viral types were present together in a single herd.
Taken together our data pointed out that BVDV-2, introduced in Italy in 1999 by a contaminated vaccine, at present circulates among the considered cattle population but the prevalence is low. So that BVDV-1 must be considered the most
relevant viral type circulating among the domestic dairy cattle population. This evidence is consistent with the epidemiological situation of other European Countries but in
contrast with the US picture where BVDV-2 infection is widespread in dairy and beef cattle. The reason of this epidemiological disagreement is not yet elucidated.
CONCLUSIONI
KEY WORDS
Indipendentemente dalla specificità della tematica oggetto di
questo studio, i dati ottenuti ripropongono la pressante attualità della problematica BVDV nel suo complesso e della
relativa gestione in ambito di allevamento bovino. La presenza di tre tipi virali distinti e di innumerevoli subgenotipi9,13 è la chiara dimostrazione di come questo virus sia propenso a cambiare. Questo ci impone di esercitare una costante azione di sorveglianza epidemiologica volta alla caratterizzazione genotipica e antigenica degli stipiti di BVDV
isolati nel corso del tempo e nelle diverse aree geografiche.
Tale azione travalica meri aspetti di ordine virologico ed epidemiologico ma assume valenza compita se contestualizzata
in un processo di valutazione circa l’adeguatezza immunizzante-protettiva dei presìdi vaccinali attualmente disponibili
che, sia inattivati che vivi-attenuati, ormai includono ceppi
virali comunque datati.
Dairy cattle, BVDV-2, Italy.
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