PROSPETTO MODULO A
650
DOMANDA DI BREVETTO PER INVENZIONE INDUSTRIALE
DATA DEPOSITO: 10 dicembre 2007
NUMERO DOMANDA:
A. RICHIEDENTE/I
COGNOME E Nome O DENOMINAZIONE, RESIDENZA O STATO,
1) ENEA - Ente per le Nuove Tecnologie, l'Energia e l'Ambiente, di nazionalità italiana, con sede in
Lungotevere Grande Ammiraglio Thaon di Revel, 76 -00196 Roma; e 2) UNIVERSITA' DEGLI STUDI DI ROMA
"LA SAPIENZA", di nazionalità italiana, con sede a Piazzale Aldo Moro, 5 - 00185 ROMA.
C. TITOLO
PER LA DETERMINAZIONE DELLA ATTIVITA' N 1 -N8 SPERMIDINA, SPERMINA, ACETIL
RASI (SSAT) MEDIANTE USO DI INIBITORI DELLA ATTIVITA' POLIAMMINO OSSIDASI (PAO)
SEZIONE
CLASSE
SOTTOCLASSE
GRUPPO
SOTTOGRUPPO
E. CLASSE PROPOSTA I
O. RIASSUNTO
Un metodo per la valutazione della attività dell'enzima spermidina/spermina N 1,N8acetyltrans-ferase (SSAT) in qualsiasi estratto
cellulare, eucariote o procariote, che prevede di usare i naturali substrati (spermidina — SPD, oppure spermina — SPM),
quantizzandone i relativi prodotti acetilati, N-acetilSPD e N-acetilSPM, in presenza di almeno un inibitore della attività
dell'enzima poliammino ossidasi (PAO), che naturalmente metabolizza entrambe le forme acetilate per produrre SPD da NacetilSPM e putrescina (PUT) da N-acetilSPD. Tale metodo comporta il vantaggio di non dover usare sostanze eterologhe
(amantadina) o radio-chimiche ([C 14] AcetilCoA) nei mix di reazione.
P. DISEGNO PRINCIPALE
FIRMA DEL / DEI
RICHIEDENTE / I
650
Descrizione
dell'invenzione
industriale
dal
titolo: "METODO PER LA DETERMINAZIONE DELLA
ATTIVITA'
N 1 -N 8
SPERMIDINA,
SPERMINA,
ACETIL
TRANSFERASI (SSAT) MEDIANTE USO DI INIBITORI DELLA
ATTIVITA' POLIAMMINO OSSIDASI (PAO)", a nome:
ENEA - ENTE PER LE NUOVE TECNOLOGIE,L'ENERGIA E
L'AMBIENTE, di nazionalità italiana con sede a
Lungotevere Grande Ammiraglio Thaon di Revel 76
00196 ROMA; e
UNIVERSITA' DEGLI STUDI DI ROMA "LA SAPIENZA", di
nazionalità italiana con sede a Piazzale Aldo Moro
5, 00185 ROMA.
Inventori designati:
AMENDOLA Roberto e MARCOCCI Lucia
DESCRIZIONE
SOMMARIO DELL'INVENZIONE
La presente invenzione si riferisce ad un
metodo per la valutazione della attività
dell'enzima spermidina/spermina N 1 ,N 8 acetyltransferase (SSAT) in qualsiasi estratto cellulare,
eucariote o procariote, usando i naturali
substrati (spermidina - SPD, oppure spermina SPM) e quantizzandone i relativi prodotti
acetilati in presenza di almeno un inibitore della
attività dell'enzima poliammino ossidasi (PAO).
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Descrizione dell'invenzione industriale dal
titolo: "METODO PER LA DETERMINAZIONE DELLA
ATTIVITA' N'-N 8 SPERMIDINA, SPERMINA, ACETIL
TRANSFERASI (SSAT) MEDIANTE USO DI INIBITORI DELLA
ATTIVITA' POLIAMMINO OSSIDASI (PAO)", a nome:
ENEA - ENTE PER LE NUOVE TECNOLOGIE,L'ENERGIA E
L'AMBIENTE, di nazionalità italiana con sede a
Lungotevere Grande Ammiraglio Thaon di Revel 76
00196 ROMA; e
UNIVERSITA' DEGLI STUDI DI ROMA "LA SAPIENZA", di
nazionalità italiana con sede a Piazzale Aldo Moro
5, 00185 ROMA.
Inventori designati:
AMENDOLA Roberto e MARCOCCI Lucia
DESCRIZIONE
SOMMARIO DELL'INVENZIONE
La presente invenzione si riferisce ad un
metodo per la valutazione della attività
dell'enzima spermidina/spermina N',N 8 acetyltransferase (SSAT) in qualsiasi estratto cellulare,
eucariote o procariote, usando i naturali
substrati (spermidina - SPD, oppure spermina SPM) e quantizzandone i relativi prodotti
acetilati in presenza di almeno un inibitore della
attività dell'enzima poliammino ossidasi (PAO).
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STATO DELLA TECNICA
Le poliammine PUT, SPD, SPM sono composti
naturali indispensabili per la vita umana, anche se il
loro ruolo non è stato ancora completamente chiarito.
Sia l'aumento che la diminuzione di poliammine provoca
danno cellulare. Queste evidenze scientifiche hanno
portato ad un crescente interesse sull'utilizzo delle
poliammine come ipotetico farmaco anti-cancro, ed
hanno giustificato una maggiore attenzione nella
comprensione dei meccanismi naturali di controllo del
metabolismo stesso.
Le
poliammine
vengono
sintetizzate
dalla
molecola più semplice PUT, via ornitina decarbossilasi
(ODC) in un processo ciclico di anabolismi e
catabolismi che coinvolge come enzima chiave del
catabolismo l'enzima SSAT (Amendola et al., 2005)
L'enzima (SSAT), è distribuito ubiquitariamente
nei tessuti di mammifero, a livelli di espressione
molto bassa. SSAT catalizza il trasferimento dei
gruppi acetilici dall'acetilCoA al dominio aminopropilico delle poliammine, intervenendo nel
metabolismo ciclico degradativo ed escretorio delle
poliammine che ne permette una continua omeostasi
all'interno delle cellule (Wallace, 2003).
SSAT viene regolato in tutti i passaggi che
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650
permettono ad un gene di essere attivo a partire dalla
sua codifica sul DNA
(trascrizionale,
stabilità
dell'mRNA, traduzione e stabilità proteica)
dimostrando così un suo ruolo chiave nella vita
cellulare (Fogel-Petrovic. et al., 1997).
Il gene SSAT contiene un promotore responsivo
sia alle poliammine naturali sia agli analoghi delle
poliammine (Wang et al., 1998), e questo concorre al
suo ruolo di enzima limitante il contenuto di SPM, e
SPD all'interno della cellula.
SSAT viene regolato positivamente da una serie
di stimoli tossici per la cellula (infiammazione,
trattamento con analoghi, etc) (Pledgie et al., 2005)
ma in modo non esclusivo. Infatti, esperimenti di
irraggiamento e trattamento con chemioterapici non ne
evidenziano tale ruolo (Amendola et al., 2005;
Lindsay& Wallace, (1999), ipotizzando in tal senso
una risposta tessuto specifica (Bianchi et al., 2007).
Riveste quindi di grande interesse la conoscenza
dell'esistenza di una specificità di risposta di SSAT
in relazione alla differente biologia di un tessuto
tumorale rispetto ad un tessuto sano.
In considerazione del basso numero di molecole
di SSAT e dal suo alto turn-over degradativo e
regolativo, gli studi di cinetica enzimatica ed i
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650
saggi biochimici sono di difficile realizzazione.
Attualmente esistono due metodi per valutare la
attività enzimatica di SSAT:
Saggio
in
vitro
radio-chimico,
tramite
l'utilizzo del precursore marcato [C"] AcetilCoA e
conta delle conte-per-milione (cpm) di gruppi
acetitilici marcati dopo trasferimento enzimatico
(Matsui et al., 1981);
Saggio in vitro tramite l'uso di un composto non
naturale: l'Amantadina (AMA), che viene
artificialmente aggiunto alla miscela di saggio, ed
analisi di Acetil-AMA prodotta tramite cromatografia
liquida ad alta pressione (HPLC). Questo saggio è
stato protetto come brevetto numero US2002/132280,
inventori D.S. Sitar, A. P. Bras, Università di
Manitoba, Canada).
Il primo metodo risulta maggiormente in uso, o
forse esclusivamente, in quanto non risultano, ad oggi
lavori scientifici, a prescindere da quello degli
autori, che hanno utilizzato il secondo come metodo di
analisi, né in attività di ricerca e né in attività di
diagnostica clinica.
Entrambi i metodi sopracitati hanno comunque
l'inconveniente di non permettere l'analisi diretta
della attività SSAT naturale, comportando la necessità
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650
di dover usare sostanze eterologhe come l'amantadina o
radiochimiche come la [C] AcetilCoA nei mix di
reazione.
Compito del presente trovato è quello di
superare tali inconvenienti, ricorrendo ad un saggio
diretto che analizzi il metabolita naturale fornendo
una resa migliore di quello che prevede l'uso di
sostanze eterologhe nella miscela di reazione ed
evitando le procedure ed i costi di radioprotezione
obbligatori per legge quando si ricorre a sostanze
radiochimiche.
Ciò è stato ottenuto mettendo a punto un metodo
per determinare l'attività SSAT in qualsiasi estratto
cellulare, eucariote o procariote, che comprenda il
passaggio di valutare un campione in analisi come
sopra descritto tramite derivatizzazione chimica di
qualsivoglia natura (colorimetrica e/o fluorimetrica)
dei substrati naturali della SSAT stessa in presenza
di un inibitore dell'enzima poliammino ossidasi PAO.
A tale soluzione gli inventori sono giunti
ponendo la loro attenzione sul fatto che l'enzima SSAT
metabolizza SPD e SPM a N-acetilSPD e N-acetilSPM e
questi a loro volta sono facilmente metabolizzati
dalla poliammino ossidasi (PAO). La PAO metabolizza
infatti le forme acetilate, ed in particolare
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650
metabolizza N-acetilSPM producendo SPD, e N-acetilSPD
producendo putrescina (PUT).
Di conseguenza, l'uso di uno o più inibitori
della poliammino ossidasi (FAO) permette di valutare
l'attività della SSAT naturale quantizzando l' NacetilSPD e l'N-acetilSPM presente nel metabolita
naturale.
In particolare, secondo il trovato, il substrato
naturale è spermidina o spermina, mentre l'inibitore
della FAO è preferibilmente N,N9-bis(2,3-butadienyl) 1.4-butanediamina (acronimo: MDL 72,527).
Una preferita forma di attuazione del metodo che
si descrive prevede, come step iniziale, la
preparazione degli estratti di tessuto o di cellule,
seguito dal dosaggio della SSAT attraverso la via di
acetilazione della SPD ed infine dalla rilevazione
cromatografia mediante HPLC (High Liquid Performance
Chromatography), dove il salto inventivo è
rappresentato dall'utilizzo di inibitori della FAO nel
passaggio che prevede il dosaggio della SSAT via
acetilazione di SPD.
Ulteriori caratteristiche e vantaggi del metodo
secondo l'invenzione risulteranno evidenti dalla
descrizione dettagliata che segue che illustra le
diverse fasi del procedimento.
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650
Preparazione degli estratti da tessuto animale
(fegato, rene).
tessuti
vengono
prelevati
dai
topi
sperimentali previa anestesia con Avertin (250 mg/Kg)
iniettato i.p. e sacrificio per esposizione gassosa
alla anidride carbonica. I tessuti vengono lavati in
tampone di omogeneizzazione (TO) a 4 ° C (Tris-HC1 20
mM pH 7.5, 5 mM EDTA e 5 mM DDT) per aumentare la
stabilità dell'enzima durante l'omogeneizzazione e
sospesi in due volumi di TO ed omogeneizzati
meccanicamente e tramite sonicazione per 2 minuti.
L'omogeneizzato e' quindi
per 1 hr a 4
centrifugato a 100,000xg
° C (Beckman L8-80M,
con rotore T80) ed
il supernatante conservato come fonte di
spermidina/spermina N1-N8 acetii transferasi (SSAT).
La concentrazione delle proteine nel sopranatante e'
dosata usando metodi colorimetrici (es. Bradford) e
comparato ad una curva standard ottenuta facendo uso
di albumina da siero bovino, pura a concentrazione tra
1 e 10 mg/ml.
Preparazione degli estratti da cellule in
coltura.
Si raccolgono 15x10 6 cellule e si sospendono in 1
ml di TO freddo. Si sonica come sopra ma con tempi
inferiori (2 x 20 secondi). L'omogeneizzato e' quindi
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650
centrifugato a 20,000 g per 10 mm n a 4 0 0 (Beckman L880M, con rotore T80) ed il supernatante conservato
come fonte di spermidina/spermina N1-N8 acetil
transferasi (SSAT). La concentrazione delle proteine
nel sopranatante e' dosata come sopra.
Procedura per il dosaggio della SSAT via
acetilazione di SPD
Il
presente
dosaggio
innovativo
dell'acetilazione della spermidina viene ottenuto in
seguito all'incubazione della spermidina con acetil
coenzima A (acetil CoA) seguendo due diverse
procedure:
a)
Sistema non rigenerante dell'acetil CoA:
Si preparano in triplicato le provette
all'interno delle quali si aggiungono 60 pl di
spermidina 30 mM preparata in acqua (concentrazione
finale 3 mM), 120 pl di Acetil coenzima A 0,5 mM
preparata in acqua (concentrazione finale 0.1 mM), 120
pl di tampone non rigenerante, Tris HC1 250 mM pH 7,5
contenente 5 mM EDTA e 5 mM DTT (concentrazione finale
Tris HC1 50 mM, EDTA 1mM, 1 mM DTT);
b)
Sistema rigenerante dell'Acetil- CoA:
Si preparano in triplicato le provette
all'inteno delle quali si aggiungono 60 pl di
spermidina 30 mM preparata in acqua (concentrazione
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69)
finale 3 mM), 120 pl di Acetii coenzima A 0,5 mM
preparata in acqua (concentrazione finale 0.1 mM), 120
pl di tampone rigenerante, Tris HC1 250 mM pH 7,5
contenente 5 mM EDTA e 5 mM DTT, acetii carnitina 25
mM, acetii carnitina/CoA acetil transferasi (CAT) 5
U/m1 (concentrazione finale Tris HC1 50 mM, EDTA 1mM,
l mM DTT, acetil carnitina 5 mM, acetil carnitina/CoA
acetii transferasi (CAT) 1U/m1).
Il
passaggio
innovativo
è
rappresentato
dall'incubazione di 300 pl di sopranatante contenenti
0,5-2 mg proteici con 6 pl di N,N- bis (2.3butadieny1)-1,4-butanediamina (acronimo: MDL 72,527)
per 30 min. La concentrazione finale di MDL è di
0.05mM in acqua ed è usato al fine di inibire la
poliammino ossidasi (PAO). Le provette sono quindi
incubate a 37
° C. Ad intervalli di tempo di 0, 30, 60
mm n ai campioni si aggiungono 30 pl di soluzione acido
perclorico (PCA) 6 N per porre fine alla reazione. I
campioni sono conservati a -20
° C fino al momento
della derivatizzazione con dansil cloruro per il
dosaggio in HPLC.
Vengono preparati due diversi campioni bianco:
a)
in assenza di spermidina (si aggiungono nella
provetta 60 pl di acqua;
b) in assenza di sopranatanti ( si aggiungono nella
10
650
provetta 300 pi di Tris HC1 20 mM pH 7.5 contenente 5
mM EDTA e 5 mM DTT e 1 pl di MDL 72527 5 mM).
Come inibitore della PAO, oltre alla MDL 72,527
possono essere utilizzate altre sostanze tra cui 1,8diaminooctano, 1,12-diaminododecano, N-prenilagmantina
(acronimo: G3), Guazantina, 1-idrossibenzilossiamina.
Dosaggio in HPLC della formazione della NAcetilSPD
Estrazione delle poliamine
I campioni vengono scongelati, agitati, aggiunti
con 40 pl di Di-amino-ottano (DIAO) 0.08 mM e lasciati
incubare in ghiaccio per 1 ora, per permettere
l'estrazione delle poliamine.
Si centrifuga quindi a 15,000g per 20 mm n e si
prelevano 500 pl di sopranatante.
A questi si aggiungono 200 pl di dansil cloruro
preparato a concentrazione di 10 mq/mi in acetone e
200 pl di Na2003 saturo. Si incuba al buio a bagnomaria
a 60
° C per 1 ora. Alla fine dell'incubazione si
aggiungono 130 pl di prolina preparata a
concentrazione di 100 mg/ml in tampone fosfato 20 mM
pH 7,2 e si incuba a temperatura ambiente al buio per
30 min. Si procede quindi all'estrazione delle
poliamine. Si aggiungono 750 pl di toluene, si vortica
per 30 secondi, quindi si centrifuga a 15,000g per 5
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650
mm n e si prelevano 700 pl di sopranatante. Al volume
rimasto si aggiungono ulteriori 750
pi di toluene, si
vortica e centrifuga nuovamente a 15,000g per 5 mm n e
si prelevano altri 700 pl di sopranatante che sono
aggiunti all'aliquota precedentemente prelevata.
L'estratto in toluene (volume totale 1400 pl) e'
quindi essiccato in uno Speed vac per 30 mm n a
temperatura media.
Corsa cromatografica in HPLC
I campioni essiccati sono sciolti in 300 pl di
una miscela acetonitrile:acqua=70:30, sonicati in un
sonicatore a bagno per 15 mm, filtrati con Minisart
RC 4 quindi iniettati in un loop da 50 pL in una
colonna cromatografica Supercosil LC18-5 29cmx4,6 mm 5
pm. La separazione avviene facendo uso di un gradiente
costituito dal mescolamento del Solvente A (acqua:
acetonitrile:metanolo =5:3:2) e del solvente B
(acetonitrile:metanolo=3:2)
secondo
schema:
Tempo
A
B
O
72
28
5
72
28
47
36
64
50
20
80
55
15
85
60
10
90
61
72
28
12
il
seguente
650
L'attività'
della
SSAT
e'
valutata
dalla
formazione della AcSPD osservata nei sopranatanti
sottratta per la formazione della AcSPD ottenuta nei
campioni bianco incubati in assenza di sopranatanti da
omogenati. La presenza delle poliamine e' rivelata
dalla fluorescenza del derivato dansilato letto con un
rivelatore fluorimetrico posizionato ad una lunghezza
d'onda di eccitamento di 338 nm ed ad una lunghezza
d'onda di emissione di 490 nm. La quantizzazione della
acetil spermidina e' riferita a standard di acetil
spermidina contenenti un totale di 125 pmoli di
derivato dansilato.
La presenza della inibizione della attività FAO
(in questo caso ottenuta con l'uso di MDL ma
ottenibile con altri composti) permette l'analisi
diretta della attività SSAT NATURALE, comportando il
vantaggio di non dover usare sostanze eterologhe
(amantadina) o radio-chimiche ([ 14 0] Acetil-CoA) nei
mix di reazione. Nel primo caso, oltre al vantaggio di
analizzare il metabolita naturale, si ha una resa
migliore del saggio in quanto, in estratti di fegato
di topo, la Km di acetilazione della SSAT nei
confronti di SPD è risultata circa 3 volte inferiore
(267 +/- 46 uM) rispetto alla Amantadina (738 +/- 157
uM) (Bras A., et al., 2001).
13
650
Nel secondo caso,
la presente
invenzione
presenta il vantaggio del saggio diretto rispetto al
saggio radiochimico indiretto, ed inoltre il non uso
di sostanze radio-chimiche evitando le successive
procedure e costi di radioprotezione obbligatori di
legge.
In parallelo, su aliquote di estratti trattati
come sopra è stata effettuata una analisi comparativa
mediante il metodo classico in uso radiochimico
seguendo il protocollo descritto in Matsui et al.
1981.
Tutti i risultati ottenuti sono schematizzati
nella tabella che segue e nelle tavole di disegni
allegate in cui sono riportati i risultati ottenuti
con la metodica innovativa adottata e il confronto
degli stessi risultati con la metodica attualmente
vigente per la determinazione dell'attività di SSAT.
In particolare nelle tavole:
la fig. 1 è un cromatogramma rappresentativo di
HPLC relativo ai prodotti da analizzare per la messa a
punto del sistema effettuato su concentrazioni
scalari; nell'asse X sono indicati i tempi di
ritenzione (TR) caratteristici dei singoli composti.
La SPD ha un TR di 60 fuori della scala di questa
determinazione;
14
650
le figg.2a e 2b sono cromatogrammi di HPLC
relativi a controllo del fondo del segnale ottenuti
rispettivamente da miscele di reazione in assenza di
estratto cellulare, e miscele di reazione con estratto
cellulare in assenza di substrato (SPD);
le figg.3a e 3b mostrano due cromatogrammi di
HPLC relativi alla quantizzazione della forma
acetilata della SPD, proporzionale alla attività
enzimatica di SSAT da analizzare, rispettivamente in
presenza di inibitore della attività enzimatica PAO,
(MDL 72,527) ed in assenza dell'inibitore MDL 72,527;
la fig.4 mostra un grafico della misura del
fondo del segnale in relazione al tempo di incubazione
della reazione, in presenza ed assenza di sistema
rigenerante gruppi acetilici (vedi testo). Linea
piena, in presenza di sistema rigenerante; linea
spezzata, assenza di sistema rigenerante. Tempo di
incubazione: l, 0 min.; 2, 60 min.; 3, 120 min.; 4,
180 min.;
la fig.5 mostra un grafico della misura della
quantità di attività SSAT espressa come produzione
pmoli/mg proteina /minuti di incubazione di estratti
di fegato di topo (quadrato), estratti cellulari
(tondo) ed estratto di rene di topo (triangolo)
effettuata con il metodo oggetto del trovato;
15
650
la fig.6 mostra un grafico della misura della
quantità di attività SSAT espressa come produzione
pmoli/mg proteina proteina /minuti di incubazione di
estratti cellulari (quadrato), estratto di fegato di
topo (tondo) ed estratto di rene di topo (triangolo)
effettuato con la attuale tecnica radio-chimica.
dati
statistici
relativi
all'analisi
effettuata sono riportati nella tabella che segue :
Tabella I
TEMPO DI INCUBAZIONE =
Cellule
(mg)
0,5
60 mmn
Media
dev.
stand.
Err.
stand.
CI 95%
0,1
24,8
44,17
90,03
0,08
25,02
44,32
89,91
0,12
24,93
43,95
91,06
0,00
24,92
44,15
90,33
0,05
0,09
0,15
0,52
0,03
0,05
0,09
0,30
0,102191
0,171945
0,58408
0,5
1
0,4
98,65
198,26
0,2
105,64
200,65
0,1
97,35
199,67
0,23
100,55
199,53
0,12
3,64
0,98
0,07
2,10
0,57
4,119452
1,110044
2
402,36
389,36
405,54
399,09
7,00
4,04
7,920245
Rene (mg)
0,5
0,01
1,35
2,54
3,98
0,001
0,99
2,78
4,01
0,2
1,02
1,84
4,06
0,07
1,12
2,39
4,02
0,09
0,16
0,40
0,03
0,05
0,09
0,23
0,02
0,184556
0,451249
0,03734
2
Fegato
(mg)
2
Si evidenzia una assoluta sovrapponibilità dei
dati ottenuti con il metodo innovativo della presente
invenzione rispetto al metodo conosciuto ed in uso
radio-chimico. Questo è altresì in linea con quanto
16
650
già pubblicato in letteratura. In tessuto animale di
fegato, i valori radiochimici riportati sono di 290
pmol/min/mg di proteina (Matsui et al., 1981). Nel
tessuto renale, in assenza di sopra induzione di SSAT
il dato è stato riportato di valore vicino allo zero
(Wang et al., 2004). Infine, in diversi estratti
cellulari da colture in linea, i valori riportati sono
di decine di pmoli/min/mg proteico, in accordo al
presente lavoro (Porter et al., 1991; Vulcic et al,
2000).
Per quanto attiene all'uso del metodo oggetto
della presente invenzione, esso può trovare immediata
applicazione:
a) nel seguire il decorso terapeutico di classi
di analoghi delle poliammine come farmaci antitumorali
in pazienti affetti da tumori solidi ed in tutti quei
casi in cui si correli l'attività di SSAT a condizioni
patologiche quali carcinoma gastrico, ovarico, tumore
del seno, del rene colorettale o prostatico, leucemia
mieloide acuta e cronica, linfoma;
b)
nel seguire l'efficacia del trattamento
terapeutico nei casi di cui sopra;
c)
come indice terapeutico per il danno da
ischemia per riperfusione, (IRI) associato ai tessuti
renali, infarto del miocardio.
17
654)
BIBLIOGRAFIA
1. Amendola et al., (2005) Biochim. Biophysic.
Acta Rev. Cancer 1755 15.
2. Bianchi et al., (2007) BBA MCR, E pub 9
feb.
3. Bras A., et al., (2001)Drug metabolism and
deposition, 29;676.
4. Fogel-Petrovic. et al., (1996) FEBS Letter,
89.
5. Lindsay& Wallace, (1999) Biochem. J. 337
83.
6. Matsui et al.,
(1981) J. Biol. Chem.256
2454.
7. Pledgie et al., (2005) J. Biol. Chem. 280
39843.
8. Porter et al. (1991) Cancer Res. 51 3715.
9. Vujcic et al. (2000) J. Biol. Chem. 275
38319.
10. Wallace et al., (2003) Biochem J. 376 1.
11. Wang et al., (2004)., J. Am. Soc. Nephrol.,
15:1844.
18
650
RIVENDICAZIONI
1)
Metodo per la determinazione della
attività SSAT in qualsiasi estratto cellulare di
organismi eucarioti o procarioti, caratterizzato
dal fatto che prevede la valutazione di un
campione in analisi tramite derivatizzazione
chimica di qualsivoglia natura (colorimetrica e/o
fluorimetrica) dei substrati naturali della SSAT
stessa in presenza di un inibitore dell'enzima
poliammino ossidasi PAO.
2)
Un metodo secondo la rivendicazione
precedente caratterizzato dal fatto che
l'inibitore dell'enzima poliammino ossidasi PAO è
un qualsiasi inibitore di cofattore FAD in grado
di inibire l'attività PAO.
3)
Un metodo secondo la rivendicazione
precedente caratterizzato dal fatto che
l'inibitore dell'enzima poliammino ossidasi PAO è
scelto tra i seguenti:
a)
N,N-
(2.3-butadieny1)-1,4-
bis
butanediamina (acronimo: MDL 72,527);
b)
1,8-diaminooctano;
c)
1,12-diaminododecano;
d)
N-prenilagmantina (acronimo: G3);
e)
Guazantina;
19
650
1-idrossibenzilossiamina;
f)
4)
Un metodo secondo la rivendicazione
precedente
caratterizzato
l'inibitore
della
PAO
dal
è
il
fatto
che
N,N9-bis[2,3-
butadieny1]-1,4-butanediamine, (MDL 72,527).
5)
Un metodo secondo la rivendicazione l
dove il substrato naturale è la spermidina.
6)
Un metodo secondo la rivendicazione l
dove il substrato naturale è la spermina.
7)
Un metodo secondo la rivendicazione 5 o
6 caratterizzato dal fatto che il dosaggio del
substrato della SSAT è equivalente a 1-4 mg/kg.
8)
Un metodo secondo la rivendicazione l
in cui, precedentemente al saggio di
quantizzazione, il/i substrati naturali di SSAT
vengono incubati con estratti eucariotici o
procariotici in presenza di quantità efficaci di
inibitori della PAO.
9)
Un metodo secondo la rivendicazione 7
in cui il tessuto eucariote è di mammifero e
specificatamente sangue e/o urina.
10)
Un metodo secondo la rivendicazione l
in cui il saggio viene effettuato tramite High
Liquid Performance Chromatography (HPLC).
11)
L'uso
di
un
metodo
20
secondo
la
650
rivendicazione l per la diagnosi in vitro di
condizioni patologiche correlate all'attività di
SSAT quali carcinoma gastrico, ovarico, tumore del
seno, del rene, colorettale o prostatico, leucemia
mieloide acute e croniche, linfoma.
12)
L'uso
di
un
metodo
secondo
la
rivendicazione l per la diagnosi in vitro di
disfunzioni renali e ischemia per riperfusione,
(IRI) correlate all'attività di SSAT.
13)
L'uso
di
un
metodo
secondo
la
rivendicazione l per seguire in vitro il decorso
terapeutico di classi di analoghi delle poliammine
come farmaci antitumorali in pazienti affetti da
tumori solidi.
Per le Richiedenti
Il Rappresentante
21
650
1/4
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650
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VALUTAZIONE BACKGROUND ANALISI
100
80
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3
Tempo incubazione (mm)
Simboli:
Cellule + substrato
Solo substrato
Solo cellule
FIG. 4
4
650
4/4
Attività SSA T
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400
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Conc. proteica (mg)
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Attività SSAT
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CL
50
concentrazione proteica
FIG. 6
2
650
