Trasformazione degli Organismi Vegetali - e

Trasformazione
degli
Organismi Vegetali
Trasformazione di Organismi Vegetali
•  La trasformazione di un organismo vegetale offre l'opportunita' di
introdurre geni sia omologhi che eterologhi. Queste cellule vengono,
quindi, rigenerate producendo piante transgeniche che contengono
ed esprimono la nuova informazione genetica.
•  La maggior parte delle piante transgeniche viene generata usando
due metodi generali che sono:
*
La trasformazione mediata da Agrobacterium
(metodo indiretto)
*
La trasformazione diretta con DNA
(tecniche biolistiche, elettroporazione, permeabilizzazione di
protoplasti mediata da PEG)
Agrobacterium
 batterio Gram-negativo del suolo in grado di infettare numerose
piante dicotiledoni inducendo, in corrispondenza di una lesione,
caratteristiche alterazioni tumorali
 La virulenza di questi batteri è associata alla presenza di grossi
plasmidi
 un frammento di DNA batterico (T-DNA) viene trasferito dal
batterio alla cellula vegetale e si integra STABILMENTE nel genoma
della pianta, inducendo nelle piante infettate le caratteristiche
modificazioni morfologiche e differenziative.
Agrobacterium in natura……
Agrobacterium in natura……
Il trasferimento del T-DNA
•  Il contatto cellulare è mediato dall’ interazione di proteine batteriche di
adesione superficiale con specifici recettori della cellula vegetale. Le proteine
di Agrobacterium implicate nell'ancoraggio alla cellula vegetale sono
codificate dai geni chv, mentre i recettori vegetali sono proteine vitronectinalike.
•  Il sistema di percezione-trasduzione del segnale utilizzato da Agrobacterium
è del tipo a due componenti in cui una his chinasi recettoriale, dopo aver
percepito un segnale specifico, si autofosforila e trasferisce un residuo fosfato
ad un secondo componente indipendente attivandone le proprieta' di
attivatore trascrizionale. Nel caso di Agrobacterium il recettore e'
rappresentato da VirA, mentre il trasduttore e' VirG. In seguito alla sua
attivazione, VirG attiva tutti i geni vir legandosi a specifiche Vir box presenti
sui loro promotori.
•  I geni vir portano alla produzione di una copia a singolo filamento del T-DNA,
T-strand, complementare al filamento codificante del T-DNA. Il T-strand a
singolo filamento viene exciso, ed il T-DNA ds è ricostituito ad opera del sistema
di riparo della cellula batterica.
•  Il T-strand ssDNA viene ricoperto da ss-binding proteins che lo proteggono
dall'attacco di proteasi e gli conferiscono una forma bastoncellare che ne facilita
l'ingresso nella cellula vegetale utilizzando un pilus formato dall'assemblagio di
proteine codificate dal batterio.
•  L'intero processo di attraversamento del canale richiede energia fornita da
attivita' ATPasica batterica.
•  La traslocazione del complesso T-strand-proteine al nucleo sembra essere
mediato sia da VirD2 che da VirE2. Entrambe le proteine batteriche che
presentano il Nuclear Localization Signals (NLS). Dopo aver raggiunto la
membrana nucleare vegetale il complesso T-strand-proteine entra nel nucleo e
il T-strand si integra casualmente e stabilmente nel genoma vegetale.
La sindrome crown gall
Il T-DNA integrato nelle cellule vegetali presenta tre classi di geni:
•  geni che codificano per l’ormone vegetale auxina
•  il gene che codifica per l’ormone vegetale citochinina
•  geni che sintetizzano degli zuccheri coniugati ad aminoacidi detti opine
I fitormoni aux e ck sono sintetizzati utilizzando vie metaboliche di origine
batterica. Queste attività enzimatiche permettono la proliferazione delle
cellule trasformate. Le cellule trasformate sintetizzano anche le opine, che gli
Agrobatteri utilizzano come fonte di energia, e queste tre classi di geni
costituiscono un sistema che favorisce selettivamente la crescita di
A.tumefaciens.
Dai plasmidi Ti ai Vettori Binari
•  I plasmidi Ti non sono adatti ad essere usati come vettori di trasferimento,
perché:
•  sono troppo grandi
•  non hanno siti di restrizione adatti per i clonaggi molecolari
•  inducono tumori vegetali
•  L’analisi molecolare dei plasmidi Ti ha dimostrato che, mentre RB ed LB
sono essenziali per il trasferimento del T-DNA, il T-DNA stesso non lo è.
•  E’ stato dimostrato sperimentalmente che qualunque sequenza di DNA
inclusa tra le border repeats (LB e RB) viene trasferita nelle cellule vegetali
dall’apparato di trasferimento di Agrobacterium
Dai plasmidi Ti ai Vettori Binari
•  Il sistema di trasformazione utilizza due vettori separati:
Un plasmide Ti "disarmato”, i.e. contenente i geni vir, che agiscono in
trans, ma deleto della regione del T-DNA;
Un vettore contenente: l’origine di replicazione, il gene per la
resistenza alla kanamicina (nptII), un MCS contenente il gene per la βgalattosidasi, ed i due border repeats (RB e LB). Al loro interno, inoltre, si
trovano un polylinker ed un gene marcatore (resistenza antibiotici/erbicidi)
sotto controllo di un promotore vegetale.
Vettore Binario
Trasformazione di Piante
Quindi per trasformare le piante con YFG……..
•  Si clona YFG in un vettore binario e si traforma E. coli
•  Dopo controlli, si trasforma Agrobacterium con il plasmide ricombinante
•  Con l’Agrobacterium ricombinante si trasformano le piante
N.B.
-  Agrobacterium si trasforma mediante elettroporazione
-  Le colonie ricombinanti di Agrobacterium vengono selezionate per
antibiotico-resistenza e controllate mediante PCR su colonia
-  Il ceppo di Agrobacterium che utilizziamo porta il vettore Ti disarmato
(mantenuto sotto resistenza)
excisione di dischi fogliari
di circa 2 mm
Breve incubazione dei dischi
fogliari con una coltura di
Agrobatteri (5-10 x 106/ml)
contenenti il gene d’interesse
clonato in un vettore binario
Co-coltivazione in terreno a
basso rapporto auxina/
citochinina, in presenza di
cefotaxime e di Km
Dopo la germinazione i trasformanti
sono trasferiti in terreno di radicazione
L’elettroporazione
•  E’ possibile trasformare specie monocotiledoni con Agrobacterium ma,
l’efficienza è molto bassa, dunque, nonostante l’interesse agronomica di queste
specie, l’uso di Agrobacterium non è consigliabile.
Un modo più efficace consiste nell’introduzione diretta del DNA usando
metodi fisico-chimici
• 
Il metodo più efficace è l’elettroporazione di protoplasti. Un’alta
concentrazione di DNA viene mescolata a una sospensione di protoplasti e
sottoposta ad un intenso campo elettrico dell’ordine di 250-500 V/cm.
•  Efficienza di trasformazione: 0,1-l’1% x protoplasti di riso e di mais
Promotore per cellule vegetali
gene d’interesse
Microparticelle (1µm)
di tungsteno
Ap
ori
Precipitazione del DNA
sulle microparticelle
Percussore
microproiettile
Caricamento del cannoncino balistico
Tessuto vegetale bersaglio
Piastra di trattenimento
Carica a salve
microparticelle rivestite di DNA
Arabidopsis thaliana
eletta pianta modello su 250000 piante
Perché Arabidopsis???
•  “generation time” molto breve: un ciclo vitale in 5/6 settimane
•  taglia piccola
•  genoma nucleare piccolo, distribuito su 5 cromosomi
•  produzione di un gran numero di “eredi”
•  poco DNA ripetuto
•  facilmente trasformabile ad alta efficienza
I sistemi modello
Puya raimondii è un pessimo sistema
modello: Fiorisce ogni 100 anni e
raggiunge i 10 metri di altezza. Non si
conosce nulla della sua genetica e del suo
genoma
Arabidopsis thaliana è un buon sistema
modello: fiorisce dopo 1 mese,
raggiunge i 30-50 centimetri di altezza e
cresce bene in laboratorio.
Come si trasforma Arabidopsis?
•  Infiltrazione sotto vuoto di piante a fiore di Arabidopsis con una
sospensione di Agrobacterium trasformato con un vettore binario
•  Efficienza di trasformazione variabile da 200/1000 trasformanti/
pianta, dipendente da diversi fattori:
•  Stadio di sviluppo della pianta
•  Concentrazione dell’Agrobacterium (OD>.8)
•  Tempo di incubazione sotto vuoto (=20 min.)
•  Vettore binario utilizzato
Come avviene la trasformazione???
•  I trasformanti sono emizigoti per l’evento di inserzione (per il T-DNA)
•  Ogni trasformante è frutto di un evento indipendente
•  La trasformazione riguarda sia i tessuti vegetativi che quelli riproduttivi
•  Qual è l’organo/i riproduttivo/i che viene trasformato?
Strategie molecolari
per studiare la funzione di un gene nelle piante
Aumento espressione del gene endogeno:
•  forte costitutiva
•  ectopica
•  inducibile
Riduzione/silenziamento del gene endogeno:
•  AntiSENSO
•  RNAi
•  co-soppressione
(transgeni causano un silenziamento di geni endogeni che hanno identità
di sequenza)
  Knock Out del gene.....
•  genetica forward
•  genetica reverse
Knock Out del gene.....
mutagenesi sito-specifica
v/s
mutagenesi inserzionale “random”
Nelle piante No mutagenesi sito-specifica !!!!!
Quindi............
mutagenesi inserzionale “random”
O…….Genome editing: Talen, Crisp/Cas9
GENETICA FORWARD E REVERSE
Obiettivo: assegnare una funzione ad ogni gene
Forward Genetics:
il metodo classico per determinare la funzione di un gene si basa sull’isolamento e
analisi di mutazioni in quel gene: mutagenesi sistematica delle sequenze geniche
per produrre collezioni di mutazioni (prevalentemente recessive) di tipo “loss of
function”. Utilizzando varie tecniche di clonaggio si risale alla sequenza genica.
Reverse Genetics:
La disponibilità della sequenza del genoma di molte specie ha reso possibile un
diverso approccio per la determinazione della funzione di un gene. A partire da
una sequenza genica è possibile isolare la linea mutante in cui l’elemento
inserzionale è all’interno della sequenza d’interesse. Dallo studio fenotipico del
mutante, si può dedurre la funzione del gene.
Fenotipo???
Fenotipo
FORWARD
mutante
mutante
T-DNA
T-DNA
Gene
REVERSE
PCR-screening
Funzione??
Strategia di Isolamento Mutanti
LB
Kana/Basta
Raccolta semi T1
RB
In Planta
Vacuum Infiltration
T0
Selezione in serra
dei trasformanti T1
resistenti
Autoimpollinazione
T2
Analisi in vitro
delle plantule Kr
Ks
Raccolta semi T2
Kr
•  Analisi dei mutanti Kana resistenti
•  Propagazione di piante omo ed eterozigoti
Knockology
Ma il T-DNA è correlato
(responsabile del) con il fenotipo mutato???
•  Analisi di segregazione
del marcatore e eventualmente del fenotipo mutante
(inserzione T-DNA in 1 o più loci??)
•  Caratterizzazione molecolare del sito di inserzione
(T-DNA singolo, a tandem oppure inserzione più complessa??)
•  Clonaggio delle “Flanking Sequences”
Analisi di segregazione
T2 Plants
aa(Kr/Kr)
96
1
Aa(Kr/Ks)
193
2
AA(Ks/Ks)
94
1
Total
383
autoimpollinazione
T3 Plants
a
b
c
e
aa(Kr)
24
25
27
121
Aa(Kr/Ks)
47
46
55
0
Ks
26
24
28
Total
97
95
110
0
121
Ma il T-DNA è correlato
(responsabile del) con il fenotipo mutato???
•  Analisi di segregazione
del marcatore e del fenotipo mutante
(inserzione T-DNA in 1 o più loci??)
•  Caratterizzazione molecolare del sito di inserzione
(T-DNA singolo, a tandem oppure inserzione più complessa??)
•  Clonaggio delle “Flanking Sequences”
x
0,6
0,23
4,4
0,9
Digestione EcoRV: 0.23 Kb e 4,4 Kb interne al T-DNA
x Kb fino al sito EcoRV sulla flanking sequence
NT
Caratterizzazione Molecolare
del sito di inserzione
4,4 Kb
1,8 Kb
RB-LB IR
0,23 Kb
4,4 Kb
1,2 Kb
RB-RB DR
0,23 Kb
Ma il T-DNA è correlato
(responsabile del) con il fenotipo mutato???
•  Analisi di segregazione
del marcatore e del fenotipo mutante
(inserzione T-DNA in 1 o più loci??)
•  Caratterizzazione molecolare del sito di inserzione
(T-DNA singolo, a tandem oppure inserzione più complessa??)
•  Clonaggio delle “Flanking Sequences”
Strategie di clonaggio
delle “Flanking Sequences”
•  Plasmid Rescue
•  Inverse PCR (IPCR)
•  Libreria genomica del mutante
(probe T-DNA)
X
X
GUS
T-DNA
ori
Amp
Kana
Digestione
X
X
T-DNA
Ligazione intramolecolare
T-DNA
X
X
X
Trasformazione E.coli
Selezione colonie AmpR, su LB+Amp
Strategie di clonaggio
delle “Flanking Sequences”
•  Plasmid Rescue
•  Inverse PCR (IPCR)
•  Libreria genomica del mutante
(probe T-DNA)
X
X
T-DNA
Kana
GUS
Digestione
X
X
T-DNA
Ligazione intramolecolare
T-DNA
PCR
X
Collezione di
Pool 1
48 linee indipendenti /pool
mutanti
inserzionali
(72 inserzioni
T-DNA )
48 x 8
Super
Pool A.1
384 linee
(576 inserzioni T- DNA )
Hyper
Pool
A1.1
768 linee
(1152 inserzioni T-DNA )
MegaPool
1536 linee (2304 inserzioni T-DNA )
Pool 8
Super
Pool A.2
Hyper
Pool
A1.2
Protocollo di Screening mediante PCR
•  Screening per PCR di n HP:
combinazione di un primer gene-specifico (F/R)
ed un primer T-DNA (RB/LB)
•  Qualità dei primers:
specificità-sensibilità
background con i primers T-DNA
•  Analisi per ibridazione (transfer “sandwich”):
sonda T-DNA (RB+LB)
sonda gene-specifica
•  Segnali coincidenti con le 2 sonde:
PCR di conferma con primers T-DNA nested
o con primers gene-specifici
sequenza del frammento amplificato
Scelta dei Primers gene-specifici
5’
3’
T-DNA
T-DNA
Sonda DAG1
Sonda T-DNA
+
48 linee indipendenti /pool
(72 inserzioni T-DNA )
Pool 1
Super
Pool A.1
Hyper
Pool
A1.1
48 x 8
384 linee
(576 inserzioni T- DNA )
768 linee
(1152 inserzioni T-DNA )
MegaPool
1536 linee (2304 inserzioni T-DNA )
Pool 8
Super
Pool A.2
Hyper
Pool
A1.2