Agrobacterium Un ingegnere genetico naturale Agrobacterium spp sono batteri del suolo Gram (-) responsabili di numerose malattie delle piante A. tumefaciens - crown gall disease – galla del colletto rose grapevine A volte il tumore può essere molto esteso! Come l’Agrobacterium causa la malattia? Un megaplasmide (Ti plasmid -Tumour inducing, circa 140 kb) contenuto nell’ A. tumefaciens è essenziale per lo sviluppo della malattia Induzione di tumori da parte dell’A. tumefaciens Le cellule tumorali acquisiscono un gene per la sintesi di citochinine (e auxina) Cellula della pianta Infezione e formazione della galla 1. Riconoscimento pianta ospite-Agrobacterium 2. Ancoraggio di Agrobacterium sulla pianta ospite 3. Trasferimento e integrazione del T-DNA alla pianta ospite 1. Riconoscimento pianta ospite-Agrobacterium Normalmente Agrobacterium attacca la pianta ospite a livello di una ferita fresca. Il ferimento determina: a) Il rilascio di composti fenolici associati alla parete cellulare vegetale (induttori della virulenza) che Agrobacterium percepisce e risponde attivando i geni necessari al trasferimento (geni vir). b) La formazione di una zona di cellule che si dividono attivamente, in quanto il tessuto ferito va incontro ai meccanismi di riparo. I composti fenolici ‘induttori vir’ sono prodotti del metabolismo fenilpropanoide; Essi sono correlati a molecole che vengono usate per rinforzare la matrice polisaccaridica della parete - es. cross-linkers fenolici e lignina polimerica acetosiringone L’induzione vir è anche aumentata dalla presenza di zuccheri semplici e da un pH acido – entrambi indicativi di danno cellulare 2. Ancoramento di Agrobacterium sulla pianta ospite Agrobacterium deve attaccarsi fisicamente alla parete cellulare della pianta prima di poter trasferire il suo TDNA. Sulla base dello studio di mutanti “attachment defective”, l’attacco richiede la sintesi da parte del batterio di un filamento polimerico di b-1,2-glucano. Agrobacterium b-1,2 glucano Pianta a livello del tessuto ferito Il target per b-1,2glucano sulla superficie della pianta non è stato ancora identificato. Una volta stabilito il contatto iniziale, il batterio elabora una rete di fibrille di cellulosa (b -1,4-glucano) che aiutano il batterio ad ancorarsi alla parete cellulare della pianta ospite. 3. Trasferimento e integrazione del T-DNA alla pianta ospite E’ la fase più complessa e coinvolge numerose molecole il cui ruolo non è stato ancora completamente chiarito Plasmide Ti 3 importanti regioni per il trasferimento del DNA e l’induzione del tumore T-DNA LB 1. T-DNA RB E 2. T-DNA borders 3. Regione Vir Oncogeni e Opina sintasi D C G B A vir Ti ori Catabolismo opine 1. T-DNA contiene geni per la biosintesi di fitormoni (auxina e citochinina) contiene geni per la biosintesi delle opine •questi geni vengono trascritti soltanto nella pianta Opine coniugati di amminoacidi e acidi organici/zuccheri normalmente non presenti nelle piante Possono essere metabolizzate dall’ Agrobacterium ma non dalla pianta nopalina = arginina + alpha-chetoglutarato octopina = arginina + piruvato mannopina = glutammina + mannosio agrocinopina A = saccarosio + arabinosio reazione della nopalina sintasi reazione della octopina sintase 2. T-DNA borders •Sequenze di 24-25 bp a ripetizioni dirette su entrambi i lati del T-DNA •soltanto il bordo destro sembra essere essenziale 3. Regione vir •Regione di ~35 kb contenente 6-9 unità trascrizionali (virA, B, C, D, E, F, G, H, J) •Alcuni loci vir hanno ORFs multiple (es. virB ha 11 ORF) • ~23 potenziali proteine sono codificate •Alcuni prodotti dei geni vir agiscono nella cellula batterica mentre altri sono trasportati e agiscono nella cellula ospite •Quattro loci vir sono essenziali per la formazione del tumore (A, B, D and G) •La maggior parte dei geni vir sono silenti in assenza dell’ospite, ma la virA e vir G sono trascritti costitutivamente a bassi livelli •Sistema di controllo gerarchico - virA e virG regolano l’espressione degli altri geni vir •VirA è associata con la membrana batterica interna, in un complesso con il prodotto del gene cromosomico ChvE INNER MEMBRANE CITOPLASM PERIPLASM LINKER KINASE COOH SENSOR DOMAIN NH2 Schema della proteina VirA RECEIVER by E.C. •Il legame di una apposita molecola di induttore fenolico (es. acetosiringone) con il complesso VirA causa l’attivazione della sua latente attività chinasica, e quindi la VirA si autofosforila (Questa risposta della VirA è aumentata dal legame di uno zucchero con il prodotto del gene ChvE) •La VirA-fosforilata recluta e attiva la VirG fosforilandola •La VirG fosforilata è un attivatore trascrizionale per gli altri loci vir zucchero 1. Composto fenolico ChvE VirA 3. 2. ADP ATP autofosforilazione P VirA attiva DNA genomico 4. VirG attiva P VirG inattiva P ATP ADP LB RB E D P 5. C G B A vir Ti ori •I prodotti genici virD (VirD1 e VirD2) si legano al bordo destro e tagliano un filamento all’estremità 5’ del T-DNA; -Questa attività è aumentata dai prodotti genici virC che si legano alle vicine sequenze enhancer. LB overdrive RB 5’ 5’ Induzione vir LB overdrive RB D2 D1 C1 C2 LB overdrive RB nick D1 D2 •La proteina VirD2 rimane attaccata covalentemente all’estremità 5’ del filamento di T per tutto il processo di trasferimento •La proteina VirE2 è una ‘single-stranded DNA binding protein’; più copie si legano al filamento T. Anche la virE2 passa nella cellula ospite insieme al filamento. LB RB E1 Sintesi di DNA E1 E1 D1 overdrive D2 E1 E1 E1 E1 E1 E1 E1 E1 E1 E1 E1 E1 E1 E1 D2 Filamento T con la proteina “cap” VirD2 attaccata covalentemente Questa associazione può già avvenire nella cellula batterica, ma alcune evidenze suggeriscono che il filamento T inciso + D2 È trasferito all’ospite, separatamente dalle proteine E1, e il filamento ricoperto di E1 si forma nel citoplasma della cellula ospite •Il prodotto del gene VirB contribuisce nella formazione di una struttura di secrezione di “tipo IV”, che potrebbe coivolgere il pilus batterico come condotto o struttura guida Fig. 1. The six functions of VirE2. The vir regulon, encoding the major loci virA-E and virG-H, is expressed on detection of plant wound signals. VirD2 and VirD1 liberate the T-strand and VirD2 remains covalently bound to the 5' end. 1: VirE2 coats the T-strand, protects it from degradation, and maintains it in a transportable conformation. 2: VirE2 associates with VirE1, required for VirE2 export. 3: VirE2 exits Agrobacterium via the type IV exporter independently, or as part of the T-complex. Alternatively, VirE2 may exit by an alternate pathway (pink; ref. 4). 4: VirE2 forms a pore in the plant plasma membrane allowing passage of the T-complex and coats the T-strand in the plant cytoplasm. 5: VirD2 and VirE2 interact with plant cytoplasmic chaperones (RocA, Roc4, and CypA). Other factors (AtKAP , VIP1) may target the T-complex to the nucleus. 6: VirE2 interacts with nuclear factors (VIP2) that mediate interaction with chromatin and facilitate integration of the T-strand. Altri prodotti dei geni vir VirF - fattore che condiziona il range delle piante ospiti; potrebbe interagire con proteine nucleari che regolano il ciclo di divisione cellulare? VirH - (PinF) possibile citocromo P-450 idrossilasi funzione di difesa? Fattore per il range d’ospite? VirJ - possibile binding protein del filamento T; aiuta l’esportazione del filamento T? Note aggiuntive su Agrobacterium Ulteriori informazioni sul Trasferimento e integrazione del T-DNA •Il preciso meccanismo di trasferimento del T-DNA non è completamente chiarito; •Richiede energia (idrolisi di ATP) ed è di solito completato entro 2-4 ore dal contatto. •Le proteine VirD2 e E1 dovrebbero proteggere il T-DNA dalla degradazione delle nucleasi dell’ospite. •Il complesso D2 / filamento T / E1 presentano segnali per la localizzazione nucleare (nuclear localisation signals, NLS) riconosciuti da proteine della cellula ospite. Queste dovrebbero guidare il complesso del filamento T verso il nucleo e accompagnarlo attraverso il complesso del poro nucleare per raggiungere la parte interna del nucleo. •Sulla base delle analisi su numerose linee di piante recanti il T-DNA, l’integrazione nel genoma ospite avviene apparentemente in siti casuali. L’integrazione sembra coivolgere la ricombinazione illegittima. Vi è una qualche associazione con regioni del genoma ricche in A/T. •Sembra esservi una correlazione tra la frequenza di integrazione e l’attività del ciclo cellulare (mitosi). •Le cellule trasformate con il T-DNA, in seguito a colonizzazione di Agrobacterium, contengono di solito inserzioni singole , ma inserzioni multiple (disperse o a tandem) possono anche verificarsi. Analisi di 161 trasformanti: 55% evento singolo 20% due eventi non associati 6% tre eventi non associati 1% quattro eventi non associati Lucido di relax Inserimento singolo Lucido di relax Inserimento multiplo Altre regioni del plasmide Ti svolgono importanti ruoli di supporto Regione per la coniugazione - controlla la capacità di Agrobacterium di scambiare plasmidi con altre cellule batteriche; omologie con il sistema di trasferimento del T-DNA - origine evolutiva comune? Regione per il catabolismo delle opine - codifica proteine necessarie per importare e utilizzare la stessa classe di opine la cui sintesi è codificata dal T-DNA Replicazione del plasmid (ori) - codifica funzioni che consentono ad Agrobacterium di mantenere il plasmide Ti durante la divisione cellulare Geni della pianta coivolti nell’integrazione del T-DNA Molti geni della pianta sono necessari per una efficiente integrazione del T-DNA nel genoma della pianta. Questi sono prodotti genici che controllano il normale funzionamento della cellula vegetale. Uno screening di mutanti di Arabidopsis resistenti alla trasformazione con Agrobacterium (mutanti rat, resistant to Agrobacterium transformation) ha recuperato mutazioni a diversi loci (Gelvin 2001) Formazione del tumore •Il T-DNA del ceppo wild-type di Agrobacterium codifica due tipi di funzioni- produzione di fitormoni e sintesi di opine. •I geni del T-DNA hanno strutture promotrice e ‘codon usage’ che gli consente di essere trascritti efficientemente nelle cellule vegetali ma non nei batteri. •La produzione di fitormoni è catalizzata da due prodotti genici (Tms1 e Tms2) che convertono il triptofano in acido 3-indol-acetico (IAA), e un prodotto genico (Tmr/Ipt) che converte l’adenina in isopentinil adenina (citochinina). L-triptofano O2 IaaM Ammide -2-indol acetico CO2 IaaH NH3 Acido-3-indol acetico (IAA) 2-isopentinil-PP adenosina - 5’-PO4 Tmr1 Isopentinil adenine-5-PO4 PPi Non tutti I geni del T-DNA sono stati caratterizzati. ORF 6b, per esempio è stato soltanto recentemente riportato codificare una proteina che ha le caratteristiche di un fattore di trascrizione eucariotico (DNA-binding domain) A. rhizogenes trasporta un differente megaplasmide (Ri) ma possiede la stessa funzionalità. Il T-DNA di Ri sembra mancare di un gene per la biosintesi delle citochinine, che probabilmente è responsabile della morfologia ‘radicante’ del tumore indotto dall’ A. rhizogenes. E’ interesante notare che geni omologhi al T-DNA tms1 e 2, e tmr1 sono presenti in altri batteri fitopatogeni Pseudomonas savastanoi, per esempio, causa una malattia che produce una galla chiamata ‘rogna dell’olivo’. I fattori di virulenza noti comprendono la capacità di sintetizzare IAA (codificato da iaaM e iaaH) e citochinina (codificato da ptz). Comunque, P. savastanoi manca della capacità di trasferire questi geni al genoma ospite. Produce e secerne i fitormoni al sito di infezione. Il tessuto colpito risponde con divisione e espansione cellulare, che determina la formazione della galla. N.B. Questo implica differenze nel controllo trascrizionale... Spettro d’ospite •A. tumefaciens ha un ampio spettro d’ospite nell’ambito delle dicotiledoni. •Le monocotiledoni e le gimnosperme non sono di solito dei buoni ospiti •La mancanza di infettività può essere dovuto: -alla non produzione di un appropriato composto fenolico induttore (es. la colonizzione avviene se l’induttore viene fornito esogenamente) -alla presenza di fattori dell’ospite non ancora caratterizzati biochimicamente. •Alcuni casi di apparente incompatibilità sono stati superati ‘coltivando’ l’Agrobacterium con specifici tessuti (es. piccioli cotiledonari in Brassica) Altri determinanti dello spettro d’ospite possono essere: i) La sensibilità o specificità della VirA; ii) altri geni vir difettosi (necessari più per alcuni ospiti che per altri); o iii) oncogeni difettivi (es. incapacità di produrre la correta miscela di fitormoni nella cellula ospite) Agroinfezione E’ possibile inserire il DNA di un genoma virale tra i bordi del T-DNA di un plasmide Ti e usare il processo di trasferimento dell’Agrobacterium tumefaciens per incorporare il DNA virale nella cellula vegetale. Una volta inserito, le funzioni virali possono trascrivere e replicarsi, stabilendo un’infezione virale. Esempi di utilizzo: •per studiare virus che non infettato senza l’aiuto di vettori (afidi), es.Luteovirus •Per migliorare l’efficienza di infezione per produrre proteine ricombinanti