Presentazione di PowerPoint

Agrobacterium
Un ingegnere genetico naturale
Agrobacterium spp sono batteri del suolo Gram (-)
responsabili di numerose malattie delle piante
A. tumefaciens - crown gall disease – galla del colletto
rose
grapevine
A volte il
tumore può
essere molto
esteso!
Come l’Agrobacterium causa la malattia?
Un megaplasmide (Ti plasmid -Tumour inducing,
circa 140 kb) contenuto nell’ A. tumefaciens è
essenziale per lo sviluppo della malattia
Induzione di tumori da parte dell’A. tumefaciens
Le cellule tumorali acquisiscono un gene per la sintesi di citochinine (e auxina)
Cellula della pianta
Infezione e formazione della galla
1. Riconoscimento pianta ospite-Agrobacterium
2. Ancoraggio di Agrobacterium sulla pianta ospite
3. Trasferimento e integrazione del T-DNA alla pianta
ospite
1. Riconoscimento pianta ospite-Agrobacterium
Normalmente Agrobacterium attacca la pianta ospite a
livello di una ferita fresca.
Il ferimento determina:
a) Il rilascio di composti fenolici associati alla parete
cellulare vegetale (induttori della virulenza) che
Agrobacterium percepisce e risponde attivando i geni
necessari al trasferimento (geni vir).
b) La formazione di una zona di cellule che si dividono
attivamente, in quanto il tessuto ferito va incontro ai
meccanismi di riparo.
I composti fenolici ‘induttori vir’
sono prodotti del metabolismo
fenilpropanoide;
Essi sono correlati a molecole che
vengono usate per rinforzare la
matrice polisaccaridica della
parete - es. cross-linkers fenolici
e lignina polimerica
acetosiringone
L’induzione vir è anche aumentata dalla presenza di
zuccheri semplici e da un pH acido – entrambi indicativi di
danno cellulare
2. Ancoramento di Agrobacterium sulla pianta ospite
 Agrobacterium deve attaccarsi fisicamente alla parete
cellulare della pianta prima di poter trasferire il suo TDNA.
 Sulla base dello studio di mutanti “attachment
defective”, l’attacco richiede la sintesi da parte del
batterio di un filamento polimerico di b-1,2-glucano.
Agrobacterium
b-1,2 glucano
Pianta a livello del tessuto ferito
 Il target per b-1,2glucano sulla superficie
della pianta non è stato
ancora identificato.
Una volta stabilito il contatto iniziale, il batterio
elabora una rete di fibrille di cellulosa (b -1,4-glucano)
che aiutano il batterio ad ancorarsi alla parete cellulare
della pianta ospite.
3. Trasferimento e integrazione del T-DNA
alla pianta ospite
E’ la fase più complessa e coinvolge numerose molecole il
cui ruolo non è stato ancora completamente chiarito
Plasmide Ti
3 importanti regioni per il trasferimento del DNA e
l’induzione del tumore
T-DNA
LB
1. T-DNA
RB
E
2. T-DNA borders
3. Regione Vir
Oncogeni e
Opina sintasi
D
C
G
B
A
vir
Ti
ori
Catabolismo
opine
1. T-DNA
 contiene geni per la biosintesi di fitormoni
(auxina e citochinina)
contiene geni per la biosintesi delle opine
•questi geni vengono trascritti soltanto nella pianta
Opine
 coniugati di amminoacidi e acidi organici/zuccheri
 normalmente non presenti nelle piante
 Possono essere metabolizzate dall’ Agrobacterium ma
non dalla pianta
nopalina = arginina + alpha-chetoglutarato
octopina = arginina + piruvato
mannopina = glutammina + mannosio
agrocinopina A = saccarosio + arabinosio
reazione
della
nopalina
sintasi
reazione
della
octopina
sintase
2. T-DNA borders
•Sequenze di 24-25 bp a ripetizioni dirette
su entrambi i lati del T-DNA
•soltanto il bordo destro sembra essere
essenziale
3. Regione vir
•Regione di ~35 kb contenente 6-9 unità
trascrizionali (virA, B, C, D, E, F, G, H, J)
•Alcuni loci vir hanno ORFs multiple (es. virB ha
11 ORF)
• ~23 potenziali proteine sono codificate
•Alcuni prodotti dei geni vir agiscono nella cellula batterica
mentre altri sono trasportati e agiscono nella cellula ospite
•Quattro loci vir sono essenziali per la formazione del
tumore (A, B, D and G)
•La maggior parte dei geni vir sono silenti in assenza
dell’ospite, ma la virA e vir G sono trascritti
costitutivamente a bassi livelli
•Sistema di controllo gerarchico - virA e virG regolano
l’espressione degli altri geni vir
•VirA è associata con la membrana batterica interna, in
un complesso con il prodotto del gene cromosomico ChvE
INNER MEMBRANE
CITOPLASM
PERIPLASM
LINKER
KINASE
COOH
SENSOR
DOMAIN
NH2
Schema della proteina VirA
RECEIVER
by E.C.
•Il legame di una apposita molecola di induttore fenolico
(es. acetosiringone) con il complesso VirA causa
l’attivazione della sua latente attività chinasica, e quindi la
VirA si autofosforila
(Questa risposta della VirA è aumentata dal legame di uno zucchero
con il prodotto del gene ChvE)
•La VirA-fosforilata recluta e attiva la VirG
fosforilandola
•La VirG fosforilata è un attivatore trascrizionale per
gli altri loci vir
zucchero
1.
Composto fenolico
ChvE
VirA
3.
2.
ADP
ATP
autofosforilazione
P
VirA attiva
DNA genomico
4.
VirG attiva
P
VirG inattiva
P
ATP
ADP
LB
RB
E
D
P
5.
C
G
B
A
vir
Ti
ori
•I prodotti genici virD (VirD1 e VirD2) si legano al
bordo destro e tagliano un filamento all’estremità 5’
del T-DNA;
-Questa attività è aumentata dai prodotti
genici virC che si legano alle vicine sequenze
enhancer.
LB
overdrive
RB
5’
5’
Induzione vir
LB
overdrive
RB
D2
D1
C1
C2
LB
overdrive
RB
nick
D1
D2
•La proteina VirD2 rimane attaccata covalentemente
all’estremità 5’ del filamento di T per tutto il processo di
trasferimento
•La proteina VirE2 è una ‘single-stranded DNA
binding protein’; più copie si legano al filamento T.
Anche la virE2 passa nella cellula ospite insieme al
filamento.
LB
RB
E1
Sintesi di DNA
E1
E1
D1
overdrive
D2
E1 E1 E1 E1 E1 E1 E1
E1 E1 E1 E1 E1 E1 E1
D2
Filamento T con la proteina “cap” VirD2 attaccata covalentemente
Questa associazione può già avvenire nella cellula batterica,
ma alcune evidenze suggeriscono che il filamento T inciso + D2
È trasferito all’ospite, separatamente dalle proteine E1, e il
filamento ricoperto di E1 si forma nel citoplasma della cellula
ospite
•Il prodotto del gene VirB contribuisce nella
formazione di una struttura di secrezione di “tipo IV”,
che potrebbe coivolgere il pilus batterico come
condotto o struttura guida
Fig. 1. The six functions of VirE2. The vir regulon, encoding the major loci virA-E and virG-H, is expressed on detection of plant wound
signals. VirD2 and VirD1 liberate the T-strand and VirD2 remains covalently bound to the 5' end. 1: VirE2 coats the T-strand, protects it
from degradation, and maintains it in a transportable conformation. 2: VirE2 associates with VirE1, required for VirE2 export. 3: VirE2
exits Agrobacterium via the type IV exporter independently, or as part of the T-complex. Alternatively, VirE2 may exit by an alternate
pathway (pink; ref. 4). 4: VirE2 forms a pore in the plant plasma membrane allowing passage of the T-complex and coats the T-strand in
the plant cytoplasm. 5: VirD2 and VirE2 interact with plant cytoplasmic chaperones (RocA, Roc4, and CypA). Other factors (AtKAP ,
VIP1) may target the T-complex to the nucleus. 6: VirE2 interacts with nuclear factors (VIP2) that mediate interaction with chromatin and
facilitate integration of the T-strand.
Altri prodotti dei geni vir
VirF - fattore che condiziona il range delle piante
ospiti; potrebbe interagire con proteine nucleari
che regolano il ciclo di divisione cellulare?
VirH - (PinF) possibile citocromo P-450 idrossilasi
funzione di difesa? Fattore per il range d’ospite?
VirJ - possibile binding protein del filamento T; aiuta
l’esportazione del filamento T?
Note aggiuntive su Agrobacterium
Ulteriori informazioni sul Trasferimento e
integrazione del T-DNA
•Il preciso meccanismo di trasferimento del T-DNA non
è completamente chiarito;
•Richiede energia (idrolisi di ATP) ed è di solito
completato entro 2-4 ore dal contatto.
•Le proteine VirD2 e E1 dovrebbero proteggere il
T-DNA dalla degradazione delle nucleasi dell’ospite.
•Il complesso D2 / filamento T / E1 presentano segnali
per la localizzazione nucleare (nuclear localisation signals,
NLS) riconosciuti da proteine della cellula ospite. Queste
dovrebbero guidare il complesso del filamento T verso il
nucleo e accompagnarlo attraverso il complesso del poro
nucleare per raggiungere la parte interna del nucleo.
•Sulla base delle analisi su numerose linee di piante
recanti il T-DNA, l’integrazione nel genoma ospite avviene
apparentemente in siti casuali. L’integrazione sembra
coivolgere la ricombinazione illegittima. Vi è una qualche
associazione con regioni del genoma ricche in A/T.
•Sembra esservi una correlazione tra la frequenza di
integrazione e l’attività del ciclo cellulare (mitosi).
•Le cellule trasformate con il T-DNA, in seguito a
colonizzazione di Agrobacterium, contengono di solito
inserzioni singole , ma inserzioni multiple (disperse o a
tandem) possono anche verificarsi.
Analisi di 161 trasformanti:
55% evento singolo
20% due eventi non associati
6% tre eventi non associati
1% quattro eventi non associati
Lucido di relax
Inserimento singolo
Lucido di relax
Inserimento multiplo
Altre regioni del plasmide Ti svolgono
importanti ruoli di supporto
Regione per la coniugazione - controlla la capacità di
Agrobacterium di scambiare plasmidi con altre cellule
batteriche; omologie con il sistema di trasferimento del
T-DNA - origine evolutiva comune?
Regione per il catabolismo delle opine - codifica
proteine necessarie per importare e utilizzare la
stessa classe di opine la cui sintesi è codificata dal
T-DNA
Replicazione del plasmid (ori) - codifica funzioni che
consentono ad Agrobacterium di mantenere il plasmide
Ti durante la divisione cellulare
Geni della pianta coivolti nell’integrazione
del T-DNA
Molti geni della pianta sono necessari per una
efficiente integrazione del T-DNA nel genoma della
pianta.
Questi sono prodotti genici che controllano il normale
funzionamento della cellula vegetale.
Uno screening di mutanti di Arabidopsis resistenti alla
trasformazione con Agrobacterium (mutanti rat,
resistant to Agrobacterium transformation) ha
recuperato mutazioni a diversi loci (Gelvin 2001)
Formazione del tumore
•Il T-DNA del ceppo wild-type di Agrobacterium
codifica due tipi di funzioni- produzione di fitormoni e
sintesi di opine.
•I geni del T-DNA hanno strutture promotrice e
‘codon usage’ che gli consente di essere trascritti
efficientemente nelle cellule vegetali ma non nei
batteri.
•La produzione di fitormoni è catalizzata da due
prodotti genici (Tms1 e Tms2) che convertono il
triptofano in acido 3-indol-acetico (IAA), e un
prodotto genico (Tmr/Ipt) che converte l’adenina in
isopentinil adenina (citochinina).
L-triptofano
O2
IaaM
Ammide -2-indol acetico
CO2
IaaH
NH3
Acido-3-indol acetico (IAA)
2-isopentinil-PP
adenosina - 5’-PO4
Tmr1
Isopentinil adenine-5-PO4
PPi
Non tutti I geni del T-DNA sono stati
caratterizzati.
ORF 6b, per esempio è stato soltanto recentemente
riportato codificare una proteina che ha le
caratteristiche di un fattore di trascrizione
eucariotico (DNA-binding domain)
A. rhizogenes trasporta un differente megaplasmide
(Ri) ma possiede la stessa funzionalità.
Il T-DNA di Ri sembra mancare di un gene per la
biosintesi delle citochinine, che probabilmente è
responsabile della morfologia ‘radicante’ del tumore
indotto dall’ A. rhizogenes.
E’ interesante notare che geni omologhi al T-DNA
tms1 e 2, e tmr1 sono presenti in altri batteri
fitopatogeni
Pseudomonas savastanoi, per esempio, causa una
malattia che produce una galla chiamata ‘rogna
dell’olivo’. I fattori di virulenza noti comprendono
la capacità di sintetizzare IAA (codificato da
iaaM e iaaH) e citochinina (codificato da ptz).
Comunque, P. savastanoi manca della capacità di
trasferire questi geni al genoma ospite. Produce e
secerne i fitormoni al sito di infezione.
Il tessuto colpito risponde con divisione e
espansione cellulare, che determina la formazione
della galla.
N.B. Questo implica differenze nel controllo trascrizionale...
Spettro d’ospite
•A. tumefaciens ha un ampio spettro d’ospite
nell’ambito delle dicotiledoni.
•Le monocotiledoni e le gimnosperme non sono di solito dei
buoni ospiti
•La mancanza di infettività può essere dovuto:
-alla non produzione di un appropriato composto
fenolico induttore (es. la colonizzione avviene se
l’induttore viene fornito esogenamente)
-alla presenza di fattori dell’ospite non
ancora caratterizzati biochimicamente.
•Alcuni casi di apparente incompatibilità sono stati
superati ‘coltivando’ l’Agrobacterium con specifici tessuti
(es. piccioli cotiledonari in Brassica)
Altri determinanti dello spettro d’ospite possono
essere:
i) La sensibilità o specificità della VirA;
ii) altri geni vir difettosi (necessari più per alcuni
ospiti che per altri); o
iii) oncogeni difettivi (es. incapacità di produrre la
correta miscela di fitormoni nella cellula ospite)
Agroinfezione
E’ possibile inserire il DNA di un genoma virale tra i
bordi del T-DNA di un plasmide Ti e usare il processo
di trasferimento dell’Agrobacterium tumefaciens per
incorporare il DNA virale nella cellula vegetale.
Una volta inserito, le funzioni virali possono
trascrivere e replicarsi, stabilendo un’infezione
virale.
Esempi di utilizzo:
•per studiare virus che non infettato senza l’aiuto di
vettori (afidi), es.Luteovirus
•Per migliorare l’efficienza di infezione per produrre
proteine ricombinanti