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BOVINI
Large Animals Review, Anno 4, n. 1, Marzo 1998
CONFRONTO DEL GENOMA DI STIPITI
DI ROTAVIRUS ISOLATI DA BUFALI E BOVINI
MEDIANTE ELETTROFORESI IN GEL
DI POLIACRILAMMIDE
PAOLA SAGAZIO, VITO MARTELLA, ABDI FARAH ABDULKADIR,
MARIA TEMPESTA, GIUSEPPE IOVANE*, CANIO BUONAVOGLIA
Dipartimento di Sanità e benessere degli animali- Sezione Malattie Infettive- Facoltà di Medicina Veterinaria- Università di Bari
* Dipartimento di Patologia, Profilassi e Ispezione degli Alimenti - Facoltà di Medicina Veterinaria- Università di Napoli
Riassunto
Sono riportati i risultati dell’analisi dei profili elettroforetici di stipiti di rotavirus isolati da bovini e bufali in aziende della
Campania e della Puglia. Il confronto dei patterns di migrazione elettroforetica ha messo in evidenza una identità completa tra
gli stipiti bufalini e uno stipite bovino. Inoltre sono state evidenziate notevoli diversità tra tutti gli stipiti isolati di recente ed
uno stipite isolato nelle stesse zone 15 anni prima.
Summary
The results of electrophoretic patterns analysis of rotavirus strains isolated from cattle and buffalo herds in Puglia and
Campania are reported. The electrophoretic patterns showed complete identity between buffalo isolates and one strain of
bovine origin. Great differences between the recent bovine rotavirus isolates and a rotavirus strain isolated from cattle in the
same area 15 years before were showed.
INTRODUZIONE
I rotavirus sono considerati una delle principali cause di
diarrea neonatale nell’uomo e in molte specie animali.
Nell’uomo si stima che i rotavirus del gruppo A siano
responsabili di circa un milione di morti all’anno, principalmente nei Paesi in via di sviluppo.1 Nei bovini la diarrea neonatale da rotavirus compare con maggiore frequenza e severità nelle prime due settimane di vita 2 ed è
responsabile di notevoli perdite economiche dovute a
decessi, interventi terapeutici e ritardi di accrescimento
degli animali guariti.3
Nel genere Rotavirus sono stati identificati 7 sierogruppi, designati con le lettere da A a G. Il gruppo A è stato il
primo ad essere isolato ed è il più diffuso.
I sierogruppi sono antigenicamente distinguibili
mediante diverse tecniche, quali immunofluorescenza,
immunoelettromicroscopia ed ELISA, in base ad un antigene di gruppo comune localizzato sulla proteina VP6.
All’interno di un sierogruppo i rotavirus sono distinti in
sottogruppi, in base a due antigeni di sottogruppo, detti SI
e SII, localizzati sulla VP6 e VP2.
I rotavirus di gruppo A, i più studiati, sono classificati
in sierotipi in base alle caratteristiche della VP4 e della
VP7: la VP4 identifica il P-tipo (Protease-sensible), mentre
la VP7 il G-tipo (Glycoprotein).4,5
Attualmente sono noti 19 P-tipi e 14 G-tipi.6
Nei bovini i tipi più diffusi sono P1, P11, P5, G6 e
G10;7,8,9 negli equini P7, P12, P17, G3, G5, G10, G13,
G14;10,11 nei suini P6, P7, G4 e G5;5 mentre nell’uomo
sono più diffusi P8, P4, P6, G1, G2, G3, G4.12,6
L’analisi della migrazione elettroforetica degli 11 segmenti del genoma, effettuata in gel di poliacrilammide
(PAGE), permette di individuare, approssimativamente, il
sierogruppo di appartenenza del virus in quanto le bande
di migrazione si distribuiscono in 4 classi.13 I rotavirus di
gruppo A dei mammiferi hanno un elettroferotipo 4:2:3:2,
quelli di gruppo B ed E hanno l’elettroferotipo 4:2:2:3,
quelli di gruppo C hanno un modello 4:3:2:2.5
Lo studio dei modelli di migrazione elettroforetica dei
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Confronto del genoma di stipiti di rotavirus isolati da bufali e bovini
Estrazione dell’RNA virale
segmenti del genoma, pur consentendo di rilevare l’esistenza di differenze genomiche, non permette tuttavia di
identificare i G- e P-tipi, ossia il sierotipo.
La tecnica del PAGE, effettuata su campioni di feci,
viene impiegata per la diagnosi rapida di rotavirosi, avendo evidenziato sensibilità e specificità pari o superiore a
quella di test commerciali basati su agglutinazione al lattice ed ELISA.14
L’analisi del genoma con il PAGE può, inoltre, servire
in studi epidemiologici, per monitorare i diversi focolai di
infezione e per verificare la diffusione dei rotavirus nelle
diverse specie, tenuto conto che il profilo genomico è stabile e rimane invariato nonostante i passaggi seriali “in
vivo” ed “in vitro”.15
Nella presente nota sono riportati i risultati di uno studio sul confronto del genoma di stipiti di rotavirus isolati
da bovini e bufali in allevamenti della Puglia e della
Campania.
Due ml di surnatante di ciascun campione virale sono
stati miscelati con egual volume di tampone TNE (100
mM Tris, pH 8,0, 40 mM NaCl, 1 mM EDTA) e posti ad
incubare a 37oC per 24h.
Alla miscela è stato aggiunto egual volume di fenolo
saturato (ottenuto mescolando al fenolo in rapporto di
1:1(v/v) il tampone di saturazione costituito da 75 mM
NaCl, 50 mM EDTA, 10 mM Tris HCl, pH 8,0). La miscela virus-fenolo è stata incubata per 8’ a temperatura
ambiente in agitazione e poi centrifugata a 5000 rpm per
10’. Il surnatante è stato mescolato con una miscela di
fenolo/cloroformio al 50%, ripetendo la stessa procedura.
Al surnatante sono stati addizionati 3 volumi di etanolo,
ponendo il tutto a -20oC per 1h. Dopo centrifugazione a
5000 rpm per 30’ a -20oC, l’RNA pellettato è stato raccolto
in un idoneo volume di tampone TNE.
MATERIALI E METODI
PAGE
Virus
Dopo diluizione al 50% con tampone di corsa di
Laemmli (Sigma Chemical Co.), il campione è stato sottoposto ad elettroforesi in gel di poliacrilammide, costituito
da stocking gel al 5% e resolving gel al 10% secondo il
metodo di Laemmli modificato (assenza di SDS in tutte le
soluzioni), a 8 mA/gel per tutta la notte.17
Le bande sono state visualizzate su transilluminatore a
UV dopo colorazione con etidio bromuro (2 µg/ml di
Tris-HCl pH 8,0).
Sono stati esaminati 6 ceppi di rotavirus di cui 3 (54/93,
62/94, 67/94) isolati da bufalotti di circa 15 giorni di età
nel corso di due diversi focolai di infezione osservati nella
stessa azienda in Campania nel 1993 e 1994 e 3 (81/36F,
125/94, 13/95) isolati in Puglia da vitelli con diarrea. Lo
stipite 81/36F, isolato nel 1981,16 è stato gentilmente fornito dal prof. Castrucci.
Lo stock virus per lo studio del genoma è stato preparato su cellule di rene di scimmia MA-104 sviluppate in terreno Eagle-Minimal Essential Medium (E-MEM).
L’infezione delle cellule, valutata con la reazione di immunofluorescenza (Fig. 1), è stata effettuata con il virus sottoposto preventivamente a tre successivi clonaggi mediante
il metodo delle placche.
Le colture cellulari con effetto citopatico completo (Fig.
2) sono state sottoposte a 3 cicli di congelamento e scongelamento. L’estrazione dell’RNA virale è stata effettuata a
partire dal surnatante ottenuto dopo due centrifugazioni
a 4000 xg per 30’ a +4oC.
FIGURA 1 - Immunofluorescenza su cellule MA-104 infette con rotavirus (100x).
RISULTATI
L’analisi del genoma degli stipiti di rotavirus isolati dai
bufali ha evidenziato una totale identità degli elettroferotipi di questi virus.
Differenze, talvolta anche significative, sono invece state
notate fra i patterns degli stipiti di origine bovina che
hanno mostrato differenze nella mobilità delle bande 1, 4,
5, 6 e 7, 8, 9 (Fig. 3).
In particolare, si può notare che i segmenti 1 e 4 degli
FIGURA 2 - Effetto citopatico indotto da rotavirus su cellule MA-104
(100x).
stipiti 125/94 e 13/95 hanno una mobilità maggiore rispetto a quelli dello stipite 81/36F mentre i segmenti 5, 6, 7, 8,
9 dello stipite 81/36F migrano più velocemente rispetto a
quelli del 125/94 e del 13/95.
Il confronto tra lo stipite 125/94 e 13/95 ha evidenziato
differenze a livello del segmento 4 che migra più velocemente nello stipite 125/94.
I patterns elettroforetici degli stipiti di origine bufalina
hanno evidenziato differenze con gli stipiti di origine bovina 81/36F e 13/95, mentre sono risultati identici a quello
dello stipite 125/94 (Fig. 3).
DISCUSSIONE
I risultati ottenuti nel presente studio consentono di
fare alcune considerazioni di natura virologica ed epidemiologica.
Innanzitutto può essere confermato quanto sostenuto
da Kalica et al.15 in merito alla stabilità del genoma dei
rotavirus nonostante ripetuti passaggi “in vivo” e “in
vitro”.
Nell’azienda bufalina, infatti, a distanza di un anno dal
primo isolamento e dopo ripetuti episodi di infezione, è
stato possibile isolare altri 2 stipiti con identico profilo
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genomico.
Anche gli stipiti bovini 125/94 e 13/95 isolati a distanza
di un anno in due aziende distanti circa 50 km hanno evidenziato un profilo genomico quasi sovrapponibile (nello
stipite 125/94 la banda 4 migra più velocemente rispetto al
13/95).
Di difficile interpretazione rispetto al concetto di circolazione e persistenza in un determinato territorio di stipiti
virali con profilo genomico identico,15,6 è il dato scaturito
dall’analisi dello stipite 81/36F, isolato sempre in Puglia
circa 15 anni prima.
Si potrebbe ipotizzare che questo stipite, completamente diverso da quelli circolanti in Puglia, sia stato isolato in
aziende in cui erano presenti animali provenienti da altre
zone dell’Italia o dell’Europa.
È fuori dubbio, tuttavia, che lo stipite 81/36F non ha
avuto diffusione sul territorio, tenuto conto che nelle stesse zone dove era stato individuato questo stipite, è stato
isolato lo stipite 13/95 con profilo genomico completamente diverso.
Un’altra considerazione epidemiologica interessante è
legata alla perfetta identità riscontrata tra il genoma degli
stipiti isolati dai bufali in Campania e lo stipite 125/94 isolato da bovini in Puglia.
Prove preliminari di virus neutralizzazione crociata
hanno ulteriormente confermato la stretta correlazione tra
gli stipiti bufalini e gli stipiti isolati dai bovini, ad eccezione dello stipite 81/36F (dati non pubblicati).
Oltre alla conferma della circolazione interspecie dei
rotavirus, questi risultati, se avvalorati da ulteriori analisi
su altri stipiti, potrebbero fornire una identità “geografica” degli stipiti di rotavirus isolati nel sud dell’Italia e
potrebbero costituire una indispensabile informazione per
una più efficace profilassi vaccinale.
Parole chiave
Rotavirus, PAGE, bovino, bufalo.
Key words
Rotavirus, PAGE, cattle, buffalo.
Abbreviazioni:
ELISA: Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay. VP:
viral protein. PAGE: Polyacrylamide Gel Electrophoresis.
E-MEM: Eagle-Minimum Essential Medium. TNE: soluzione tampone. r.p.m.: rotazioni per minuto.
SDS: Sodio Duodecil Solfato. UV: luce ultra violetta.
Bibliografia
1.
FIGURA 3 - Elettroforesi in gel di poliacrilammide del genoma di stipiti
di rotavirus isolati da bufali e bovini. Linea 1: RV 125/94. Linea 2: RV
54/93 (bufalo). Linea 3: RV 81/36F. Linea 4: RV 13/95.
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UOFAA CORSI - UOFAA CORSI - UOFAA CORSI - UOFAA CORSI - UOFAA CORSI
Con la nuova stagione autunno-inverno 1997/1998 inizia l’attività corsuale promossa dall’UOFAA che, accanto agli ormai consueti corsi di F.A. per la specie
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