caratterizzazione mediante pcr di stipiti rotavirus isolati

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BOVINI
Large Animals Review, Anno 4, n. 4, Dicembre 1998
CARATTERIZZAZIONE MEDIANTE PCR
DI STIPITI ROTAVIRUS ISOLATI DA VITELLI
CON ENTERITE
VITO MARTELLA, ANNAMARIA PRATELLI, DOMENICO BUONAVOGLIA*, MARIA TEMPESTA,
GIUSEPPE IOVANE**
Dipartimento di Sanità e benessere degli animali - Sezione Malattie Infettive - Facoltà di Medicina Veterinaria - Università di Bari
Strada Provinciale per Casamassima km 3 - 70042 Valenzano (Bari)
*Istituto Malattie Infettive, Profilassi e Polizia Veterinaria - Facoltà di Medicina Veterinaria - Università di Messina
* *Dipartimento di Patologia Veterinaria - Facoltà di Medicina Veterinaria - Università di Napoli
Riassunto
Diversi stipiti di rotavirus di gruppo A isolati da vitelli affetti da enterite sono stati tipizzati per il G e P-tipo mediante polymerase chain reaction. Sono stati ritrovati con maggior frequenza il tipo G6 ed il P5.
Summary
Several group A rotaviruses isolated from calves affected by enteritis were characterized by polymerase chain reaction
assay for G- and P-type. Types G6 and P5 were the most frequently identified.
INTRODUZIONE
Stipiti virali
I Rotavirus appartengono alla famiglia Reoviridae e sono
classificati in 7 sierogruppi indicati con le lettere dell’alfabeto da A a G. I rotavirus di gruppo A, B e C colpiscono
sia l’uomo che gli animali, mentre gli altri gruppi sono
stati identificati solo negli animali.14
I rotavirus di gruppo A sono i più conosciuti poiché
sono la causa principale di diarrea neonatale nell’uomo e
negli animali. Vengono classificati in sierotipi, in base alle
caratteristiche delle proteine VP7 e VP4, che costituiscono
il capside esterno del virione ed esprimono, rispettivamente, l’antigene di neutralizzazione maggiore (G-tipo) e l’antigene di neutralizzazione minore (P-tipo).5,2,14
Attualmente sono noti 14 G-tipi e 19 P-tipi. 12
Nell’uomo i tipi più diffusi sono G1, G2, G3, G4, P8, P4,
P67,12 mentre nei bovini i tipi più diffusi sono G6, G10,
P1, P11 e P5.6,10,13,3,11
Nella presente nota si riportano i risultati di uno studio di
caratterizzazione del G-tipo e del P-tipo effettuata mediante
la nested PCR su 16 stipiti di rotavirus isolati da bovini.
Sono stati complessivamente caratterizzati 16 stipiti di
rotavirus isolati da vitelli con diarrea. Il virus 81/36F è
stato fornito dal prof. Castrucci. Nelle prove è stato incluso
anche il rotavirus presente nel vaccino Scourguard (Pfizer).
Per l’isolamento dei virus i campioni di feci, prelevati dall’ampolla rettale, sono stati omogenati al 20% in PBS e sottoposti a centrifugazione per 20’ a 3000 × g. Il surnatante è
stato diluito 1: 2 con D-MEM contenente tripsina (1000
µg/ml), filtrato con filtri a porosità 0,22 (Millipore) e quindi utilizzato per l’infezione delle cellule MA-104 sviluppate
in terreno contenente 5 µg/ml di tripsina. In presenza di
effetto citopatico le cellule sono state sottoposte al test di
immunofluorescenza indiretta utilizzando un siero policlonale di coniglio positivo per rotavirus.
MATERIALI E METODI
Estrazione dell’RNA
Il dsRNA genomico di ciascuno stipite è stato estratto
dalle colture cellulari che presentavano il 90% di effetto citopatico, mediante il kit RNeasy (Qiagen Gmbh, Germany),
basato su una metodica all’isotiocianato di guanidina.
Cellule
Determinazione del G-tipo
Sono state utilizzate cellule renali di scimmia MA-104
sviluppate in terreno minimo essenziale di Dulbecco (DMEM) con l’aggiunta del 10% di siero fetale.
La G-tpizzazione è stata eseguita in tre fasi, come
descritto da Gouvea et al.8 ed Isegawa et al.10: i) retrotra-
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Caratterizzazione mediante PCR di stipiti rotavirus isolati da vitelli con enterite
scrizione del dsRNA genomico usando la coppia di primer
generici Bov9Com5 e Bov9Com3; ii) prima amplificazione
mediante PCR di un segmento di 1013 bp del gene della
VP7 usando la stessa coppia di primer generici; iii) seconda amplificazione usando il primer generico 5’ e tre primer
tipo-specifici (G6, G8 e G10).
Due µl di dsRNA sono stati aggiunti a 1,4 µl di dimetilsulfossido e denaturati a 97°C per 5’. L’RNA denaturato è
stato immediatamente retrotrascritto a 45°C per 48’ con
50 U di MuLV-retrotrascrittasi (Perkin Elmer Cetus,
Norwalk, CT) in 20 µl di miscela di reazione contenenti
MgCl2 5 mM, KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, 20 U
di inibitore dell’RNasi, dNTP 700 µM e 1 µM ciascuna
della coppia di primer generici.
Il cDNA risultante è stato amplificato mediante 2 U di
Taq polimerasi (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT) in una
miscela di reazione contenente MgCl 2 mM, KCl 50 mM,
Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, dNTP 160 µM e 0,2 µM ciascuno della coppia di primer generici. Il programma termico
della prima amplificazione prevedeva 25 cicli di 94°C per
1’, 45°C per 2’ e 72°C per 3’.
Dieci µl del prodotto della prima amplificazione, previa
diluizione 1: 100, sono stati sottoposti alla seconda amplificazione che prevedeva 25 cicli di 94°C per 1’, 50°C per
2’ e 72°C per 3’.
Il prodotto della seconda amplificazione è stato caricato in un gel al 2% di agarosio in tampone TBE (TrisBorato- EDTA, pH 8,0) e sottoposto ad elettroforesi per
60’ a 50 V. I genotipi G6, G8 e G10 sono stati identificati
sulla base delle dimensioni delle bande, rispettivamente
pari a 288, 145 e 634 bp, osservate dopo colorazione del
gel con etidio bromuro e visualizzazione al transilluminatore a UV.
FIGURA 1 - Caratterizzazione del G-tipo mediante PCR. A: standard; B:
G6 (288 bp); C: G8 (145 bp); D: G10 (634 bp).
Determinazione del P-tipo
La determinazione del P-tipo è stata eseguita in maniera
analoga a quella utilizzata per la determinazione del Gtipo. Per la retrotrascrizione e per la prima amplificazione
sono stati usati la coppia di primer generici Bov4Com3 e
Bov4Com5, ottenendo un frammento di 864 bp. Per la
seconda amplificazione è stato usato il primer generico 5’
ed i primer specifici per il P-tipo (P1, P5, P11).
Dopo elettroforesi in gel di agarosio al 2% e colorazione con etidio bromuro, i genotipi P1, P5 e P11 sono stati
identificati in base alla grandezza delle bande, rispettivamente di 460, 659 e 322 bp.
RISULTATI
Nella Figura 1 sono evidenziati i prodotti amplificati
della PCR per la caratterizzazione dei G-tipi (G6, G8 e
G10), mentre nella Figura 2 sono evidenziati gli amplificati
della PCR per la caratterizzazione dei P-tipi (P1, P5, P11).
Come riportato nella Tabella 1, tredici stipiti sono risultati G6, tre sono risultati G10 e due G8. In due casi (RV
08 ed RV LT) è stata constatata un’infezione mista
G6+G10.
Per quanto riguarda il P-tipo, quattordici virus sono
risultati P5 e tre P11. In un caso è stato evidenziato P1+P5
FIGURA 2 - Caratterizzazione del P-tipo mediante PCR. A: standard; B:
P1 (460 bp); C: P5 (659 bp); D: P11 (322 bp).
e in un altro P1+ P5+ P11. Fra gli stipiti caratterizzati, la
combinazione prevalente è risultata la G6P5, mentre il
virus vaccinale è stato tipizzato come G6P1, identico al
ceppo vaccinale americano NCDV-Lincoln.
Tabella 1
Risultati della caratterizzazione del genotipo di rotavirus
isolati da bovini
Isolamento
RV 02
RV 03
RV 04
RV 05
RV 06
RV 08
RV LM
RV LB
RV LT
RV 125/94
RV 64/93
RV 81/36F
RV 13/95
RV 14/95
RV 73/95
RV 154/98
Vaccino
G-tipo
10
6
6
6
6
6, 10
6
6
6, 10
6
6
6
8
8
6
6
6
P-tipo
5
5
5
5
5
5, 1
5
5
5, 1, 11
5
11
5
5
5
11
5
1
Parole chiave
Rotavirus, PCR, G-tipo, P-tipo, bovini.
Key words
Rotavirus, PCR, G-type, P-type, cattle.
Abbreviazioni
VP: viral protein. ELISA: Enzyme Linked Immuno
Sorbent Assay. bp: paia di basi (base pair). PCR: polymerase chain reaction. dsRNA: RNA bicatenario (double stranded RNA). UV: luce ultra-violetta.
Bibliografia
1.
CONCLUSIONI
2.
3.
Gli studi condotti negli ultimi anni sul ruolo delle proteine del capside esterno dei rotavirus nell’induzione della
protezione immunitaria hanno evidenziato che la VP7 (Gtipo) ha una importanza prevalente ai fini della protezione
omotipica.9,16,1
Lu et al.13 hanno tuttavia descritto l’isolamento di un
rotavirus da vitelli con enterite nati da bovine regolarmente vaccinate nei confronti della rotavirosi ed hanno ipotizzato che la mancata protezione potesse essere attribuita
alla diversità del P-tipo del virus isolato rispetto al virus
vaccinale. Il ruolo preciso delle proteine VP7 e VP4, o di
altre proteine virali, nell’induzione della protezione immunitaria, non è stato ancora perfettamente definito.4
Il concetto di protezione omotipica ha suggerito, in
campo umano, l’utilizzazione di un vaccino quadrivalente
riassortante, contenente i 4 G-tipi più diffusi nella popolazione. Questo tipo di vaccino ha evidenziato un’efficacia
superiore all’80% nel prevenire la forma enterica acuta da
rotavirus, mentre non è riuscito a proteggere dall’infezione. A tale proposito, tuttavia, occorre precisare che neanche l’immunità acquisita a seguito di infezione naturale
riesce a prevenire una reinfezione.6
In ambito veterinario, la profilassi della rotavirosi nei
vitelli è basata sulla protezione passiva indotta dagli anticorpi colostrali trasmessi dalle bovine, vaccinate 1-2 mesi
prima del parto. Come virus vaccinale viene largamente
utilizzato il ceppo NCDV-Lincoln, caratterizzato come
G6P1. I dati epidemiologici riportati in letteratura6,10,13,3,11,17
e i risultati della presente indagine hanno evidenziato che
oltre al G6, che è il tipo più diffuso di rotavirus, nei bovini
circolano anche altri G-tipi, e che il tipo P1, presente nel
virus vaccinale, non è molto diffuso sul territorio.
Quest’ultimo dato deve essere valutato con molta attenzione in considerazione del ruolo immunologico sempre
più importante attribuito alla VP4 (P-tipo).
27
4.
5.
6.
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