25 BOVINI Large Animals Review, Anno 4, n. 4, Dicembre 1998 CARATTERIZZAZIONE MEDIANTE PCR DI STIPITI ROTAVIRUS ISOLATI DA VITELLI CON ENTERITE VITO MARTELLA, ANNAMARIA PRATELLI, DOMENICO BUONAVOGLIA*, MARIA TEMPESTA, GIUSEPPE IOVANE** Dipartimento di Sanità e benessere degli animali - Sezione Malattie Infettive - Facoltà di Medicina Veterinaria - Università di Bari Strada Provinciale per Casamassima km 3 - 70042 Valenzano (Bari) *Istituto Malattie Infettive, Profilassi e Polizia Veterinaria - Facoltà di Medicina Veterinaria - Università di Messina * *Dipartimento di Patologia Veterinaria - Facoltà di Medicina Veterinaria - Università di Napoli Riassunto Diversi stipiti di rotavirus di gruppo A isolati da vitelli affetti da enterite sono stati tipizzati per il G e P-tipo mediante polymerase chain reaction. Sono stati ritrovati con maggior frequenza il tipo G6 ed il P5. Summary Several group A rotaviruses isolated from calves affected by enteritis were characterized by polymerase chain reaction assay for G- and P-type. Types G6 and P5 were the most frequently identified. INTRODUZIONE Stipiti virali I Rotavirus appartengono alla famiglia Reoviridae e sono classificati in 7 sierogruppi indicati con le lettere dell’alfabeto da A a G. I rotavirus di gruppo A, B e C colpiscono sia l’uomo che gli animali, mentre gli altri gruppi sono stati identificati solo negli animali.14 I rotavirus di gruppo A sono i più conosciuti poiché sono la causa principale di diarrea neonatale nell’uomo e negli animali. Vengono classificati in sierotipi, in base alle caratteristiche delle proteine VP7 e VP4, che costituiscono il capside esterno del virione ed esprimono, rispettivamente, l’antigene di neutralizzazione maggiore (G-tipo) e l’antigene di neutralizzazione minore (P-tipo).5,2,14 Attualmente sono noti 14 G-tipi e 19 P-tipi. 12 Nell’uomo i tipi più diffusi sono G1, G2, G3, G4, P8, P4, P67,12 mentre nei bovini i tipi più diffusi sono G6, G10, P1, P11 e P5.6,10,13,3,11 Nella presente nota si riportano i risultati di uno studio di caratterizzazione del G-tipo e del P-tipo effettuata mediante la nested PCR su 16 stipiti di rotavirus isolati da bovini. Sono stati complessivamente caratterizzati 16 stipiti di rotavirus isolati da vitelli con diarrea. Il virus 81/36F è stato fornito dal prof. Castrucci. Nelle prove è stato incluso anche il rotavirus presente nel vaccino Scourguard (Pfizer). Per l’isolamento dei virus i campioni di feci, prelevati dall’ampolla rettale, sono stati omogenati al 20% in PBS e sottoposti a centrifugazione per 20’ a 3000 × g. Il surnatante è stato diluito 1: 2 con D-MEM contenente tripsina (1000 µg/ml), filtrato con filtri a porosità 0,22 (Millipore) e quindi utilizzato per l’infezione delle cellule MA-104 sviluppate in terreno contenente 5 µg/ml di tripsina. In presenza di effetto citopatico le cellule sono state sottoposte al test di immunofluorescenza indiretta utilizzando un siero policlonale di coniglio positivo per rotavirus. MATERIALI E METODI Estrazione dell’RNA Il dsRNA genomico di ciascuno stipite è stato estratto dalle colture cellulari che presentavano il 90% di effetto citopatico, mediante il kit RNeasy (Qiagen Gmbh, Germany), basato su una metodica all’isotiocianato di guanidina. Cellule Determinazione del G-tipo Sono state utilizzate cellule renali di scimmia MA-104 sviluppate in terreno minimo essenziale di Dulbecco (DMEM) con l’aggiunta del 10% di siero fetale. La G-tpizzazione è stata eseguita in tre fasi, come descritto da Gouvea et al.8 ed Isegawa et al.10: i) retrotra- 26 Caratterizzazione mediante PCR di stipiti rotavirus isolati da vitelli con enterite scrizione del dsRNA genomico usando la coppia di primer generici Bov9Com5 e Bov9Com3; ii) prima amplificazione mediante PCR di un segmento di 1013 bp del gene della VP7 usando la stessa coppia di primer generici; iii) seconda amplificazione usando il primer generico 5’ e tre primer tipo-specifici (G6, G8 e G10). Due µl di dsRNA sono stati aggiunti a 1,4 µl di dimetilsulfossido e denaturati a 97°C per 5’. L’RNA denaturato è stato immediatamente retrotrascritto a 45°C per 48’ con 50 U di MuLV-retrotrascrittasi (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT) in 20 µl di miscela di reazione contenenti MgCl2 5 mM, KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, 20 U di inibitore dell’RNasi, dNTP 700 µM e 1 µM ciascuna della coppia di primer generici. Il cDNA risultante è stato amplificato mediante 2 U di Taq polimerasi (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT) in una miscela di reazione contenente MgCl 2 mM, KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, dNTP 160 µM e 0,2 µM ciascuno della coppia di primer generici. Il programma termico della prima amplificazione prevedeva 25 cicli di 94°C per 1’, 45°C per 2’ e 72°C per 3’. Dieci µl del prodotto della prima amplificazione, previa diluizione 1: 100, sono stati sottoposti alla seconda amplificazione che prevedeva 25 cicli di 94°C per 1’, 50°C per 2’ e 72°C per 3’. Il prodotto della seconda amplificazione è stato caricato in un gel al 2% di agarosio in tampone TBE (TrisBorato- EDTA, pH 8,0) e sottoposto ad elettroforesi per 60’ a 50 V. I genotipi G6, G8 e G10 sono stati identificati sulla base delle dimensioni delle bande, rispettivamente pari a 288, 145 e 634 bp, osservate dopo colorazione del gel con etidio bromuro e visualizzazione al transilluminatore a UV. FIGURA 1 - Caratterizzazione del G-tipo mediante PCR. A: standard; B: G6 (288 bp); C: G8 (145 bp); D: G10 (634 bp). Determinazione del P-tipo La determinazione del P-tipo è stata eseguita in maniera analoga a quella utilizzata per la determinazione del Gtipo. Per la retrotrascrizione e per la prima amplificazione sono stati usati la coppia di primer generici Bov4Com3 e Bov4Com5, ottenendo un frammento di 864 bp. Per la seconda amplificazione è stato usato il primer generico 5’ ed i primer specifici per il P-tipo (P1, P5, P11). Dopo elettroforesi in gel di agarosio al 2% e colorazione con etidio bromuro, i genotipi P1, P5 e P11 sono stati identificati in base alla grandezza delle bande, rispettivamente di 460, 659 e 322 bp. RISULTATI Nella Figura 1 sono evidenziati i prodotti amplificati della PCR per la caratterizzazione dei G-tipi (G6, G8 e G10), mentre nella Figura 2 sono evidenziati gli amplificati della PCR per la caratterizzazione dei P-tipi (P1, P5, P11). Come riportato nella Tabella 1, tredici stipiti sono risultati G6, tre sono risultati G10 e due G8. In due casi (RV 08 ed RV LT) è stata constatata un’infezione mista G6+G10. Per quanto riguarda il P-tipo, quattordici virus sono risultati P5 e tre P11. In un caso è stato evidenziato P1+P5 FIGURA 2 - Caratterizzazione del P-tipo mediante PCR. A: standard; B: P1 (460 bp); C: P5 (659 bp); D: P11 (322 bp). e in un altro P1+ P5+ P11. Fra gli stipiti caratterizzati, la combinazione prevalente è risultata la G6P5, mentre il virus vaccinale è stato tipizzato come G6P1, identico al ceppo vaccinale americano NCDV-Lincoln. Tabella 1 Risultati della caratterizzazione del genotipo di rotavirus isolati da bovini Isolamento RV 02 RV 03 RV 04 RV 05 RV 06 RV 08 RV LM RV LB RV LT RV 125/94 RV 64/93 RV 81/36F RV 13/95 RV 14/95 RV 73/95 RV 154/98 Vaccino G-tipo 10 6 6 6 6 6, 10 6 6 6, 10 6 6 6 8 8 6 6 6 P-tipo 5 5 5 5 5 5, 1 5 5 5, 1, 11 5 11 5 5 5 11 5 1 Parole chiave Rotavirus, PCR, G-tipo, P-tipo, bovini. Key words Rotavirus, PCR, G-type, P-type, cattle. Abbreviazioni VP: viral protein. ELISA: Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay. bp: paia di basi (base pair). PCR: polymerase chain reaction. dsRNA: RNA bicatenario (double stranded RNA). UV: luce ultra-violetta. Bibliografia 1. CONCLUSIONI 2. 3. Gli studi condotti negli ultimi anni sul ruolo delle proteine del capside esterno dei rotavirus nell’induzione della protezione immunitaria hanno evidenziato che la VP7 (Gtipo) ha una importanza prevalente ai fini della protezione omotipica.9,16,1 Lu et al.13 hanno tuttavia descritto l’isolamento di un rotavirus da vitelli con enterite nati da bovine regolarmente vaccinate nei confronti della rotavirosi ed hanno ipotizzato che la mancata protezione potesse essere attribuita alla diversità del P-tipo del virus isolato rispetto al virus vaccinale. Il ruolo preciso delle proteine VP7 e VP4, o di altre proteine virali, nell’induzione della protezione immunitaria, non è stato ancora perfettamente definito.4 Il concetto di protezione omotipica ha suggerito, in campo umano, l’utilizzazione di un vaccino quadrivalente riassortante, contenente i 4 G-tipi più diffusi nella popolazione. Questo tipo di vaccino ha evidenziato un’efficacia superiore all’80% nel prevenire la forma enterica acuta da rotavirus, mentre non è riuscito a proteggere dall’infezione. A tale proposito, tuttavia, occorre precisare che neanche l’immunità acquisita a seguito di infezione naturale riesce a prevenire una reinfezione.6 In ambito veterinario, la profilassi della rotavirosi nei vitelli è basata sulla protezione passiva indotta dagli anticorpi colostrali trasmessi dalle bovine, vaccinate 1-2 mesi prima del parto. Come virus vaccinale viene largamente utilizzato il ceppo NCDV-Lincoln, caratterizzato come G6P1. I dati epidemiologici riportati in letteratura6,10,13,3,11,17 e i risultati della presente indagine hanno evidenziato che oltre al G6, che è il tipo più diffuso di rotavirus, nei bovini circolano anche altri G-tipi, e che il tipo P1, presente nel virus vaccinale, non è molto diffuso sul territorio. Quest’ultimo dato deve essere valutato con molta attenzione in considerazione del ruolo immunologico sempre più importante attribuito alla VP4 (P-tipo). 27 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. Beards GM, King JA, Mazhar S, Landon J and Desselberger U. Homotypic and heterotypic immune responses to group A rotaviruses in parenterally immunized sheep. Vaccine. 1993, 11(2): 262-266. Bellamy AR and Bath GW. Molecular biology of rotaviruses. Adv. Virus Res. 1990, 38: 1-38. Chang KO, Parwani AV and Saif LJ. The characterization of VP7 (Gtype) and VP4 (P-type) genes of bovine group A rotaviruses from field samples using RT-PCR and RFLP analysis. Arch. Virol. 1996, 141: 1727-1739. Estes MK and Cohen J. Rotavirus gene structure and function. Microbiol. Rev. 1989, 53: 410-449. Feng N, Vo PT, Cheng D, Vo TVP, Hoshino Y and Greenberg HB. Heterotypic potection following oral immunization with live heterologous rotavirus in a mouse model. J. Infect. Dis. 1997, 175: 330-341. Glass RI, Gentsch JR and Ivanoff B. New lessons for rotavirus vaccines. Science. 1996, 272: 46-48. Gorrell RJ and Palombo EA. Use of non-radioactive probes for VP4 typing of human rotaviruses. J. Virol. Meth. 1996, 61: 59-64. Gouvea V, Glass RI, Woods P, Taniguchi K, Clark HF, Forrester B and Zhao-Yin Fang. Polymerase chain reaction amplification and typing of rotavirus nucleic acids from stool specimens. J. Clin. Microbiol. 1990, 28: 276-282. Green KY, Taniguchi K, Mackow ER and Kapikian AZ. Homotypic and heterotypic epitope-specific antibody responses in adult and infant rotavirus vaccinees: implications for vaccine development. J. Infect. Dis. 1990, 161 (4): 667-679. Isegawa Y, Nagakomi O, Nagakomi T, Ishida S, Uesugi S and Ueda S. Determination of bovine rotavirus G and P serotypes by polymerase chain reaction. Mol. Cell. Probes. 1993, 7(4): 277-284. Ishizaki H, Sakai T, Shirahata T, Taniguchi K, Urasawa T, Urasawa S and Goto H. The distribuition of G-Type and P-type within isolates of bovine rotavirus in Japan. Vet. Microbiol. 1996, 48(3-4): 367-372. Kirkwood CD, Coulson BS and Bishop RF. G3P2 rotaviruses causing diarrhoeal disease in neonates differ in VP4, VP7, and NSP4 sequence from G3P2 strains causing asymptomatic neonatal infection. Arch. Virol. 1996, 141: 1661-1676. Lu W, Duhamel GE, Benfield DA and Grotelueschen DM. Serological and genotypic characterization of group A rotavirus reassortants from diarrheic calves born to dams vaccinated against rotavirus. Vet. Microbiol. 1994, 42: 159-170. Paul PS and Lyoo YS. Immunogens of rotaviruses. Vet. Microbiol. 1993, 37: 299-317. Snodgrass DR, Fitzgerald T, Campbell I, Scott FMM, Browning GF, Miller DL, Herring AJ and Greenberg HB. Rotavirus serotypes 6 and 10 predominant in cattle. J. Clin. Mincrobiol. 1990, 28: 504-507. Snodgrass DR, Fitzgerald TA, Campbell I, Browning GF, Scott FMM, Hoshino Y and Davies RC. Homotypic and heterotypic serological responses to rotavirus neutralization epitope in immunological naive and experienced animal. J. Clin. Microbiol. 1991, 29: 2668-2672. Suzuki Y, Sanekata T, Sato M, Tajima K, Matsuda Y and Nagakomi O. Relative frequencies of G (VP7) and P (VP4) serotypes determined by polymerase chain reaction assays among japanase bovine rotaviruses isolated in cell culture. J. Clin. Microbiol. 1993, 31: 3046-3049. BOVINI Large Animals Review, Anno 4, n. 4, Dicembre 1998