Sindrome enterica del vitello ad eziologia batterica e virale prof. Vincenzo CUTERI Dipartimento Scienze Veterinarie Università di Camerino www.cuteri.eu [email protected] Il nostro oggetto di studio …. o forse è questo? Sindromi enteriche 13 % degli animali muore entro 2 mesi di vita 8 - 10 % è causato da agenti infettivi (virus e batteri) Campo di azione: intestino Sistemi di difesa dell’apparato enterico – Specie animale, genotipo, età.. – Acidità gastrica ed altre barriere fisiche – Motilità intestinale – Microflora autoctona – Immunità specifica fagocitosi, immunità umorale e cellulare – Fattori protettivi non specifici Sistemi di difesa Specie animale, genotipo, età.. – Recettori intestinali K99 sono specifici – Age window ammalano solo i neonati – competizioni cellulari, enzimatiche, immunità Acidità gastrica ed altre barriere fisiche – pH < 4.0 99% degli enterobatteri viene inattivato in 30 min. Sistemi di difesa Motilità intestinale – regola assorbimento dei liquidi – equilibrio flora autoctona. Flora autoctona – ostacola colonizzazione batteri patogeni, – sopperisce allo shift degli antibiotici Sistemi di difesa Mucosa intestinale – comprende GALT e MALT. Funzioni di GALT – – – – protezione da agenti infettivi gastrointestinali inibizione attachment difesa flora autoctona annullamento allergie alimentari – difesa da reazioni immunitarie anomale Sistemi di difesa Placche del Peyer e appendice cecale Mucosa intestinale – apparente stato fisiologico di infezione Immunità specifica – Linfociti T della lamina propria: CD4 (IL) – Linfociti T helper – Natural killer – Linfociti T citotossici Sistemi di difesa Immunità specifica – Linfociti B Plasmacellule – IgAs IgAs,….. ,….. IgG, IgM – Cellule dendritiche – Macrofagi – Mastzellen Intestino: colonizzazione alla nascita Flora microbica commensale Lactobacillus Streptococcus Micrococcus Bacteroides Clostridium Enterococcus Apparato enterico: fattori debilitanti Alterazioni anatomiche o funzionali Somministrazione di farmaci o sostanze tossiche Attività ostruttiva Malnutrizione Immunosoppressione Parassiti Agenti infettivi Insorgenza sindrome enterica Variazione dell’equilibrio ospiteospite-parassita Natura multifattoriale Intervento di virus e/o batteri Sindrome enterica: agenti eziologici Virus Batteri Parassiti Rotavirus Salmonella Cryptosporidium Coronavirus E. coli Giardia Parvovirus Campylobacter Adenovirus Clostridium Astrovirus Rotavirus: introduzione Isolato per la prima volta nel Nebraska (USA) da Mebus et al. Nel 1969 Inizialmente venne definito Reo Reo--like e identificato con la sigla NCDV (Neonatal Calf Diarrhoea Virus) Isolato poi da feci di bambini con diarrea Infine isolato da conigli, ovini, suini, ecc. Creato un nuovo genere nella Fam. Reoviridae Eziologia Fam. Reoviridae – Gen. Orthoreovirus – Gen. Orbivirus – Gen. Rotavirus – Gen. Coltivirus – Gen. Aquareovirus – Gen. Cypovirus Eziologia Rotavirus – RNA bicatenario bicatenario,, lineare plurimolecolare (11 segmenti) – Simmetria icosaedrica – Dimensioni 60 - 80 nm – Sprovvisti di envelope, envelope, dotati duplice capside Reoviridae:simmetria Rotavirus: microscopio elettronico Rotavirus: microscopio elettronico Rotavirus Rotavirus Colture (materiale: contenuto intestinale o feci trattate tripsina) Cellule di Macaca mulatta (Ma104) CPE: inclusi citoplasmatici Resistenza Incorporato alle feci sopravvive 6 mesi Rotavirus: coltura in Ma 104 Rotavirus: substrato cellulare Ma 104 Rotavirus: substrato cellulare Ma 104 con CPE Proteine virali Ogni segmento del genoma codifica per una proteina – 6 strutturali (VP1, VP2, VP3, VP4, VP6, VP7) – 5 non strutturali (NSP1, NSP2, NSP3, NSP4, NSP5) VP1 - RNARNA-Polimerasi VP2 - Antigene minore di sottogruppo VP4 - Antigene minore di neutralizzazione, emagglutinante VP7 - Antigene maggiore di neutralizzazione, responsabile adsorbimento alla cellula. Spettro d’ospite Il virus può essere isolato da – primati, bovini, ovini, suini, equini, conigli, cani, gatti, topi, cervi, daini, antilopi, gazzelle, volatili Anticorpi sono stati evidenziati in – capre, bufali, orsi, canguri e cavie Non ospite specifici in seguito ad infezione sperimentale, da dimostrare in natura Struttura antigene Identificati 7 sierogruppi (A ….G) ….G) distinguibili per un antigene di gruppo localizzato in VP6 All’interno dei sierogruppi esistono due sottogruppi (SI e SII) per la presenza di 2 antigeni di sottogruppo localizzati in VP6 e VP2 I Rotavirus di gruppo A sono classificati in sierotipi in base alla VP4 e VP7 Protease-sensitive sensitive)) [[11 11]] – VP4 identifica il P-tipo (Protease– VP7 identifica il G-tipo (Glicoproteina) Glicoproteina) [[14 14]] Rotavirus: epidemiologia Diffusione cosmopolita con gruppi e sierotipi diversi Disseminazione del virus con le feci Rotavirus non sono ospite specifici Prevalenza 25% (Scozia), 3 % (Puglia) Epidemiologia Trasmissione per via orooro-fecale (orizzontale) Trasmissione indiretta – utensili, attrezzi e mangimi contaminati da feci Esclusa trasmissione con insetti ematofagi o transplacentare (infezione localizzata) Trasmissione interspecifica? Interessati solo giovani Rotavirus Specie animali recettive: bovina, ovina, (caprina?), equina, suina, coniglio, cane, gatto, topo daino, cervo, antilope, gazzella scimmia, uomo Rotavirus: patogenesi Contagio orooro-fecale intestino villo intestinale cellule mature (cilindriche apicali) Conseguenze sistemiche diminuzione permeabilità intestinale diminuzione disaccaridi intestinali aumento della pressione osmotica Villi intestinali (ME) Patogenesi Penetrazione per via orale Organo bersaglio primario: enterociti villi intestino tenue Desquamazione e accorciamento dei villi Iperplasia cellule della cripta Cessata funzionalità del villo Patogenesi Processi di assorbimento impediti Aumento di liquido nel lume intestinale Sintomatologia Periodo d’incubazione 11-3 giorni ma possibile osservare malattia anche dopo 44-6 ore dalla nascita Feci acquose, emissione frequente Tenesmo, Anoressia Disidratazione Enterite catarrale Atrofia dei villi – Cellule cilindriche sostituite da pavimentose Rotavirus: sintomatologia Diarrea liquida giallastra, bianca maleodorante Meteorismo, dolorabilità addominale, tenesmo Decubito persistente, alimentazione ?, disidratazione Durata della malattia 2/3 gg Morte Feci di agnello con infezione da Rotavirus Vitello: infezione da Rotavirus Vitello : infezione da Salmonella Rotavirus: lesioni Decapitazione del villo – cellule cilindriche sostituite da cellule piatte Conseguenze sistemiche diminuzione attività enzimatiche maggiore velocità del contenuto Diagnosi Diagnosi clinica – Età degli animali, sintomi apparato enterico Diagnosi sperimentale – Isolamento virus (Cellule MA104) – Microscopio elettronico – PAGE (Poly (Poly Acrylamide Gel Electrophoresis) Electrophoresis) – PCR – Prove sierologiche poco attendibili, non usate Campionamento intestino Campionamento feci dal retto Campionamento feci dal cieco Rotavirus: feci al ME Rotavirus e Coronavirus: feci di vitello al ME Coronavirus: feci vitello al ME Rotavirus: feci agnello al ME Diagnosi differenziale – Infezioni da Enterobacteriaceae – Coccidiosi – Infezione da Coronavirus – Infezione da Parvovirus Infezione da Rotavirus: profilassi Profilassi igienico - sanitaria – Ridurre la concentrazione di animali – Allontanare i neonati da altri vitelli – Somministrare colostro Infezione da Rotavirus: profilassi Profilassi immunizzante – Vaccino a virus inattivato e adiuvante Montanide o analoghi (106-107 DCP50/0.2 ml) – Somministrare alle madri 30 e 7 giorni prima del parto – In commercio associato ad E. coli enteropatogeno Infezione da Rotavirus nell’uomo Isolati dalle feci del 20 - 70 % dei bambini ricoverati per diarrea acuta Nei paesi in via di sviluppo 1.000.000 di morti all’anno Negli USA si isolano nel 3% dei bambini sotto i 5 anni ricoverati in ospedale – costo annuale circa 1.000.000.000 $ Infezione da Rotavirus nell’uomo L’infezione conferisce immunità protettiva Stipiti di origine animale sono correlati con stipiti di origine umana Stipiti naturalmente attenuati Vaccinazione Jenneriana eterotipica di Iª generazione Infezione da Rotavirus nell’uomo Vaccini Jenneriani polivalenti di IIª generazione Immunità omotipica nei confronti dei 4 sierotipi di Rotavirus predominanti nell’uomo RNA virale 11 segmenti: - 2 codificano per proteine del capside - VP4 emagglutinina - VP7 glicoproteina (neutralizzazione) Ricombinazione genetica Infezione da Rotavirus nell’uomo Ricombinazione genetica – 10 segmenti del virus di origine animale – 1 segmento del virus di origine umana 4 ricombinanti cosi costituite Vaccino polivalente Ingegneria genetica: inserimento geni virali nei vegetali (patata, banana) Escherichia coli Fam. Enterobacteriaceae Gen. Escherichia, Salmonella, Shigella… Diffusi nell’ambiente ... intestino, feci Stipiti con caratteristiche diverse.. Escherichia coli enterotossico (ETEC) E. coli Prodotti del metabolismo – endotossina – colicina – emolisina – enterotossina (LT, ST) E. coli ETEC Caratteri LT ST 100.000 1500 pH 5.0 labile stabile pH 9.0 stabile stabile tripsina resistente resistente tardiva precoce PM Azione enterotossica E. coli ETEC: dosaggio enterotossine LT (suino - secreta da pochi stipiti) – ileal loop – cloni cellulari (Y1, CHO) ST (vitello (vitello--agnello - secreta da molti stipiti) – inoculazione topino neonato LT & ST (secreta da pochi stipiti) Dosaggio enterotossina LT E. coli (anse intestinali di coniglio) Dosaggio enterotossina LT E. coli (anse intestinali di coniglio) Dosaggio enterotossina LT E. coli (anse intestinali di coniglio) E. coli ETEC: dosaggio enterotossina ST E. coli ETEC: dosaggio enterotossina ST Enterotossina: modalità di azione LT – AMPAMP-ciclica attiva la secrezione intestinale – enterotossina esaspera tale attività ST – Guanilciclasi attiva guanosin monofosfato ciclico con aumento della secrezione cellulare E. coli: struttura antigenica O – Antigene somatico (180) K – Antigene capsulare (85) H – Antigene ciliare (60) P – Ag piliare E. coli ETEC antigeni piliari e specie animali Pili Suino Bovino Ovino F4 (K88) +++ - - F5 (K99) - +++ +++ F6 (987P) +++ - + E. coli ETEC provvisto di Pili (ME) E. coli ETEC provvisto di Pili (ME) E. coli ETEC: Pili dopo centrifugazione (ME) E. coli ETEC colonizzazione agli enterociti E. coli ETEC colonizzazione agli enterociti E. coli: patogenesi Forma setticemica Forma localizzata Forma enterotossiemica Forma enterotossica – E. coli enterotossico provvisto di P Secreto fluido indotto da E. coli ETEC pH isotonico ioni Ca & Mg ioni Na ioni K ioni HCO3 perdita alcalino assenza di proteine scarsi numerosi numerosi numerosi di H2O Eliminazione secreto fluido = diarrea Conseguenze sistemiche – Disidratazione (H2O) – Acidosi metabolica (HCO3) – Contrazione muscolare (K) – Diminuzione bicarbonato plasmatico (Na (Na)) E. coli ETEC: sintomatologia, lesioni Diarrea liquida giallastra, maleodorante Meteorismo, tenesmo, dolorabilità addominale Decubito persistente, alimentazione ?, disidratazione Durata della malattia 2/3 gg Febbre assente Morte Decapitazione del villo – cellule cilindriche sostituite da cellule piatte E. coli ETEC: diagnosi D. clinica D. sperimentale – Isolamento & identificazione E. coli ETEC – Sierologia, IF D. differenziale Rotavirus, Clostridium, Campylobacter.. Siero immune anti Pili coniugato con IF Siero immune anti Pili coniugato con IF (villo intestinale) Rotavirus: epitelio intestinale & IF E. coli ETEC: controllo Norme igieniche Colostro Vaccinazioni – vaccino polivalente (Rotavirus & E. coli ETEC) Terapia antibiotica e sintomatica Terapia Controllo della disidratazione mediante reidratazione orale Ripristino elettrolitico Correzione dell’acidosi Apporto energetico/nutritivo Eliminazione causa scatenante Terapia Il vitello presenta ancora il riflesso della suzione? SI Reidratazione orale No Reidratazione parenterale Se il vitello beve ancora non interrompere la somministrazione del latte Terapia Il latte contiene l’energia, le proteine e i minerali necessari Anche in presenza di danni intestinali le sostanze nutritive del latte possono essere assorbite Il latte contiene sostanze che favoriscono la produzione di nuove cellule intestinali La perdita di peso causata dalla diarrea viene limitata grazie alla somministrazione del latte