Trasformazione in laboratorio

Trasformazione in laboratorio ( KIT 1 )
Scopo: Studiare la trasformazione genetica effettuata in un organismo in cui viene
inscritto il plasmide pGLO
Materiali:

1 Piastra di E.coli

4 Piastre con agar (1 LB, 2 LB/amp, 1 LB/amp/ara)

1Soluzione di trasformazione

1 terreno LB

Anse per inoculo ( un pacco da 10)
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5 Pipette

1 Porta provette galleggiante
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1 contenitore con ghiaccio tritato

1 Penna

1 Copia della guida veloce
Presso la stazione di lavoro del Professore dovrebbe trovarsi il seguente materiale

1 Plasmide pGLO idratato

bagnetto a 42 °C e un termometro

incubatore a 37 °C (opzionale)
Procedura di trasformazione
1. Scrivi su una provetta + DNA e su un'altra provetta -DNA. Scrivi su entrambe le
provette il tuo nome e ponile nel porta provette.
2. Apri le provette ed utilizzando una pipetta sterile trasferisci 100 μl della soluzione
di trasformazione TS (Cloruro di Calcio) in ciascuna provetta.
3. Poni le provette in ghiaccio.
4. Usa un'ansa sterile per prendere una singola colonia batterica dalla tua piastra di
partenza. Immergi l'ansa nella soluzione di trasformazione contenuta nella
provetta su cui è scritto +DNA. Agita I'ansa sulle pareti della provetta finché la
colonia non è dispersa nella soluzione di trasformazione (non ci devono essere
pezzi che galleggiano). Poni la provetta nel porta provette e in ghiaccio. Usando
una nuova ansa sterile, ripeti la procedura per la provetta su cui è scritto -DNA.
5. Preleva con una pipetta da 10 μ l il DNA plasmidico e ponilo nella sospensione
cellulare della provetta + DNA. Chiudi la provetta e rimettila nel porta provette in
ghiaccio. Non aggiungere DNA plasmidico alla provetta -DNA.
6. Incuba le provette in ghiaccio per 10 minuti. Assicurati che la parte inferiore delle
provette sia a contatto con il ghiaccio.
7. Mentre i tubi sono in ghiaccio, scrivi sul fondo delle piastre di agar (non sul
coperchio) quanto segue:
• Su una piastra LB/amp: +DNA
• Su una piastra LB/amp/ara: +DNA
• Su una piastra LB/amp: -DNA
• Su una piastra LB: -DNA
8. Shock termico: usando il porta provette, trasferisci entrambe le provette, la (+) e
la (-) nel bagnetto a 42 °C per esattamente 50 secondi. Assicurati che le provette
siano ben spinte nel fondo del porta provette affinché il fondo delle provette sia a
contatto con l'acqua calda. Quando i 50 secondi sono trascorsi, poni i tubi in
ghiaccio. Per una migliore riuscita della trasformazione, i passaggi dal ghiaccio
(0 °C) a 42 °C e di nuovo al ghiaccio devono essere rapidi. Incuba le provette in
ghiaccio per 5 minuti.
9. Rimuovi il porta provette dal ghiaccio e ponilo sul bancone. Preleva con un
puntale sterile 100 μ l di LB e aggiungili alla provetta poi richiudila. Ripeti la
stessa cosa per l'altra provetta. Incuba le provette per 15 minuti a 37°C.
10. Trascorso il tempo richiesto apri la provetta e, usando un nuovo puntale per ogni
provetta, poni 100 μ l delle sospensioni batteriche di trasformazione (DNA+) e di
controllo (DNA-) nelle piastre appropriate.
11. Usa un'ansa sterile per ogni piastra. Distribuisci le sospensioni uniformemente
sulla superficie dell'agar con un'ansa sterile nuova.
12. Impila le tue piastre e legale insieme con lo scotch. Scrivi il nome sul nastro e
ponile al contrario a 37 °C fino al giorno dopo.
Conclusioni
La trasformazione genetica consiste nell'inserimento di uno o più geni in un organismo
con lo scopo di modificarne le caratteristiche. Ciò accade in quanto il nuovo gene che è
un frammento di DNA contiene informazioni geniche che si vanno ad aggiungere a
quelle del DNA della cellula. Questo materiale genetico codifica per proteine che fanno
assumere all'organismo particolari caratteristiche. In questo kit è stato trasferito
all'interno di una cellula di E.coli un plasmide contenente il gene per la resistenza
all'ampicillina (antibiotico) e il gene per la Green Fluorescent Protein (GFP). La GFP è
una proteina verde fluorescente che è stata estratta dal cromosoma della medusa
Aequora victoria, ed è visibile alla luce ultravioletta. Il gene che codifica per questa
proteina può essere attivato solo in presenza di una particolare sostanza, lo zucchero
arabinosio, che viene aggiunto nel terreno nutritivo in cui vengono coltivate le cellule.
Per effettuare l'inserimento del plasmide nelle cellule batteriche, si sono utilizzati una
serie di accorgimenti:
sono stati preparati 2 campioni in cui è stata aggiunta una soluzione di trasformazione
(CaCl2) ed è stato provocato uno shock termico. I cationi Ca++ hanno lo scopo di
neutralizzare le cariche negative dei fosfolipidi della membrana cellulare, creando le
prime fratture della membrane stessa, mentre la continua e rapida variazione di
temperatura ne aumenta le permeabilità. In questo modo il plasmide riesce a penetrare
attraverso la membrana. Avendo a disposizione 2 campioni, la soluzione contenente il
plasmide viene aggiunta in uno solo dei due, in quanto l'altro viene tenuto come
provetta di controllo in cui non c'è il fattore di trasformazione. Si otterranno organismi
geneticamente modificati (OGM) solo nel primo campione. A questo punto, dopoaver
preparato 3 piastre contenenti i terreni di cultura, sono state seminate le cellule. Nella
prima piastra contenente il solo terreno nutritivo sono state aggiunte le cellule non
modificate; nella seconda, contenente il terreno+ampicillina, sono state seminate in una
metà cellule non modificate e nell'altra cellule geneticamente modificate; nel terzo
terreno in cui era presente sia ampicillina che araminosio, sono state coltivate le cellule
modificate. I risultati sono stati i seguenti: nel primo caso sono cresciute tante cellule
bianche non trasformate (controllo); nel secondo, essendo presente l'antibiotico, nella
prima metà le cellule sono tutte morte non possodendo il gene per la resistenza
all'antibiotico, nella seconda metà i tratti sono cresciutiperò non hanno prodotto la
proteina GFp che si è ottenuta nella terza piastra, in cui l'arabinosio ha indotto la sua
produzione. Le cellule trasformate hanno così espresso nel loro fenotipo i nuovi geni
acquisiti dal plasmide pGLO.