Presentazione di PowerPoint - Dipartimento di Farmacia
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Università degli Studi di Bari Facoltà di Farmacia Corso di Laurea in Chimica e Tecnologia Farmaceutiche --------------------------------------------------------------------------------------- Analisi Chimico Farmaceutica e Tossicologica II IIIa parte Dott. ssa Maria Grazia Perrone --------------------------------------------------------------------------------------a. a. 2013-2014 COMPOSTO PREPARATO IN LABORATORIO TESTATO SAGGI DI AFFINITA’ SAGGI DI ATTIVITA’ SAGGI DI ATTIVITA’ SAGGI DI AFFINITA’ SOMMINISTRAZIONE EFFETTO SACRIFICATO SACRIFICATO PRELIEVO ORGANI RECETTORI SVANTAGGI VARIABILITA’ DI RISPOSTA INTRASPECIE E INTERSPECIE QUANTITA’ MATERIALE BIOLOGICO COSTI SAGGI DI ATTIVITA’ EFFETTO SAGGI DI AFFINITA’ RECETTORI RIDUCE DRASTICAMENTE L’UTILIZZO DI ANIMALI Coltura delle cellule animali Il lavoro con cellule o linee cellulari coltivate in vitro e' ormai entrato nel lavoro quotidiano di quasi tutti i laboratori di ricerca biologica. Le linee stabilizzate offrono l'enorme vantaggio di essere una fonte pressoché inesauribile di un materiale di studio abbondante e omogeneo, dal quale tuttavia e' anche possibile ottenere nuovi cloni e varianti rispetto alla linea originale. Inoltre e' possibile conservare le cellule attraverso il congelamento e recuperarle identiche a se stesse anche dopo anni. Un altro importante vantaggio e' che l'utilizzo delle linee cellulari permette in molti casi di utilizzare recettori umani. Colture Cellulari Le cellule che sono mantenute in coltura possono derivare A) direttamente dalla dissociazione di un tessuto (colture cellulari primarie) hanno di solito una limitata capacità replicativa e tendono a diventare "senescenti. B) da colture precedenti (colture secondarie, terziarie etc.) in grado di replicarsi indefinitamente in coltura. Le cellule di tali linee sono derivate da colture primarie di tumori o da colture primarie non tumorali sulle quali sono state effettuate delle manipolazioni genetiche, chiamate "immortalizzazione", che prevedono l'inserimento di specifici geni virali o anche la sola propagazione per molti passaggi di una coltura primaria. Colture a termine La coltura da espianti viene definita coltura a termine per indicare che le cellule isolate da qualsiasi tessuto animale sono in grado di compiere un numero finito di divisioni cellulari in vitro per poi andare incontro a degenerazione e morte. Colture continue Sono cellule in cui mutazioni spontanee o indotte hanno annullato il programma genetico della senescenza (cellule tumorali). Il laboratorio per le colture cellulari incubatore cappa centrifuga microscopio Terreni per colture La soluzione di sali, glucosio, amminoacidi e vitamine costituisce il terreno base. Questi terreni differiscono tra loro per il contenuto in amminoacidi, sali e per la concentrazione di glucosio. La composizione dei mezzi di coltura prevede: – Sali inorganici (Na+, K+, Mg++, Ca++, Cl-,..) – Glucosio – Aminoacidi essenziali – Vitamine del gruppo B – Tracce di Fe, Zn, Cu, Se, Mn, Mo Terreni per colture MEM Minimum Essential Medium DMEM Dulbecco’s Modification of MEM RPMI 1640 Roswell Park Memorial Institute Il sistema tampone utilizzato nei terreni è: HCO3- / H2CO3 H2CO3 deriva dalla CO2 dell’atmosfera e in parte da quella prodotta dalle cellule. H2O + CO2 HCO3- + H3O+ H2CO3 (H2CO3 + H2O) 2H2O + CO2 Per questo motivo le cellule devono essere coltivate in atmosfera al 5% di CO2 e necessitano pertanto di incubatori con sistema di controllo dell’atmosfera! Altri sistemi tampone: HEPES N-(2-hydroxyethyl)piperazine-N’-(2-ethanesulfonicacid) I terreni tamponati con HEPES sono utili quando le cellule vive devono essere manipolate per tempi lunghi fuori dall’incubatore. In questo caso la CO2 dell’atmosfera non è sufficiente a mantenere il pH neutro per cui il terreno si alcalinizza con conseguente danno per le cellule. I terreni inoltre sono provvisti dell’indicatore rosso fenolo 6.8-7.0 7.3 > 7.6 pH Con il proliferare delle cellule il terreno tenderà al giallo a causa dell’acidificazione prodotta dalla CO2 proveniente dal metabolismo cellulare. Il colore viola indica che le cellule non sono metabolicamente attive o che la regolazione della CO2 è errata. Il terreno al momento dell’uso viene completato con: •Glutammina (è un amminoacido labile) •Antibiotici: Penicillina/Streptomicina Gentamicina •Siero (in genere al 10%): FBS (Siero Fetale Bovino) DHS (Siero di Cavallo) Siero - Formulazione aspecifica di fattori di crescita - Siero bovino fetale (FBS), siero bovino neonatale (NCS), siero di cavallo (HS) - Sostegno alla crescita per molti tipi cellulari - Aumenta la capacità tampone - Protegge dai danni meccanici - Facilita l’adesione Siero Il siero, prima del suo utilizzo, viene disattivato in stufa a 56°C per 30min. Con questa procedura viene eliminato il Sistema del Complemento, che potrebbe interferire con la crescita delle cellule. Il sistema del complemento Il sistema del complemento, insieme con gli anticorpi, rappresenta L'ELEMENTO ESSENZIALE DEI MECCANISMI DI DIFESA UMORALI CONTRO AGENTI INFETTIVI. Esso è costituito da una ventina di proteine circolanti e di membrana, capaci di interagire reciprocamente e con le membrane cellulari. L'attivazione a cascata delle sue proteine solubili è alla base di attività biologiche come la lisi cellulare, batterica o virale. Il sistema del complemento Le proteine si introducono nelle membrane degli agenti patogeni provocando su di esse pori che portano alla lisi. Durante l'attivazione del complemento si ha inoltre il reclutamento di varie cellule immunocompetenti, quali cellule fagocitarie (monociti, macrofagi, polinucleati), linfociti B e linfociti T. Colture cellulari in sospensione aderenti Colture cellulari in sospensione Le cellule in sospensione normalmente non si attaccano, crescono sospese nel mezzo di coltura. Le caratteristiche delle cellule in vitro di solito dipendono dalla loro origine nell'animale (in vivo). Ad esempio, quasi tutte le cellule in sospensione derivano dalle cellule del sistema immunitario o dai loro precursori; in vivo, esse circolano nel torrente sanguigno e non tendono certo ad attaccarsi ad un substrato (ad es. i linfociti T e B). La crescita delle cellule in sospensione può avvenire in condizioni statiche o in agitazione. HL-60 Species: Human, Caucasian; Tissue: Peripheral Blood; Tumor: Leukemia, Promyelocytic continuous culture, grown in suspension, morphology lymphoblast-lik Colture cellulari aderenti L’adesione è un fenomeno attivo che richiede l’interazione dei recettori di membrana, le integrine, con le proteine adesive, quali la fibronectina, adsorbite sulla piastra di coltura. Colture cellulari aderenti Le cellule aderenti derivano invece da muscoli, fegato, sistema nervoso, rene ed altri organi e non sono mobili all'interno dell'organismo. Queste cellule sono divise in base alla forma in 2 grandi classi: le cellule fusiformi, come i fibroblasti, e cellule poligonali, di tipo epiteliale. Cellule di carcinoma della cervice (HeLa) Le HeLa sono state le prime cellule umane immortalizzate e hanno rappresentato una grande risorsa per la ricerca scientifica. Questa linea cellulare fu isolata e propagata per la prima volta da George Otto Gey nel 1951 a partire da un lembo di tessuto di massa tumorale (cancro della cervice uterina) di una paziente Henrietta Lacks. Cellule di AdenoCarcinoma del Colon (CaCo-2) Colture di cellule aderenti Le cellule aderenti vengono poste in piastra o in fiasca e crescono fino ad occupare l’intera superficie disponibile. Quando le cellule occupano l’intera superficie disponibile Coltura confluente A confluenza la crescita si arresta e le cellule devono essere trasferite in nuove piastre. Per staccare le cellule dal fondo delle piastre si utilizza una soluzione di EDTA e tripsina EDTA = chela il Ca++ ed il Mg++ indispensabili per l’adesione Tripsina = degrada le proteine della matrice che mantengono le cellule aderenti (catalizza il taglio proteolitico con specificità verso la lisina e l’arginina). Splitting delle Cellule 1) Accertarsi della confluenza e dello stato delle cellule 2) Rimuovere il terreno (contiene un inibitore della tripsina: alfa-1-antitripsina) 3) Lavare lo strato cellulare con PBS 4) Aggiungere Tripsina/EDTA 5) Mettere il contenitore in incubatore per 2-10 minuti 6) Osservare le cellule al microscopio per accertarsi che siano in 7) Centrifugare 8) Scartare il surnatante e risospendere le cellule in un appropriato volume di terreno completo 9) Contare le cellule sospensione Conta Cellulare Camera di Burker Le cellule staccate devono essere riseminate nella giusta densità (variabile a seconda del tipo di cellula), non crescono in modo efficiente e vanno incontro a morte se seminate al di sotto di una certa densità. Solitamente la crescita esponenziale si ha con valori di densità compresi tra 104 e 105 cellule per cm2. Ciclo delle colture cellulari 37°C, 5% CO2, 100% umidità, 3-5 giorni scongelamento Lavaggio con PBS Tripsina / EDTA semina conteggio congelamento cellule/cm2 x 104 Diagramma di crescita cellulare in vitro 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 arresto della crescita a confluenza fase logaritmica di crescita 0 24 48 72 ore 96 120 144 Parametri critici per le colture cellulari Temperatura Le cellule possono sopportare l’ipotermia (sono conservate congelate) ma la loro attività metabolica è notevolmente disturbata. Non possono sopportare l’ipertermia (anche piccoli aumenti di temperatura per brevi periodi possono far morire le cellule). Una temperatura di 43°C per pochi minuti provoca la morte per apoptosi. Dewar per Criocongelazione Due prove permettono di misurare l’influenza temperatura sullo sviluppo delle cellule: - La valutazione dell’attività metabolica mitocondriale Attività metabolica a differenti temperature di incubazione Attività metabolica mitocondriale 5 36 °C 37 °C 38 °C 4 3 2 1 0 10000 15000 n° cellule 20000 della - La valutazione della quantità di proteine sintetizzate dalla popolazione delle cellule. sintesi proteica (%) 300 200 100 0 34 35 36 37 38 39 Temperatura (°C) 40 41 42 Umidità relativa (RH %) In un incubatore a CO2 il paramentro di temperatura è direttamente collegato con l’umidità relativa (RH %) L’energia fornita dall’incubatore serve sia a mantenere la temperatura che ad evaporare l’acqua dall’apposito vassoio per portare il livello di umidità relativa alla giusta percentuale. L’umidità relativa RH è un parametro che è portato ad un livello elevato senza necessariamente essere controllato. L’obiettivo è di limitare l’evaporazione dell’acqua contenuta nei terreni di coltura per non provocare un aumento della pressione osmotica. La difficoltà maggiore consiste nel raggiungere un livello molto elevato di RH nella camera (RH >98%) evitando la condensazione sulle pareti o sugli oggetti contenuti nell’incubatore. Le goccioline di condensazione costituirebbero un ambiente ideale per la contaminazione e lo sviluppo di organismi dispersi nell’aria che entrano durante l’apertura dell’incubatore. Il pH E’ molto importante il sistema tampone che interviene verso la fine del periodo di coltura e cioè quando il metabolismo cellulare ha prodotto H+. CO2 La pressione parziale di CO2 usata nella coltura delle cellule corrisponde alla pCO2 misurata all’interno dei tessuti (35-45 mmHg). In questo modo l’incubatore riproduce rigorosamente le naturali condizioni di sviluppo delle cellule. Incubatore a CO2 L’incubatore a CO2 è un’attrezzatura di precisione per il mantenimento delle cellule in coltura; è costituito da una camera chiusa al cui interno sono ricreate, nei limiti del possibile, le condizioni fisiologiche dei tessuti animali in cui le cellule vivevano prima dell’isolamento. I parametri che vengono tenuti sotto controllo sono: Temperatura: il controllo della temperatura (che deve essere mantenuta costante a 37°C) viene assicurato da un termostato che agisce su una resistenza; un sistema di ventole per la circolazione forzata dell’aria garantisce che la temperatura sia uniforme in tutti i punti della camera. Concentrazione di CO2: il livello di anidride carbonica può variare dallo 0,03% al 40%; per esperimenti in normossia, l’aria atmosferica è miscelata con il 5% di CO2. pH: deve essere di 7,4. Umidità: l’ambiente deve essere saturo; allo scopo nell’incubatore è presente un vassoio di umidificazione contenente acqua. DETERMINAZIONE DELLA CITOTOSSICITA’ CITOTOSSICITÀ: effetto di un agente di tipo chimico (una molecola), fisico (temperatura, radiazione o onda elettromagnetica) o biologico (una cellula del sistema immunitario) in grado di indurre danno ad una cellula. L'agente che induce tale danno viene spesso definito citotossina. Saggio di Citotossicità AGENTE CITOTOSSICO EFFETTO TOSSICO CAMBIAMENTO DELLA MORFOLOGIA CAMBIAMENTO DELLA FUNZIONALITA’ I test di citotossicità rappresentano un “metodo di valutazione “ dei danni biologici provocati dalle sostanze. SAGGI DI VITALITA’ CELLULARE Test di vitalità cellulare Saggio con il Blu Tripano Il Blu Tripano è un colorante utilizzato nel test di determinazione della vitalità cellulare. Questo colorante permette di discriminare tra le cellule vitali e quelle morte in quanto è assunto solo dalle cellule morte. Saggio con BLU TRIPANO Aspirare il terreno Lavare con PBS Conta cellulare Aggiungere Risospendere in PBS Tripsina/EDTA C = 2-5 x 105 cell/mL 0,5 mL Blu tripano + 0,3 mL PBS + 0,2 mL sospensione cellulare Conta Cellulare Dosaggio MTT bromuro di 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil tetrazolio Il saggio MTT è un saggio colorimetrico standard per la misurazione dell'attività degli enzimi che riducono l‘ MTT a formazano, conferendo alla sostanza un colore blu/violaceo. L'enzima mitocondriale succinato deidrogenasi (reduttasi), è attivo infatti soltanto nelle cellule vive, e la sua funzione consiste nel tagliare l'anello di tetrazolio dell‘ MTT (sostanza di colore giallo) con la formazione, di conseguenza, di formazano (un sale blu). MTT (giallo) Formazano (azzurro) Tale reazione è valutata e misurata mediante la lettura spettrofotometrica del campione, alla lunghezza d'onda di 570 nm. Ciò accade prevalentemente nei mitocondri; questo saggio può essere utilizzato per determinare la citotossicità di farmaci o altri tipi di sostanze chimicamente attive e potenzialmente tossiche. Dosaggio MTT Prevenzione della contaminazione Sono possibili differenti tipi di contaminazione I principali tipi di contaminanti microbici : Batteri e funghi Micoplasma Virus La contaminazione può avvenire: Errore dell’operatore Terreni contaminati Cappa biologica non funzionante Incubatore contaminato Conservazione in azoto liquido contaminato Prevenzione della contaminazione Precauzioni per la prevenzione delle contaminazioni 1) I terreni e le soluzioni che si usano devono essere tutti sterili 2) Aggiungere penicillina-streptomicina per scongiurare il pericolo di contaminazioni da batteri; anfotericina B (se non tossica per le cellule) contro i miceti. 3) Destinare il laboratorio solo alle colture cellulari 4) Operare sempre sotto cappa a flusso laminare 5) Utilizzare solo materiale sterile (di vetro o di plastica) 6) Utilizzare sempre pipettatori elettrici 7) Pulire bene la cappa a inizio e fine lavoro 8) Controllare periodicamente i filtri della cappa 9) Mantenere con attenzione ben pulito l’incubatore a 37°C Il laboratorio per le colture cellulari capp a centrifu ga incubato re microscop io Cappa a flusso laminare La maggior parte delle attività di laboratorio, quali la miscelazione, la frantumazione, l’agitazione, lo scuotimento di materiale infetto possono inavvertitamente generare aerosol pericolosi; essendo gli aerosol importanti fonti di infezione, si deve cercare di ridurne la formazione e dispersione al minimo. E’ buona norma eseguire queste operazioni in una cappa di sicurezza biologica di tipo appropriato. Le cappe agiscono come barriere per minimizzare il rischio di infezioni per via aerea impedendo la fuoriuscita di questi aerosol nell’ambiente di laboratorio e la loro inalazione da parte dei lavoratori. Cappa a flusso laminare Cappa a flusso laminare Esistono tre tipi di cappe di sicurezza biologica: classe I, II, e III. La loro efficacia dipende dal flusso dell’aria, dalla capacità di contenimento, dall’integrità dei filtri HEPA (high efficiency particulate airfilter) e, nel caso delle cappe I e II, dalla loro posizione nella stanza in relazione alle correnti di aria e ai movimenti del personale (vanno poste lontano dalle zone di passaggio e da correnti d’aria provenienti da porte, finestre e dall’impianto di aerazione). Cappa di sicurezza biologica di classe II a flusso laminare verticale Cappa a flusso laminare Una cappa di sicurezza biologica classe II è una cappa ventilata aperta frontalmente progettata per la protezione dell’operatore, dei prodotti al suo interno e dell’ambiente circostante. E’ caratterizzata da un flusso d’aria in ingresso e con filtrazione sia dell’aria aspirata sia di quella espulsa: il flusso laminare, proveniente dal sovrastante filtro HEPA (C), scende perpendicolarmente al piano di lavoro evitando di investire l’operatore, l’aria espulsa deve essere filtrata da un secondo filtro HEPA (E) e, se ricircolata nello stesso locale, da un filtro supplementare a carbone attivo posto a valle del filtro HEPA, per trattenere eventuali frazioni gassose Microscopio Ottico Il microscopio ottico tradizionale è il più semplice. Per mezzo di lenti ingrandisce l'immagine del campione, illuminato con luce nell'intervallo spettrale del visibile. Può essere semplice (un solo sistema di lenti o addirittura una sola lente) o composto (almeno due sistemi, oculare ed obiettivo), e l'illuminazione può raggiungere il campione da dietro, attraversandolo (luce trasmessa), o esserne riflessa (luce riflessa). Il microscopio ottico permette di avere immagini di soggetti dimensionalmente collocati all'incirca tra il millimetro ed il micrometro, anche di esseri viventi. Autoclave per sterilizzazione L`autoclave, uno strumento estremamente importante nella pratica microbiologica, assicura l'uccisione dei microrganismi, incluse le endospore, mediante l'utilizzazione di calore umido. La sterilizzazione mediante calore prevede un trattamento che provoca la completa distruzione di tutti gli organismi e poiché le endospore sono praticamente ubiquitarie, le procedure di sterilizzazione vengono opportunamente programmate per la loro eliminazione. Per ottenere questi risultati è necessario raggiungere temperature superiori al punto di ebollizione dell'acqua, e ciò viene ottenuto immettendo vapore saturo sotto pressione nella camera a chiusura ermetica dell'autoclave. Autoclave per sterilizzazione Il principio è quello sfruttato dalle normali pentole a pressione, che infatti possono venire utilizzate con risultati soddisfacenti per sterilizzare piccole quantità di materiale. La pressione usualmente utilizzata per la sterilizzazione in autoclave è di 1.1 kg/cm2 (corrispondente a 1 atm di sovrapressione), che permette di raggiungere una temperatura di 121ºC; a questa temperatura il tempo di trattamento è generalmente di 10-15 minuti. Se è necessario sterilizzare oggetti di grandi dimensioni, bisogna tenere presente che la diffusione del calore al loro interno sarà piuttosto lenta, e il tempo di sterilizzazione deve essere più lungo. Stufe per sterilizzazione La sterilizzazione in stufa avviane mediante calore secco. In stufa possono essere disattivati i sieri di coltura (56° C per 30 min) oppure sterilizzato il materiale in vetro (pipette, bottiglie, matracci, beute, etc) (160° C per 4 h).
