Università degli Studi di Bari
Facoltà di Farmacia
Corso di Laurea in Chimica e Tecnologia Farmaceutiche
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Analisi Chimico Farmaceutica e
Tossicologica II
IIIa parte
Dott. ssa Maria Grazia Perrone
--------------------------------------------------------------------------------------a. a. 2013-2014
COMPOSTO PREPARATO IN LABORATORIO
TESTATO
SAGGI DI AFFINITA’
SAGGI DI ATTIVITA’
SAGGI DI ATTIVITA’
SAGGI DI AFFINITA’
SOMMINISTRAZIONE
EFFETTO
SACRIFICATO
SACRIFICATO
PRELIEVO ORGANI
RECETTORI
SVANTAGGI
VARIABILITA’ DI RISPOSTA
INTRASPECIE E INTERSPECIE
QUANTITA’ MATERIALE BIOLOGICO
COSTI
SAGGI DI ATTIVITA’
EFFETTO
SAGGI DI AFFINITA’
RECETTORI
RIDUCE DRASTICAMENTE L’UTILIZZO DI ANIMALI
Coltura delle cellule animali
Il lavoro con cellule o linee cellulari coltivate in vitro e' ormai
entrato nel lavoro quotidiano di quasi tutti i laboratori di
ricerca biologica. Le linee stabilizzate offrono l'enorme
vantaggio di essere una fonte pressoché inesauribile di un
materiale di studio abbondante e omogeneo, dal quale tuttavia
e' anche possibile ottenere nuovi cloni e varianti rispetto alla
linea originale. Inoltre e' possibile conservare le cellule
attraverso il congelamento e recuperarle identiche a se stesse
anche dopo anni. Un altro importante vantaggio e' che l'utilizzo
delle linee cellulari permette in molti casi di utilizzare recettori
umani.
Colture Cellulari
Le cellule che sono mantenute in coltura possono derivare
A) direttamente dalla dissociazione di un tessuto (colture
cellulari primarie) hanno di solito una limitata capacità
replicativa e tendono a diventare "senescenti.
B) da colture precedenti (colture secondarie, terziarie etc.) in
grado di replicarsi indefinitamente in coltura. Le cellule di tali
linee sono derivate da colture primarie di tumori o da colture
primarie non tumorali sulle quali sono state effettuate delle
manipolazioni genetiche, chiamate "immortalizzazione", che
prevedono l'inserimento di specifici geni virali o anche la sola
propagazione per molti passaggi di una coltura primaria.
Colture a termine
La coltura da espianti viene definita coltura a termine per
indicare che le cellule isolate da qualsiasi tessuto animale sono
in grado di compiere un numero finito di divisioni cellulari in
vitro per poi andare incontro a degenerazione e morte.
Colture continue
Sono cellule in cui mutazioni spontanee o indotte hanno
annullato il programma genetico della senescenza (cellule
tumorali).
Il laboratorio per le colture cellulari
incubatore
cappa
centrifuga
microscopio
Terreni per colture
La soluzione di sali, glucosio, amminoacidi e vitamine costituisce
il terreno base.
Questi terreni differiscono tra loro per il contenuto in
amminoacidi, sali e per la concentrazione di glucosio.
La composizione dei mezzi di coltura prevede:
– Sali inorganici (Na+, K+, Mg++, Ca++, Cl-,..)
– Glucosio
– Aminoacidi essenziali
– Vitamine del gruppo B
– Tracce di Fe, Zn, Cu, Se, Mn, Mo
Terreni per colture
MEM
Minimum Essential Medium
DMEM
Dulbecco’s Modification of MEM
RPMI 1640
Roswell Park Memorial Institute
Il sistema tampone utilizzato nei terreni è:
HCO3- / H2CO3
H2CO3 deriva dalla CO2 dell’atmosfera e in parte da quella
prodotta dalle cellule.
H2O + CO2
HCO3- + H3O+
H2CO3
(H2CO3 + H2O)
2H2O + CO2
Per questo motivo le cellule devono essere coltivate in atmosfera
al 5% di CO2 e necessitano pertanto di incubatori con sistema di
controllo dell’atmosfera!
Altri sistemi tampone:
HEPES
N-(2-hydroxyethyl)piperazine-N’-(2-ethanesulfonicacid)
I terreni tamponati con HEPES sono utili quando le cellule
vive devono essere manipolate per tempi lunghi fuori
dall’incubatore. In questo caso la CO2 dell’atmosfera non è
sufficiente a mantenere il pH neutro per cui il terreno si
alcalinizza con conseguente danno per le cellule.
I terreni inoltre sono provvisti dell’indicatore rosso fenolo
6.8-7.0
7.3
> 7.6
pH
Con il proliferare delle cellule il terreno tenderà al giallo a causa
dell’acidificazione prodotta dalla CO2 proveniente dal
metabolismo cellulare.
Il colore viola indica che le cellule non sono metabolicamente
attive o che la regolazione della CO2 è errata.
Il terreno al momento dell’uso viene completato con:
•Glutammina (è un amminoacido labile)
•Antibiotici:
Penicillina/Streptomicina
Gentamicina
•Siero (in genere al 10%):
FBS (Siero Fetale Bovino)
DHS (Siero di Cavallo)
Siero
- Formulazione aspecifica di fattori di crescita
- Siero bovino fetale (FBS), siero bovino
neonatale
(NCS), siero di cavallo (HS)
- Sostegno alla crescita per molti tipi cellulari
- Aumenta la capacità tampone
- Protegge dai danni meccanici
- Facilita l’adesione
Siero
Il siero, prima del suo utilizzo, viene disattivato in stufa a 56°C
per 30min. Con questa procedura viene eliminato il Sistema del
Complemento, che potrebbe interferire con la crescita delle
cellule.
Il sistema del complemento
Il
sistema
del
complemento,
insieme
con
gli
anticorpi,
rappresenta
L'ELEMENTO ESSENZIALE DEI MECCANISMI DI DIFESA UMORALI
CONTRO AGENTI INFETTIVI.
Esso è costituito da una ventina di proteine circolanti e di membrana, capaci di
interagire reciprocamente e con le membrane cellulari.
L'attivazione a cascata delle sue proteine solubili è alla
base di attività biologiche come la lisi cellulare, batterica
o virale.
Il sistema del complemento
Le proteine si introducono nelle membrane degli agenti patogeni provocando
su di esse pori che portano alla lisi. Durante l'attivazione del complemento si
ha inoltre il reclutamento di varie cellule immunocompetenti, quali cellule
fagocitarie (monociti, macrofagi, polinucleati), linfociti B e linfociti T.
Colture cellulari
in sospensione
aderenti
Colture cellulari in sospensione
Le cellule in sospensione normalmente non si attaccano,
crescono sospese nel mezzo di coltura. Le caratteristiche delle
cellule in vitro di solito dipendono dalla loro origine nell'animale
(in vivo). Ad esempio, quasi tutte le cellule in sospensione
derivano dalle cellule del sistema immunitario o dai loro
precursori; in vivo, esse circolano nel torrente sanguigno e non
tendono certo ad attaccarsi ad un substrato (ad es. i linfociti T e
B).
La crescita delle cellule in sospensione può avvenire in
condizioni statiche o in agitazione.
HL-60
Species: Human, Caucasian; Tissue: Peripheral Blood;
Tumor: Leukemia, Promyelocytic
continuous culture, grown in suspension, morphology lymphoblast-lik
Colture cellulari aderenti
L’adesione è un fenomeno attivo che richiede l’interazione dei
recettori di membrana, le integrine, con le proteine adesive,
quali la fibronectina, adsorbite sulla piastra di coltura.
Colture cellulari aderenti
Le cellule aderenti derivano invece da muscoli, fegato, sistema
nervoso, rene ed altri organi e non sono mobili all'interno
dell'organismo. Queste cellule sono divise in base alla forma in 2
grandi classi: le cellule fusiformi, come i fibroblasti, e cellule
poligonali, di tipo epiteliale.
Cellule di carcinoma della cervice (HeLa)
Le HeLa sono state le prime cellule
umane immortalizzate e hanno
rappresentato una grande risorsa per
la ricerca scientifica. Questa linea
cellulare fu isolata e propagata per la
prima volta da George Otto Gey nel
1951 a partire da un lembo di tessuto
di massa tumorale (cancro della
cervice uterina) di una paziente
Henrietta Lacks.
Cellule di AdenoCarcinoma del Colon (CaCo-2)
Colture di cellule aderenti
Le cellule aderenti vengono poste in piastra o in fiasca e
crescono fino ad occupare l’intera superficie disponibile.
Quando le cellule occupano l’intera superficie disponibile
Coltura confluente
A confluenza la crescita si arresta e le cellule devono essere
trasferite in nuove piastre.
Per staccare le cellule dal fondo delle piastre si utilizza una
soluzione di EDTA e tripsina
EDTA
= chela il Ca++ ed il Mg++ indispensabili per l’adesione
Tripsina = degrada le proteine della matrice che mantengono
le cellule aderenti (catalizza il taglio proteolitico con
specificità verso la lisina e l’arginina).
Splitting delle Cellule
1) Accertarsi della confluenza e dello stato delle cellule
2) Rimuovere il terreno (contiene un inibitore della tripsina: alfa-1-antitripsina)
3) Lavare lo strato cellulare con PBS
4) Aggiungere Tripsina/EDTA
5) Mettere il contenitore in incubatore per 2-10 minuti
6) Osservare le cellule al microscopio per accertarsi che siano in
7) Centrifugare
8) Scartare il surnatante e risospendere le cellule in un appropriato
volume di terreno completo
9) Contare le cellule
sospensione
Conta Cellulare
Camera di Burker
Le cellule staccate devono essere riseminate nella giusta
densità (variabile a seconda del tipo di cellula), non crescono
in modo efficiente e vanno incontro a morte se seminate al di
sotto di una certa densità.
Solitamente la crescita esponenziale si ha con valori di
densità compresi tra 104 e 105 cellule per cm2.
Ciclo delle colture cellulari
37°C, 5% CO2,
100% umidità,
3-5 giorni
scongelamento
Lavaggio con PBS
Tripsina / EDTA
semina
conteggio
congelamento
cellule/cm2 x 104
Diagramma di crescita cellulare in vitro
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
arresto della crescita
a confluenza
fase logaritmica di crescita
0
24
48
72
ore
96
120
144
Parametri critici per le colture cellulari
Temperatura
Le cellule possono sopportare l’ipotermia (sono conservate
congelate) ma la loro attività metabolica è notevolmente
disturbata.
Non possono sopportare l’ipertermia (anche piccoli aumenti di
temperatura per brevi periodi possono far morire le cellule).
Una temperatura di 43°C per pochi minuti provoca la morte per
apoptosi.
Dewar per Criocongelazione
Due
prove
permettono
di
misurare
l’influenza
temperatura sullo sviluppo delle cellule:
- La valutazione dell’attività metabolica mitocondriale
Attività metabolica a differenti
temperature di incubazione
Attività metabolica
mitocondriale
5
36 °C
37 °C
38 °C
4
3
2
1
0
10000
15000
n° cellule
20000
della
- La valutazione della quantità di proteine sintetizzate dalla
popolazione delle cellule.
sintesi proteica (%)
300
200
100
0
34
35
36
37
38
39
Temperatura (°C)
40
41
42
Umidità relativa (RH %)
In un incubatore a CO2 il paramentro di temperatura è
direttamente collegato con l’umidità relativa (RH %)
L’energia fornita dall’incubatore serve sia a mantenere la
temperatura che ad evaporare l’acqua dall’apposito vassoio per
portare il livello di umidità relativa alla giusta percentuale.
L’umidità relativa RH è un parametro che è portato ad un
livello elevato senza necessariamente essere controllato.
L’obiettivo è di limitare l’evaporazione dell’acqua contenuta nei
terreni di coltura per non provocare un aumento della pressione
osmotica.
La difficoltà maggiore consiste nel raggiungere un livello molto
elevato di RH nella camera (RH >98%) evitando la
condensazione sulle pareti o sugli oggetti contenuti
nell’incubatore. Le goccioline di condensazione costituirebbero
un ambiente ideale per la contaminazione e lo sviluppo di
organismi dispersi nell’aria che entrano durante l’apertura
dell’incubatore.
Il pH
E’ molto importante il sistema tampone che interviene verso la
fine del periodo di coltura e cioè quando il metabolismo
cellulare ha prodotto H+.
CO2
La pressione parziale di CO2 usata nella coltura delle cellule
corrisponde alla pCO2 misurata all’interno dei tessuti (35-45
mmHg). In questo modo l’incubatore riproduce rigorosamente
le naturali condizioni di sviluppo delle cellule.
Incubatore a CO2
L’incubatore a CO2 è un’attrezzatura di precisione per il mantenimento delle
cellule in coltura; è costituito da una camera chiusa al cui interno sono
ricreate, nei limiti del possibile, le condizioni fisiologiche dei tessuti animali in
cui le cellule vivevano prima dell’isolamento.
I parametri che vengono tenuti sotto controllo sono:
Temperatura: il controllo della temperatura (che deve essere mantenuta
costante a 37°C) viene assicurato da un termostato che agisce su una
resistenza; un sistema di ventole per la circolazione forzata dell’aria
garantisce che la temperatura sia uniforme in tutti i punti della camera.
Concentrazione di CO2: il livello di anidride carbonica può variare dallo
0,03% al 40%; per esperimenti in normossia, l’aria atmosferica è miscelata
con il 5% di CO2.
pH: deve essere di 7,4.
Umidità: l’ambiente deve essere saturo; allo scopo nell’incubatore è presente
un vassoio di umidificazione contenente acqua.
DETERMINAZIONE DELLA CITOTOSSICITA’
CITOTOSSICITÀ:
effetto di un agente di tipo chimico (una molecola), fisico
(temperatura, radiazione o onda elettromagnetica) o biologico
(una cellula del sistema immunitario) in grado di indurre danno
ad una cellula.
L'agente che induce tale danno viene spesso definito citotossina.
Saggio di Citotossicità
AGENTE
CITOTOSSICO
EFFETTO
TOSSICO
CAMBIAMENTO DELLA
MORFOLOGIA
CAMBIAMENTO DELLA
FUNZIONALITA’
I test di citotossicità rappresentano un “metodo di valutazione “ dei danni
biologici provocati dalle sostanze.
SAGGI DI VITALITA’ CELLULARE
Test di vitalità cellulare
Saggio con il Blu Tripano
Il Blu Tripano è un colorante utilizzato nel test di determinazione
della vitalità cellulare. Questo colorante permette di discriminare
tra le cellule vitali e quelle morte in quanto è assunto solo dalle
cellule morte.
Saggio con BLU TRIPANO
Aspirare il terreno
Lavare con PBS
Conta
cellulare
Aggiungere Risospendere in PBS
Tripsina/EDTA C = 2-5 x 105 cell/mL
0,5 mL Blu tripano
+
0,3 mL PBS
+
0,2 mL sospensione
cellulare
Conta Cellulare
Dosaggio MTT
bromuro di 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil tetrazolio
Il saggio MTT è un saggio colorimetrico standard per la misurazione
dell'attività degli enzimi che riducono l‘ MTT a formazano, conferendo
alla sostanza un colore blu/violaceo. L'enzima mitocondriale succinato
deidrogenasi (reduttasi), è attivo infatti soltanto nelle cellule vive, e la sua
funzione consiste nel tagliare l'anello di tetrazolio dell‘ MTT (sostanza di
colore giallo) con la formazione, di conseguenza, di formazano (un sale
blu).
MTT
(giallo)
Formazano
(azzurro)
Tale reazione è valutata e misurata mediante la lettura spettrofotometrica
del campione, alla lunghezza d'onda di 570 nm. Ciò accade
prevalentemente nei mitocondri; questo saggio può essere utilizzato per
determinare la citotossicità di farmaci o altri tipi di sostanze chimicamente
attive e potenzialmente tossiche.
Dosaggio MTT
Prevenzione della contaminazione
Sono possibili differenti tipi di contaminazione
I principali tipi di contaminanti microbici :
Batteri e funghi
Micoplasma
Virus
La contaminazione può avvenire:
Errore dell’operatore
Terreni contaminati
Cappa biologica non funzionante
Incubatore contaminato
Conservazione in azoto liquido contaminato
Prevenzione della contaminazione
Precauzioni per la prevenzione delle contaminazioni
1) I terreni e le soluzioni che si usano devono essere tutti sterili
2) Aggiungere penicillina-streptomicina per scongiurare il pericolo di
contaminazioni da batteri; anfotericina B (se non tossica per le cellule)
contro i miceti.
3) Destinare il laboratorio solo alle colture cellulari
4) Operare sempre sotto cappa a flusso laminare
5) Utilizzare solo materiale sterile (di vetro o di plastica)
6) Utilizzare sempre pipettatori elettrici
7) Pulire bene la cappa a inizio e fine lavoro
8) Controllare periodicamente i filtri della cappa
9) Mantenere con attenzione ben pulito l’incubatore a 37°C
Il laboratorio per le colture cellulari
capp
a
centrifu
ga
incubato
re
microscop
io
Cappa a flusso laminare
La maggior parte delle attività di laboratorio, quali la
miscelazione, la frantumazione, l’agitazione, lo scuotimento di
materiale infetto possono inavvertitamente generare aerosol
pericolosi; essendo gli aerosol importanti fonti di infezione, si
deve cercare di ridurne la formazione e dispersione al minimo.
E’ buona norma eseguire queste operazioni in una cappa di
sicurezza biologica di tipo appropriato.
Le cappe agiscono come barriere per minimizzare il rischio di
infezioni per via aerea impedendo la fuoriuscita di questi
aerosol nell’ambiente di laboratorio e la loro inalazione da parte
dei lavoratori.
Cappa a flusso laminare
Cappa a flusso laminare
Esistono tre tipi di cappe di sicurezza biologica: classe I, II, e
III. La loro efficacia dipende dal flusso dell’aria, dalla capacità
di contenimento, dall’integrità dei filtri HEPA (high efficiency
particulate airfilter) e, nel caso delle cappe I e II, dalla loro
posizione nella stanza in relazione alle correnti di aria e ai
movimenti del personale (vanno poste lontano dalle zone di
passaggio e da correnti d’aria provenienti da porte, finestre e
dall’impianto di aerazione).
Cappa di sicurezza biologica di classe II a
flusso laminare verticale
Cappa a flusso laminare
Una cappa di sicurezza biologica classe II è una cappa
ventilata
aperta
frontalmente
progettata
per la
protezione dell’operatore, dei prodotti al suo interno e
dell’ambiente circostante. E’ caratterizzata da un
flusso d’aria in ingresso e con filtrazione sia dell’aria
aspirata sia di quella espulsa: il flusso laminare,
proveniente dal sovrastante filtro HEPA (C), scende
perpendicolarmente al piano di lavoro evitando di
investire l’operatore, l’aria espulsa deve essere filtrata
da un secondo filtro HEPA (E) e, se ricircolata nello
stesso locale, da un filtro supplementare a carbone
attivo posto a valle del filtro HEPA, per trattenere
eventuali frazioni gassose
Microscopio Ottico
Il microscopio ottico tradizionale è il più
semplice. Per mezzo di lenti ingrandisce
l'immagine del campione, illuminato con
luce nell'intervallo spettrale del visibile. Può
essere semplice (un solo sistema di lenti o
addirittura una sola lente) o composto
(almeno due sistemi, oculare ed obiettivo), e
l'illuminazione può raggiungere il campione
da dietro, attraversandolo (luce trasmessa), o
esserne riflessa (luce riflessa). Il microscopio
ottico permette di avere immagini di soggetti
dimensionalmente collocati all'incirca tra il
millimetro ed il micrometro, anche di esseri
viventi.
Autoclave per sterilizzazione
L`autoclave, uno strumento estremamente importante nella pratica
microbiologica, assicura l'uccisione dei microrganismi, incluse le endospore,
mediante l'utilizzazione di calore umido.
La sterilizzazione mediante calore prevede un trattamento che provoca la
completa distruzione di tutti gli organismi e poiché le endospore sono
praticamente ubiquitarie, le procedure di sterilizzazione vengono
opportunamente programmate per la loro eliminazione. Per ottenere questi
risultati è necessario raggiungere temperature superiori al punto di ebollizione
dell'acqua, e ciò viene ottenuto immettendo vapore saturo sotto pressione nella
camera a chiusura ermetica dell'autoclave.
Autoclave per sterilizzazione
Il principio è quello sfruttato dalle normali pentole a
pressione, che infatti possono venire utilizzate con
risultati soddisfacenti per sterilizzare piccole
quantità di materiale. La pressione usualmente
utilizzata per la sterilizzazione in autoclave è di 1.1
kg/cm2 (corrispondente a 1 atm di sovrapressione),
che permette di raggiungere una temperatura di
121ºC; a questa temperatura il tempo di
trattamento è generalmente di 10-15 minuti. Se è
necessario sterilizzare oggetti di grandi dimensioni,
bisogna tenere presente che la diffusione del calore
al loro interno sarà piuttosto lenta, e il tempo di
sterilizzazione deve essere più lungo.
Stufe per sterilizzazione
La sterilizzazione in stufa
avviane mediante calore secco.
In
stufa
possono
essere
disattivati i sieri di coltura (56°
C per 30 min) oppure
sterilizzato il materiale in vetro
(pipette, bottiglie, matracci,
beute, etc) (160° C per 4 h).
