Colture cellulari

COLTURE CELLULARI
UTILIZZO DELLE COLTURE
CELLULARI
• Elettrofisiologia
• Studio dei recettori
• Modelli di morte cellulare
• Farmaci
CELLULE CONNETTIVALI
Fibroblasti
Osteociti
Condrociti
Adipociti
CELLULE EPITELIALI
Epatiche
Alveolari
Bronchiali
Cutanee
Vescicali
Renali
CELLULE MUSCOLARI
Miocardiociti
Cellule muscolari scheletriche
Cellule muscolari lisce
CELLULE VARIE
Endocrine
Tumorali
Endoteliali
CELLULE NERVOSE
Glia
Neuroni
Tutte le cellule usate nelle colture eccetto i neuroni sono non interamente differenziate
FATTORI SPERIMENTALI CHE FAVORISCONO:
La proliferazione:
bassa densità cellulare
bassa concentrazione di Ca++
fattori di crescita
La differenziazione:
alta densità cellulare
alta concentrazione di Ca++
ormoni
fattori di differenziamento (NGF)
in genere le condizioni di coltura usate comunemente favoriscono
la proliferazione anziché la differenziazione
TESSUTO EMBRIONALE
alta capacità
proliferativa
diverse dalle
cellule adulte
TESSUTO ADULTO
ridotta capacità
proliferativa
simili alle
cellule adulte
COLTURE PRIMARIE (appena isolate)
linee cellulari o sottocolture
in seguito a replicazione ripetuta
meccanismi?
COLTURA CONTINUA O IMMORTALE
(più facili da coltivare, instabili
geneticamente, possono essere diverse
dalle cellule di origine)
COLTURE NEOPLASTICHE
(elevata capacità di riproduzione, molto simili
alle cellule da cui originano)
MEZZI DI COLTURA
a base di siero
favoriscono la
sopravvivenza cellulare
privi di siero
favoriscono la
crescita di tipi cellulari
specifici
la composizione dei mezzi di coltura può essere variata in base
alle particolari caratteristiche che si richiedono alla coltura stessa
CARATTERISTICHE DEL SIERO
Componenti del siero
Funzioni note o presunte
Albumina
Trasporto molecole biologiche
Fibronectina
Adesione cellulare
Alfa-2-macroglobulina
Inibizione tripsina
Transferrina
Trasporto ferro
Ormoni
Controllo di funzioni metaboliche
Fattori di crescita
Insulin-like growth factors (IGF), platlet derived growth factor
(PDGF), Somatomedina, Epidermal growth factor (EGF),
Endothelial growth factor (EGF), fibroblast growth factor (FGF),ecc.
Lipidi e acidi grassi, Minerali, Metaboliti, Polipeptidi
ADESIONE CELLULARE
è necessario provocarla in tutti quei casi (numerosi)
in cui le cellule coltivate non crescono in sospensione
plastiche speciali
fattori di adesione
FATTORI DI ADESIONE CELLULARE
PIU’ COMUNI
• Polilisina
• Collagene
• Fibronectina
PREPARAZIONE DI COLTURE
PRELIEVO TESSUTO E DIGESTIONE
COLTURA PRIMARIA
INCUBAZIONE DELLA COLTURA
LAVAGGIO DEGLI ENZIMI DI DIGESTIONE
DISTRIBUZIONE SU PIASTRE E CRESCITA
i protocolli di generazione delle colture cellulari sono molto riproducibili
le cellule in crescita hanno bisogno di un cambio di medium ogni 4-5- giorni
PLASTICHE PER COLTURE CELLULARI
CONTAMINAZIONE
batterica
coltura torbida e variazioni pH
virale
alterazioni morfologiche
micoplasma
test mirati
CONSERVAZIONE
si deve essere assolutamente certi del tipo di cellula su
cui si sta lavorando
banche cellulari
congelamento in azoto liquido secondo protocolli definiti
Conservazione di linee cellulari
Dove trovare le linee cellulari
•Produzione in laboratorio
•Banche cellule–European Collection of Cell Culture
www.ecacc.org.uk
–AmericanTissueCultureCentre (USA)
www.atcc.org
–National Cell Culture Center (USA)
www.nccc.com
–German Collection of Microorganism and Cell Culture
www.dsmz.de
–IZS Centro Substrati Cellulari
www.bs.izs.it
–IST Servizio Biotecnologie
www.biotech.ist.unige.it
CONTROLLO VITALITA’ CELLULARE
• Coloranti
• Respirazione cellulare
• Incorporazione timidina marcata
• Incorporazione leucina marcata
la fluorescina si mantiene solo nelle cellule intatte
cellule piramidali di ippocampo
CONTROLLO SOPRAVVIVENZA
agente chimico o farmaco
a breve termine
clonaggio in monostrato
clonaggio in soft agar
a medio termine
riduzione capacità riproduttiva
isola quelle cellule che crescono
in sospensione (crescita rapida)
Elutriator
l’elutriator separa le cellule sulla base del diverso gradiente di sedimentazione
è un metodo rapido, standardizzato e riproducibile
Resistenza elettrica
Le cellule sono dei cattivi conduttori di elettricità e oppongono
resistenza al passaggio della corrente elettrica.
Il contatore Coulter è una apparecchiatura in cui una sospensione
cellulare viene fatta passare attraverso una sottilissima fessura
su entrambi i lati della quale sono posti degli elettrodi. Una
cellula che si frapponga tra i due elettrodi impedisce il
passaggio della corrente e determina una caduta di voltaggio
che viene registrata sotto forma di un impulso la cui altezza è
proporzionale al volume della cellula.
Contando gli impulsi e la loro forma, tale sistema consente di
determinare il numero e le dimensioni delle cellule presenti in
una data sospensione. Non si distinguono le cellule vive da
quella morte e i valori sono quindi riferiti a conte totali.
Citometria a flusso
Procedimento analogo al precedente in cui le cellule sono marcate
con coloranti fluorescenti e si misurano assorbimento di luce e
fluorescenza, con l’ottenimento di istogrammi che indicano le
varie popolazioni cellulari
Per effettuare il conteggio:
dopo aver pulito la camera, montata
correttamente, depositato un dato
volume di cellule, al microscopio
si contano le cellule presenti nei
quadrati delimitati da una doppia
barra