Prof. Maria Nicola GADALETA DISPENSA N. 3 T

Prof. Maria Nicola GADALETA
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Facoltà di Scienze Biotecnologiche
Corso di Laurea in
Biotecnologie Sanitarie e Farmaceutiche
Biochimica e Biotecnologie Biochimiche
DISPENSA N. 3 T
ELETTROFORESI
Tecnica separativa che permette di separare molecole cariche, o
rese tali, quando vengono fatte migrare in un mezzo fluido, sotto
l’influsso di un campo elettrico
In biochimica è usata per separare:
Aminoacidi
Peptidi
Proteine
Nucleotidi
DNA, RNA
- in fase libera (o frontale): le particelle cariche si muovono
attraverso una soluzione (poco attrito, elevata velocità di
migrazione)
- su supporto (o zonale): le particelle si muovono attraverso un
mezzo poroso (agarosio, poliacrilammide, carta)
M.N. Gadaleta
Fattori che influenzano la migrazione di una particella carica in
un campo elettrico
1.Differenza di potenziale applicata agli elettrodi
I (intensità di corrente, Ampére)
R (resistenza, ohm Ω)
V (voltaggio o d.d.p., volt)
I= V/R
Applicando un determinato voltaggio V,
I dipenderà da R
(legge di Ohm)
E= gradiente di potenziale =
V
(d.d.p in volt)
d
(distanza tra gli elettrodi in cm)
La velocità con cui la particella si muove è data da questa relazione
v =
E x z
f
(cm/sec)
E= gradiente di potenziale
z= C/M = (carica/massa) densità di carica elettrica della
particella
f= attrito frizionale
f= 6πηr (η= viscosità del mezzo)
(r= raggio delle particelle)
µ= mobilità elettroforetica = velocità di una particella carica che si muove
in un campo elettrico unitario
v
µ =
(cm/sec x cm/volt) (cm2 sec-1 volt-1)
E
µ è + quando la particella migra verso il CATODO (-)
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Per convenzione: µ è - quando la particella migra verso l’ ANODO (+)
Fattori che influenzano la migrazione di una particella
carica in un campo elettrico
2.Il campione
a) CARICA La velocità di migrazione aumenta all’aumentare della carica netta (legata al pH)
b) DIMENSIONI (r) La velocità di migrazione diminuisce all’aumentare del peso molecolare
della molecola carica
c) FORMA Molecole di dimensioni simili ma di forma diversa (es. proteine fibrose e globulari)
hanno differenti velocità di migrazione (effetto forze frizionali ed elettrostatiche)
3.Soluzione tampone
a) pH della soluzione
Acidi e basi forti
Né carica né segno sono influenzati
Acidi e basi deboli
La carica è fortemente influenzata, il segno no
Molecole anfotere
Sia la carica che il segno sono influenzati
Se pH> pI la carica netta è negativa (anioni)
Se pH< pI la carica netta è positiva (cationi)
b) viscosità del mezzo (η)
2.b) e 3.b) sono compresi in f (= 6πηr )
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Fattori che influenzano la migrazione di una particella
carica in un campo elettrico
Nell’elettroforesi zonale si aggiungono i seguenti fattori:
4. Il decorso delle particelle cariche è tortuoso per cui la distanza apparente
percorsa è in realtà minore di quella effettivamente percorsa
5. La forza ionica del tampone
forza ionica (µ
µ)
= ½
forza ionica
Σ cz2
c= concentrazione molare dello ione
z= valenza o carica dello ione
migrazione del campione
e viceversa
6. Effetto Joule: quando una corrente elettrica passa attraverso una colonna di
elettrolita si ha produzione di calore uniforme. La dispersione di calore è
maggiore in periferia dove il tampone si concentra, rallentando la velocità di
migrazione del campione.
7. Elettroendosmosi (o elettro-osmosi): il fenomeno è dovuto alla presenza di
gruppi carichi sulla superfice del mezzo di supporto (carta
gruppi carbossilici,
agarosio
gruppi solfato,capillari di vetro
silanoli).Quando viene applicato un
campo elettrico, i cationi dell’elettrolita vicino alla parete migrano verso il catodo
trascinando con se la soluzione elettrolita.
ACCELERA MOVIMENTO DEI CATIONI (+), RITARDA QUELLO DEGLI ANIONI (-)
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Elettroendosmosi
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ELETTROFORESI FRONTALE
Vantaggi: la mobilità elettroforetica dipende da pochi parametri misurabili
Svantaggi: è lenta, da’ solo due componenti puri;
possibili artefatti per la presenza di correnti di diffusione
Uso: non viene praticamente più usata se non per determinare il pH
isoelettrico di proteine o la mobilità elettroforetica assoluta
-
+
-
+
Soluz. tampone
C
B+C
A+B+C
A
A+B
A+B+C
Miscela proteica
Dopo il passaggio di corrente si formano dei fronti (ASCENDENTI E
DISCENDENTI) ma non si hanno i componenti singoli separati.
Solo il componente di massima e di minima mobilità possono essere isolati
puri.Questi fronti sono evidenziati tramite misurazione dell’indice di
rifrazione lungo i bracci del tubo ad U.
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ELETTROFORESI ZONALE
Vantaggi: rapidità, più alto potere di risoluzione, particelle raccolte in zone
di componenti singoli, migliore separazione. Preparativa oltre che analitica
Svantaggi: non sono possibili misure di mobilità assoluta per l’esistenza di
parametri non misurabili
Permette la separazione dei componenti di una miscela in ZONE o BANDE
poiché:
1) per effetto del supporto solido altri fattori, come un effetto
setaccio, esaltano la differenza di mobilità anche tra particelle con
densità di carica uguale. Si ha FILTRAZIONE MOLECOLARE fenomeno
dovuto al reticolo tridimensionale delle catene che costituiscono i gel
(agar, amido, poliacrilamide).
Le sostanze ad alto peso molecolare sono ostacolate nella migrazione più
di quelle a peso molecolare basso.
2) il campione viene depositato tutto in unica zona del supporto e a
partire da quella zona avviene la migrazione.
Elettroforesi zonale
orizzontale
verticale (in genere su gel)
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Elettroforesi verticale
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Elettroforesi orizzontale
Supporti solidi più usati in elettroforesi zonale:
Adsorbimento-elettroendosmosi
Economico- peptidi, proteine e aminoacidi
CARTA
ACETATO DI
CELLULOSA
GEL
Sottili, uniformi, a struttura microscopica omogenea.
Adsorbimento scarso-immunoelettroforesi.
La striscia può essere colorata e resa trasparente con trattamenti
particolari. Applicata in chimica clinica per proteine ematiche
(glicoproteine, lipoproteine, emoglobina)
Colloidi semisolidi, insolubili in acqua, idrofili che si preparano
subito prima dell’uso a partire da polveri di AMIDO, AGAR,
ACRILAMIDE
La deposizione del campione viene fatta o al centro (se non si conosce la
carica delle molecole da separare) o ad una estremità del supporto si sa
che a quel pH ci sono molecole cariche positivamente o negativamente).
origine
Lys+ Arg+ His+
(Ala+Ser)
Glu-
+
pH= 6.5
+
pH= 2.1
Asp-
origine
Lys Arg His
Ala
Ser
Glu
Asp
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Il setaccio molecolare costituito dal GEL coopera nella separazione dei
composti ionici ad alto peso molecolare dotate di carica simile ma diversi
per grandezza e forma
AMIDO usato soprattutto per l’analisi dei quadri isoenzimatici
(ZIMOGRAMMI), per la facilità di applicazione di test istochimici dopo
l’elettroforesi. Si preparano prima scaldando e poi raffreddando una
sospensione di amido parzialmente idrolizzato. Le catene ramificate
dell’amilopectina si intrecciano tra loro formando un gel semirigido.
AGAR miscela polverulenta, atossica, di due polimeri del galattosio:
agarosio+agaropectina. Ha diametro dei pori abbastanza elevato,
presenta notevole elettroendosmosi. E’ molto adatto alla colorazione dopo
la corsa elettroforetica. Per la scarsa resistenza alla diffusione è un
ottimo supporto per la separazione e rivelazione di proteine antigeniche
da parte di anticorpi (immunoelettroforesi).
AGAROSIO purificato. Molto usato per la separazione di proteine ad alto
peso molecolare e di acidi nucleici. Non presenta elettroendosmosi.
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POLIACRILAMIDE Polimero sintetico dovuto alla
polimerizzazione tra acrilamide e bisacrilamide in
catalizzatore e iniziatore
H
_
H
O
S2O82- (persolfato)
=
H2C=C-C-N-CH2-N-C-C=CH2
O
Tetrametilendiamina
(TEMED) catalizzatore
H
_
+
=
acrilamide
=
H2C=C-C-NH2
H
_
_
_
H
O Metilen bisacrilamide
Iniziatore
2SO4-· (radicale solfato libero)
catene lineari (acrilamide)
ponti crociati (bisacrilamide)
(reticolo tridimensionale)
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reazione
presenza
di
di
GEL DI POLIACRILAMIDE
La porosità del gel di poliacrilamide dipende dalla quantità totale e
dal rapporto acrilamide/bisacrilamide, che può essere variato a
piacere
I gel di poliacrilamide sono molto versatili, altamente riproducibili e la
loro porosità può essere esattamente prevista e scelta in base ai pesi
molecolari delle molecole da separare così da aumentare il potere di
risoluzione della tecnica elettroforetica(potere di risoluzione=capacità
di separare molecole con la più piccola differenza di peso molecolare).
Si usano per proteine ed acidi nucleici
I gel di poliacrilamide hanno trascurabile tendenza all’adsorbimento
Mancanza di elettroendosmosi
Facilità nell’analisi dei risultati sia direttamente (non assorbono
nell’U.V.), sia dopo colorazione (Comassie, Nitrato d’argento)
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SDS - PAGE
GEL ELETTROFORESI SU POLIACRILAMIDE molto importante per la
determinazione del peso molecolare (P.M.) di proteine ed acidi nucleici.
è importante che le molecole abbiano tutte esattamente lo stesso
rapporto carica/massa
migrazione in base al solo P.M.
ciò è normale per i frammenti di acidi nucleici in cui il numero di
cariche negative dovute ai gruppi fosfato è esattamente
proporzionale alla lunghezza
Le proteine, invece, devono essere trattate con:
1) urea - dissocia le subunità;
2) mercaptoetanolo - rompe i ponti di S-S, separando le
catene
3) SDS (sodio dodecil solfato, detergente). Denatura
completamente le proteine inserendosi con la porzione apolare
verso l’interno e con la porzione carica negativamente all’esterno.
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Le proteine risultano avvolte in un guscio di cariche negative
uniforme. Poiché la quantità di SDS legato è in un rapporto 1:2 (1
SDS/2AA) la mobilità della stessa dipenderà dalla lunghezza della
catena polipeptidica e quindi dal peso molecolare mentre il rapporto
carica/massa sarà uguale per tutte.
M.N. Gadaleta
M.N. Gadaleta
• La mobilità elettroforetica m=K/r
• K=Z/6peLa discriminante tra le particelle
da separare sarà soltanto r
In queste condizioni esiste una correlazione inversamente
proporzionale tra la migrazione (cm) e il logaritmo del peso molecolare
della proteina (o acido nucleico)
Si può determinare il P.M. delle
proteine esaminate tramite una
retta di taratura che si costruisce
facendo migrare sullo stesso gel
una miscela di molecole a P.M. noto
(MARKER).
da: Nelson & Cox (II ed.)
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ELETTROFORESI IN CONDIZIONI NATIVE
Utilizzata ogni qualvolta è importante conservare l’attività funzionale
delle Proteine (l’SDS-PAGE è un’ elettroforesi in condizioni
denaturanti!)
Es: separazione degli isoenzimi della lattico deidrogenasi LDH del
siero umano
Esistono 5 isoenzimi le cui differenze nella struttura delle subunità
produce una diversa carica elettrica (stesso peso molecolare)
Questa differenza di carica consente la separazione dei 5 isoenzimi
della LDH quando si esegue l’elettroforesi
Dopo la corsa elettroforetica gli isoenzimi presenti nel gel sono
evidenziati per mezzo delle reazioni sotto riportate:
Lattato + NAD+
NADH + NBT
LDH
PMS
Piruvato + NADH
NAD+ + NB-Formazano
Il colore Blue di Formazano si sviluppa per ogni banda di isoenzimi e
può essere interpretato visivamente o quantizzato con densitometro.
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da: Baynes
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ISOELETTROFOCALIZZAZIONE
ELETTROFORESI a fronte mobile, usata nella separazione di composti
anfoteri, separati in un campo elettrico lungo il quale c’è un ∆E e un ∆pH.
Regione anodica acida, regione catodica basica, il ∆pH è mantenuto stabile.
Gli estremi di pH sono scelti in modo da comprendere i pI di tutti i campioni
da separare. I composti anfoteri vengono focalizzati in sottili bande
stazionarie. ELEVATO POTERE RISOLUTIVO. Applicazione: Separazione
Anodo
isoenzimi (∆pI 0.01U pH).
polo +
(acido)
Campione applicato ad un pH< pI
A+ B+ C+
Cationi +
A+
Componenti migranti come cationi
B+
C+
Componenti focalizzati
dipolari al pH= al loro pI
come
ioni
A
B
C
Ioni dipolari
AComponenti migranti come anioni
B-
Anioni -
CCampione applicato ad un pH> pI
A- B- CCatodo
(alcalino)
polo -
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ELETTROFORESI
BIDIMENSIONALE
da: Nelson & Cox (II ed.)
M.N. Gadaleta
POTERE RISOLUTIVO DEI DIFFERENTI TIPI DI ELETTROFORESI
Es. Separazione componenti proteici del sangue
N° componenti separabili
Tipo di elettroforesi
5-6
~ 15
~ 40
> 100
in fase libera
zonale
isoelettrofocalizzazione
bidimensionale
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