Elettroforesi

Elettroforesi
Separazione differenziata di molecole cariche (aminoacidi, peptidi, proteine,
Acidi nucleici, ecc) sottoposte a un campo elelttrico
Principio:
Migrazione di particelle cariche sotto l’azione di un campo elettrico.
Tecnica sia ANALITICA che PREPARATIVA.
Forza elettrica : Fel = q · E
Forza frizionale : Ffr = f ·v
(f = 6 r )
Quando le forze si bilanciano:
q ·E = f ·v

q
v= —·E
f
mobilità elettroforetica :
v
q
 = — = —
E
f
Applicando un campo elettrico si può avere effetto Joule:
V=RI
W = R I2

Operare a I costante

Dissipare l’eccesso di calore
Acidi nucleici
ELETTROFORESI SU SUPPORTO
su carta
su gel
Gel di agarosio – Elettroforesi orizzontale
Formazione di un gel di poliacrilammide
CH2
• Acrilamide, bisacrilamide  monomeri
• Ione perossodisolfato  iniziatore
• TEMED  catalizzatore
• L’ossigeno è un radicale, quindi interferisce con la polimerizzazione
• La mobilità elettrofoertica risulta inferiore a
quella che ci si aspettera
• Effetto setaccio del supporto di
separazione
• Grafico di Ferguson:
– Mobilità elettroforetica in funzione della
concentrazione del gel
Effetto “setaccio” in un gel uniforme
MOBILITA’ ELETTROFORETICA ED EFFETTO “SETACCIO MOLECOLARE”
Se q  L,  in
assenza di gel e’
pressoché
indipendente dalle
dimensioni
molecolari
Migrazione
di proteine
e DNA in
gel di varia
porosita’
Visualizzazione del DNA: etidio bromuro
luce UV
Poiché il DNA sottoposto ad un campo elettrico migra ad una velocità
proporzionale all’inverso del log10 del peso molecolare, facendo
migrare il campione in esame insieme ad uno standard di pesi
molecolari di dimensione nota è possibile estrapolare il peso
molecolare del campione ignoto
1
-20
-10
-7.0
pozzetti
2
3
x
4
5
6
7
8
distanza in cm dai pozzetti
Utilizzando una serie di frammenti di DNA a peso molecolare noto è possibile costruire
una curva di taratura. Ogni banda corrisponde ad un punto le cui coordinate sono
costituite, in ascissa, dalla distanza in cm dal pozzetto e, in ordinata, dal Log10 del peso
molecolare. Congiungendo tutti i punti, riportati su un grafico semi-logarittimico, si
dovrebbe formare una linea approssimativamente retta, da cui, nota la distanza dal
pozzetto percorsa da una banda incognita, è possibile estrapolare il peso molecolare
approssimativo
X=log10 0,54
20
10
7
5
4
3
2
1,6
1
0.7
0,5
1.30
1.00
0.80
0.69
0.60
0.47
0.30
0.20
0.00
-0.15
-0.3
100,54= Kb 3,46
X
0
1
2
3
4
Distanza in cm dal pozzetto
5
6
SDS-PAGE
(Sodium DodecylSulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis)
Permette la separazione delle proteine solo in base al peso molecolare
SDS-PAGE : elettroforesi discontinua
Le tre specie ioniche aggiustano la loro concentrazione in modo che [Cl –] >
[proteina-SDS] > [glicinato].
Poiché la quantità di proteina-SDS e’ molto piccola, questa specie si concentra
in una banda molto stretta fra la banda del glicinato e quella del Cl –.
Colorazione con Coomassie
Colorazione con nitrato di Ag
Si possono effettuare valutazioni
quantitative delle bande proteiche
col densitometro: misurazione della
luce trasmessa quando un raggio luminoso
è fatto passare attraverso il gel colorato.
Si hanno picchi di assorbimento di cui si può
calcolare l’area che è proporzionale
alla quantità di proteina
Applicazioni della SDS-PAGE
•
•
•
•
Purezza del campione
Determinazione del PM
Western blot
Purificazione della proteina
Applicazioni dell’SDS-PAGE
Determinazione del PM
Western blotting
Elettroforesi delle proteine plasmatiche