Interferenti endocrini: valutazione e prevenzione dei possibili rischi per la salute umana
Roma, ISS 15 ottobre 2008
Esposizione in utero a di-(2-etilesil) ftalato (DEHP)
e marcatori di effetti epatici nel topo CD1
Stefano LORENZETTI 1
Roberta Tassinari 1, Gabriele Moracci 1, Vincenzo Lagatta 1, Antonella D’Ambrosio 1
Daniele Marcoccia 1, Marco Salvatore 2, Domenica Taruscio 2, Francesca MARANGHI 1
Istituto Superiore di Sanità
Dipartimento Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare
Reparto di Tossicologia Alimentare e Veterinaria 1
Centro Nazionale Malattie Rare 2
Di-(2-etilesil) ftalato (DEHP)
FTALATI
DEHP - CAS no. 117-81-
Esteri dell’acido
ftalico usati come
“plasticizzanti”
7
“makes plastic
fantastic” (?)
¾ contaminante ubiquitario usato per rendere flessibili le plastiche a base di PVC, in
cui è presente fino al 40% (in peso)
¾ utilizzato nella produzione di materiali di imballaggio (pellicole trasparenti
incluse) e da costruzione (vernici incluse); nei giocattoli per l’infanzia;
nei dispositivi medici (sacche per trasfusioni e dialisi; cateteri; tubi e sondini
gastrici, respiratori, etc.); nei prodotti per la cura del corpo; etc…
¾ costituisce circa il 50% del totale degli ftalati prodotti e utilizzati
(≈ 400.000 tons nel 2004)
¾ in via di sostituzione con altri composti meno tossici, quali il di-isononil ftalato
(DINP) e il di-isodecil ftalato (DIDP)
¾ legato non covalentemente al PVC → rilasciato nei fluidi biologici e negli
alimenti (p.es. latte e formaggi) con cui viene a contatto
¾ dal 1999 l’Unione Europea ne ha bandito l’uso nei giocattoli per i bambini
DEHP: effetti biologici su animali adulti
¾ Interferente endocrino con effetti sul sistema riproduttivo (anti-androgeno ?)
¾ Embriotossico e teratogeno (a seguito di esposizione in gravidanza)
¾ Cancerogeno (fegato, rene)
¾ Induttore della proliferazione dei perossisomi
(meccanismo proposto per la cancerogenesi, che però non èevidenziato
nell’uomo)
¾ Interagisce con i recettori nucleari/fattori di trascrizione della famiglia dei
PPAR (peroxisome proliferator- activated receptor : PPAR-α, PPAR-γ)
¾ Interagisce con altri recettori nucleari (p.es. Pregnane X Receptor, PXR)
¾ I recettori nucleari/fattori di trascrizione PPAR regolano il metabolismo dei
lipidi e dei carboidrati sia nel tessuto adiposo che nel fegato
DEHP → attivazione PPAR-α →
induzione della proliferazione dei perossisomi → cancerogenesi epatica
OBIETTIVI DELLO STUDIO
Studiare gli effetti a lungo termine del DEHP
sul metabolismo energetico
a seguito di esposizione in utero
durante la fase di organogenesi ed istogenesi del fegato
Verificare se l’esposizione in utero a DEHP rende i roditori suscettibili ad
alterazioni metaboliche predisponenti l’insorgenza di tumori epatici
IPOTESI:
neonati da parti pre-termine – Reynolds, 2004 & McLaughlin, 2006 –
ed esposizione a contaminanti ambientali in utero – Latini, 2006 –
come (con)cause dei tumori epatici infantili
Protocollo sperimentale esposizione in utero a DEHP
¾ Ceppo topo CD-1
¾ Gruppi di trattamento
• Controllo (CTRL) - solo veicolo (olio di oliva)
• Di-etilesil-ftalato (DEHP) 25 - 25 mg/kg pc pro die
[ LOEL per effetti endocrini a 3 generazioni sul ratto ]
• Di-etilesil-ftalato (DEHP) 100 - 100 mg/kg pc die
[ LOEL per effetti epatici nel topo, in studio di 2 anni ]
¾ Trattamento orale mediante gavaggio GD 11-19
(organogenesi del fegato nel topo dal GD 12-14
con differenziamento degli epatoblasti che continua fino al GD 18-20)
¾ Sacrifici:
• PND21 [ svezzamento ]
• PND35 [ fine della fase pre-puberale ]
Generazione F0: Tossicità generale
IN GRAVIDANZA Nessun segno di tossicità generale
Riduzione del peso materno, non statisticamente significativa in entrambi i
gruppi di trattamento (DEHP 25 e DEHP 100)
Nessuna variazione nel consumo di mangime
ALLATTAMENTO Nessun segno di tossicità generale e nessuna variazione del peso materno
(PND 1-21)
Nessuna variazione nel consumo di mangime
Generazione F1: Tossicità generale
¾ Riduzione del peso medio della nidiata alla nascita senza variazioni nel peso dei singoli nati
¾ Riduzione della numerosità della nidiata con evidente incremento ponderale durante lo
svezzamento
12
18,0
16,0
14,0
n° - grammi
12,0
CTRL
C ONTROLLI
10,0
DEHP25
6
DEHP 25
8,0
DEHP100
DEHP 100
6,0
4,0
2,0
0
Velocità di crescita PND 1-21
1
0,0
numerosità della
della nidiata
Numerosità
nidiata
incremento ponderale
Incremento
ponderale
2
Generazione F1: Peso della progenie allo svezzamento (PND 21)
Peso CD-1 maschi
16,00
14,00
10,00
C ONTROLLO
8,00
DEHP 25
DEHP 100
6,00
4,00
2,00
0,00
Pe so re lativ o fe gato CD-1 maschi
6,00
5,00
4,00
%
GRAMMI
12,00
3,00
2,00
1,00
0,00
CONT ROLLO
DHE P 25
DE HP 100
Generazione F1: Analisi istologica fegato topi CD-1 maschi (PND 21)
Marcata
vacuolizzazione
citoplasmatica
negli epatociti
Nuclei picnotici
epatocitari
Infiltrazioni
linfocitarie
Zone di
ematopoiesi
Controlli
0/8
-----
2/8
(25%)
0/8
-----
2/8
(25%)
DEHP 25
1/9
(11%)
7/9
(78%)
0/9
-----
9/9
(100%)
DEHP 100
4/9
(45%)
9/9
(100%)
2/9
(22%)
4/9
(45%)
¾ La vacuolizzazione citoplasmatica degli epatociti suggerisce un effetto di epatosteatosi
¾ L’aumento dei nuclei picnotici (DEHP 25 e 100) e delle infiltrazioni linfocitarie
(DEHP100) rappresentano segni di tossicità epatica
¾ L’aumento dell’ematopoiesi (anche se in assenza di una chiara relazione dose-risposta)
può essere riconducibile a:
•
Tossicità ematica e/o sul midollo osseo
•
Ritardo nella maturazione dell’organo (nei roditori, il fegato, mantiene la
funzione ematopoietica nel periodo perinatale)
Generazione F1: Analisi istologica fegato topi CD-1 maschi (PND 21)
EPATOSTEATOSI
Controllo (x100)
(colorazione Ematossilina-Eosina)
DEHP 100 (x100)
EPATOSTEATOSI come indice di alterazioni metaboliche epatiche
Steatosi epatica: indice di adipogenesi o anche di alterato metabolismo dei carboidrati ?
Martinelli et al., 2006
Epatocita
Epatocita
Generazione F1: Analisi istologica fegato topi CD-1 maschi (PND 21)
RIDUZIONE ACCUMULO DI GLICOGENO
CTRL (x20)
CTRL con diastasi
CTRL (colorazione rosso magenta intensa)
abbondanti accumuli di glicogeno nel citoplasma delle
cellule epatiche
DEHP 100 (colorazione rosso magenta poco intensa)
solo poche cellule presentano accumuli di glicogeno
colorazione P.A.S. (Periodic Acid Shiff)
DEHP 100
Generazione F1: Analisi istologica fegato topi CD-1 maschi (PND 21)
RIDUZIONE ACCUMULO DI GLICOGENO
P.A.S.
++
P.A.S.
+
P.A.S.
+/-
P.A.S.
−
CTRL
4/8
(50%)
1/8
(12.5%)
2/8
(25%)
1/8
(12.5%)
DEHP 25
1/7
(14%)
2/7
(29%)
1/7
(14%)
3/7
(43%)
DEHP 100
0/10
2/10
(20%)
2/10
(20%)
6/10
(60%)
¾ Il mancato accumulo di
glicogeno nei topi CD-1 trattati
con DEHP ricorda quanto
osservato nei topi igf2 KO
(Lopez et al., 1999).
¾ Il metabolismo del glicogeno
epatico è, nella fase embrionale,
sotto il controllo di IGF2.
Nei roditori l’accumulo IGF2dipendente di glicogeno avviene
nei 5 giorni precedenti la nascita
e serve per la sopravvivenza nei
primi giorni di vita post-natale.
I topi CD-1 maschi PND21 trattati in utero con DEHP ricordano i topi igf2 KO
Epatocita
¾ Difetti nella sintesi e
nell’accumulo di glicogeno
possono essere associati ad un
ritardo di crescita intrauterino
X
Serum
¾Malattie che riguardano il
metabolismo del glicogeno sono
state associate a casi di
epatoblastoma
Ito et al., 1987; Ucar et al., 2007
Epatocita
Generazione F1: Analisi immunoistochimica fegato topi CD-1 maschi (PND 21)
Localizzazione della proteina β-catenina
CTRL: β-catenina (40x)
DEHP 100
MASCHI PND21: LOCALIZZAZIONE beta-CATENINA
Membrana Plasmatica
7
6
N° CAMPIONI
Aumento della β-catenina citoplasmatica
come indicatore indiretto
di maggiore proliferazione cellulare …..
CITOPLASMA
5
4
3
2
1
0
CONTROLLO
CTRL
BENZOFURANO
DEHP100
100
DEHP
25
DEHP
DEHP: Risultati preliminari (1)
I dati dell’analisi istologica a nostra disposizione suggeriscono che l’esposizione
in utero a DEHP:
¾ alteri il metabolismo epatico dei carboidrati (riduzione accumulo del
glicogeno) e
dei lipidi (epatosteatosi) durante la fase di organogenesi del fegato
¾ ritardi la maturazione dell’organo (ematopoiesi attiva in fase perinatale)
X
DEHP → attivazione PPAR-α → induzione della proliferazione dei perossisomi →
cancerogenesi epatica
DEHP → attivazione PPAR-γ → alterazione metabolismo epatico → non
maturazione del fegato → predisposizione eventi tumorali in caso di attivazione di βcatenina (Wnt signaling)
DEHP: Risultati preliminari (2)
Inoltre:
9 la similarità degli effetti indotti dal DEHP con quelli riportati nei topi igf2 KO
sembrano suggerire un legame causale tra alterazioni del metabolismo epatico e
funzionalità della proteina IGF2 in fase embrionale e peri-natale
(velocità incremento ponderale durante lo svezzamento)
9 il mancato accumulo di glicogeno è tipico dei parti pre-termine, condizione che risulta
significativamente associata all’insorgeri di tumori epatici infantili
Quest’ultimo evento, infine, sembra essere associato alla alterata localizzazione della βcatenina (membrana plasmatica → citoplasma e nucleo) indotta da DEHP, un evento
tipico dei tumori epatici.
PPARs
DEHP
Wnt signalling
EPATOSTEATOSI
IGF-2
Glycogen storage
IGF1R
Glycogen
Synthase
GSK-3β
degradazione β-catenin
(proteasoma)
accumulo β-catenin
PROLIFERAZIONE
RINGRAZIAMENTI e collaborazioni
Roberta Tassinari, Gabriele Moracci, Vincenzo Lagatta,
Antonella D’Ambrosio, Daniele Marcoccia,
Francesca MARANGHI, Alberto Mantovani
Dip. Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare
Reparto di Tossicologia Alimentare e Veterinaria
Fabrizio Tosto, Mara Viganotti, Armando Magrelli,
Marco Salvatore, Domenica TARUSCIO
Centro Nazionale Malattie Rare
Gianluca Azzalin, Giuseppe MACINO
Università La Sapienza di Roma
Antonio Antoccia, Alessandra Di Masi, Sara Nicolai,
Caterina TANZARELLA
Università Roma Tre di Roma
