Un nuovo approccio:
la VEQ in biologia molecolare
Il crescente interesse nella biologia molecolare applicata alla
diagnostica è il risultato dei profondi progressi ottenuti nelle
conoscenze scientifiche in genetica, rese possibili
dall’introduzione delle tecniche di amplificazione genica.
Il numero di laboratori che utilizzano la tecnologia dell’
amplificazione genica sta crescendo rapidamente e una
conseguenza inevitabile di questa “esplosione demografica”
è la necessità di standardizzazione oltre che di una
definizione dell’organizzazione dei laboratori.
Biologia Molecolare applicata
alla diagnostica
Microbiologia
Genetica
Oncologia
Farmacogenetica
Tecniche impiegate
PCR: amplificazione del DNA
RT-PCR: amplificazione dell’RNA
PCR-SEQ: sequenziamento del DNA/RNA, previa amplificazione
Campioni sottoposti a tecniche diagnostiche
di biologia molecolare nell’U.O.
Microbiologia nel primo semestre 2005
PCR o altre tecniche di
amplificazione del
bersaglio
RT-PCR
PCR-SEQ
4090
14722
235
Toxoplasma, Antrace, Chlamydia, Micoplasma, HSV 1-2, VZV,
CMV, EBV, HHV6, HHV8, Enterovirus, HPV, Parvovirus, HBV,
HCV, HIV.
Talloni d’Achille delle tecniche
di amplificazione degli acidi
nucleici
• Elevata sensibilità: rischio di contaminazioni
• Inattivazione delle DNA polimerasi da impurezze
Rischio di contaminazioni
Organizzazione del laboratorio e della strumentazione:
1. Area conservazione dei reagenti e allestimento master
mix
2. Area preparazione del campione
3. Area assemblaggio miscele di reazione e mplificazione
4. Area analisi amplificati
Aspetti preanalitici
Necessaria una chiara definizione dei passagi preanalitici
Rischi:
Degradazione degli acidi nucleici da parte di nucleasi
ubiquitarie
Sensibilità della PCR rende possibile l’amplificazione
di materiale contaminante
CAMPIONI BIOLOGICI
Lavaggio bronchiale
Saliva
Sciacquo orale
Sangue intero
Buffy Coat
Sangue dessicato
Siero o plasma
Fluido cerebrospinale
Midollo osseo
Urina
Feci
Materiale bioptico
Campioni omogenei
PCR compatibili
Centralità del campione
Validazione
Assicurazione
Qualità
Interna
Tipo di
campione
Valutazione
Esterna
Qualità
Approccio integrato allo sviluppo di un saggio PCR diagnostico
Campionamento
Dove possibile evitare contenitori aperti
In caso diverso è importante evitare contaminazione
con materiale dell’operatore
Preferibili contenitori di plastica monouso
Sangue e midollo osseo non devono coagulare
Conservazione dei campioni
I campioni destinati all’analisi del DNA dovrebbero
essere conservati in tamponi di T10-E1 10 (mM Tris,
1 mM EDTA pH 7.5– 8.0) a 4 °C.
I campioni destinati all’analisi dell’RNA dovrebbero
essere conservati in soluzioni tamponate preferibilmente a
-80°C o in azoto liquido.
Adeguata anche la conservazione sotto forma di precipitato in
etanolo a -20 °C.
Campioni di RNA stabilizzati con ITCG possono essere
conservati 7 gg a T ambiente.
Otto preparazioni diverse di genoma di Citomegalovirus
Conservate a 4°C in TE per 5 anni
Amplificazione del gene UL44 (1299pb)
Fattori che interferiscono con le
procedure analitiche
Preparazione dei campioni
DNA. Eliminazione incompleta di inibitori:
• dal campione stesso (eme e precursori)
• da campionamento inadeguato (eparina)
• dalla procedura di purificazione (solventi organici)
RNA. Eliminazione incompleta di inibitori,
Contaminazione con Rnasi
Perdita durante la precipitazione
Fattori che interferiscono con le
procedure analitiche
Contaminazioni
• Dagli stessi ampliconi
• Da acidi nucleici nativi
• Dei reagenti
• Crociate (fra un campione positivo e uno negativo)
Fattori che interferiscono con le
procedure analitiche
Analisi dei prodotti di amplificazione
Elettroforesi
Digestioni di restrizione
Trasferimento degli ampliconi (blotting)
Ibridizzazione
Sequenziamento
Validazione mediante “Gold
Standard”
I risultati ottenuti con il saggio PCR dovrebbero essere
paragonabili a quelli ottenuti con un metodo di
riferimento
Validazione mediante “Gold
Standard”
Definizioni usate nella validazione di saggi PCR
(protocollo MicroVal, ISO 16140, 2003)
• PCR qualitativa: la risposta al saggio è la presenza o l’assenza
di un prodotto di PCR (amplicone) rilevato o per osservazione
diretta o con strumentazione
• PCR quantitativa: la risposta al saggio può essere correlata
con il numero delle copie di amplicone, determinato dal numero
di copie di sequenza bersaglio
• Limite di determinazione: il minimo numero di microrganismi
bersaglio per produrre una risposta PCR positiva
Validazione mediante “Gold
Standard”
• Selettività: misura della inclusione di ceppi bersaglio (fra un
ampio spettro di ceppi) ed esclusione (la mancata amplificabilità
di un rilevante spettro di ceppi non bersaglio strettamente correlati)
• Deviazione positiva (DP): caso PCR + a fronte di un
risultato - del saggio di riferimento (SR) (falso positivo)
• Deviazione negativa (DN): caso PCR - a fronte di un
risultato + del SR (falso negativo)
• Accordo positivo (AP): campione PCR + e SR +
• Accordo negativo (AN): campione PCR - e SR -
Validazione mediante “Gold
Standard”
• Accuratezza diagnostica (AC): grado di corrispondenza
tra risultato ottenuto con PCR e SR su campioni identici
(AC=(AP+AN)/Numero totale dei campioni
• Sensibilità diagnostica (SE): capacità del saggio PCR di
rilevare il bersaglio quando è rilevato dal SR {(AP/N+)x100}
• Specificità diagnostica (SP): capacità del saggio PCR di
non rilevare il bersaglio quando non è rilevato dal SR {(AP/N-)x100}
• Robustezza: riproducibilità da parte di altri laboratori che usino
altri lotti e altre marche di reagenti, termociclatori e
strumentazione validati
N+ numero totale di risultati positivi con SR
N- numero totale di risultati negativi con SR
Controlli di qualità
Controlli interni 1
• Relativi alla preparazione del materiale da saggiare:
DNA
Integrità - elettroforesi in gel d’agarosio
Inibitori - digestione con ER, quindi elettroforesi
analisi spettrofotometrica a 260 e 280nm
RNA
Integrità - elettroforesi in gel d’agarosio non denat.
o denaturante
Inibitori - analisi spettrofotometrica a 260 e 280nm
Controlli di qualità
Controlli interni 2
• Relativi alla sintesi di cDNA e amplificazione:
sintesi di cDNA
Controllo interno (CI) - mRNA presenti nel campione
(messaggeri ubiquitari) o RNA aggiunto al momento
Se il prodotto del CI non viene amplificato:
• degradazione dell’RNA
• mancato priming della sintesi del cDNA
• assenza di attività enzimatica
L’aggiunta di quantità note di un CI consente di rilevare
diminuita sensibilità dell’RT-PCR
Controlli di qualità
Controlli interni 3
•Relativi alla sintesi di cDNA e amplificazione:
PCR.:
Controllo interno (CI) - gene essenziale per la
sopravvivenza (fattore di letalità, presente almeno allo stato
di emizigote) opure aggiunto al momento
In questo caso il CI consente di distinguere tra
assenza della sequenza bersaglio e insuccesso della PCR.
Controlli di qualità
Controlli esterni
Controllo esterno positivo: aliquote di DNA appropriate e
loro appropriate diluizioni consentono un controllo di
qualità della miscela di reazione.
E’ essenziale se si sospetta che il limite di determinazione
possa essere inadeguato a rivelare la presenza del bersaglio.
Controlli di qualità
Controlli esterni
Controllo esterno negativo:
Campione negativo contenente materiale genetico
strettamente imparentato con quello cercato, ma che non può
funzionare da bersaglio
Bianco: contiene tutti i reattivi ma non il campione da
amplificare. Diversi bianchi possono essere inseriti ai
passaggi che si ritengano a rischio di contaminazione.
Controllo ambientale: provetta contenente la miscela
di reazione lasciata aperta durante lo svolgimento di tutto il
saggio per la rivelazione di DNA contaminante proveniente
dall’ambiente.
Controlli di qualità
Controlli per la valutazione dei risultati
Se l’amplicone deve essere sottoposto a
digestione enzimatica (RFLP) la funzionalità
dell’enzima usato può essere controllata
mediante la scelta di frammenti diagnostici
che includano siti di restrizione costanti per lo
stesso enzima
Elettroforesi: calibratori delle dimensioni degli
ampliconi e ampliconi di controllo a concentrazione
nota. Devono subire le stesse procedure di
preparazione dei campioni
Controlli di qualità
Controlli per la valutazione dei risultati
Controlli per il sequenziamento: le ditte produttrici in
genere forniscono opportuni templati per
l’amplificazione e i corrispondenti primer per il
controllo delle reazioni di sequenziamento. Queste
reazioni consentono anche di controllarela qualità del
gel di sequenziamento.
Per l’analisi di mutazioni sarebbe opportuno l’analisi
in parallelo di alleli wt di controllo e campioni da
altri membri della famiglia.
Valutazione esterna di qualità
proficiency testing
• Methodological proficiency testing
Verifica della qualità dei passaggi analitici elementari:
Preparazione di DNA/RNA
Performance del metodo di amplificazione con
primer forniti
elettroforesi in gel d’agarosio
• Application based proficiency testing:
Realizzabile per saggi eseguiti con relativa frequenza
Valutazione esterna di qualità
Application based proficiency testing
Valutazione esterna di qualità
Application based proficiency testing
1. Determinazione di mutazioni genetiche
2. Interpretazione dei risultati
Campioni
Azioni
DNA purificato
Determinazione di mutazioni specifiche per:
Fibrosi cistica, Poliposi adenomatosa
familiare
β-talassemia, sindrome dell’ X fragile
Valutazione esterna di qualità
Methodological proficiency testing
Valutazione esterna di qualità
Methodological proficiency testing
1. Estrazione del DNA
2. Performance della PCR
3. Interpretazione dei risultati
Campioni
Azioni
DNA standard
Determinazione spettrofotometrica
Campione di sangue
Estrazione di DNA e det. spettrofotom.
DNA di riferimento e Primer
PCR in parallelo con il DNA estratto con
3 coppie di primer e analisi dei prodotti
Da C. Casini Raggi, Clin. Biochem. (2003); 49:782-791
Da C. Casini Raggi, Clin. Biochem. (2003); 49:782-791
Questionario Programma VEQ in Biologia
Molecolare
Il Vostro laboratorio esegue metodiche di biologia olecolare?
17 Si
16 No
Il sistema di estrazione degli acidi nucleici utilizzato è:
Kit commerciale
Protocollo in house
Protocollo riconosciuto come
gold standard?
17
0
6 Si
5 No
6 Non so
Questionario Programma VEQ in Biologia
Molecolare
Il materiale genetico estratto viene controllato per
qualità e purezza prima di essere processato?
3 Si
13 No
1 A volte
Il laboratorio dispone di uno spettrofotometro?
10 Si
4 No
3 Non Risponde
Il laboratorio utilizza enzimi di restrizione?
4 Si
11 No
2 Non Risponde
Questionario Programma VEQ in Biologia
Molecolare
Quale/i metodo/i di amplificazione genica è/sono in uso
nel vostro laboratorio?
14
PCR
3
Real
Time PCR
5
RT-PCR
2
PCR-SEQ
Questionario Programma VEQ in Biologia
Molecolare
I risultati sono interpretati con l’aiuto di:
6
4
Standard Standard
Interno
esterno
5
Standard
Interno e
Standard
esterno
1
Metodi
propri
1
Non
Risponde
Questionario Programma VEQ in Biologia
Molecolare
Viene eseguita l’identificazione del genoma di
microrganismi patogeni?
10 Si
6 NO
2 Non risponde
Programma VEQ biologia
molecolare
1. Estrazione del DNA
2. Performance della PCR
3. Interpretazione dei risultati
Campioni
Azioni
Campione di sangue
Estrazione di DNA:
determinazione quantità e verifica
purezza.
DNA di riferimento, Primer
PCR in parallelo con il DNA estratto con
ed Enzima di Restrizione
3 coppie di primer e analisi dei prodotti
Programma VEQ biologia
molecolare
Estrazione del DNA
Determinazione spettrofotometrica
A260/A280
Digestione con ER e analisi
elettroforetica
Amplificazione DNA estratto
e DNA di riferimento con primer
Forniti in doppio
Analisi diretta
Interpretazione dei risultati
Spedizione gruppo VEQ BM
S.Orsola - Verifica
Variabilià dei saggi di PCR
La qualità dei risultati del saggio è influenzata in modo
determinante da fattori che riguardano il prelievo del
campione, la preparazione del campione e la preparazione
della miscela di reazione.
I saggi PCR di routine andrebbero controllati a livelli di vari
parametri: specificità, limite di determinazione, linearità,
precisione, etc.)
Il limite di determinazione dovrebbe essere valutato su tutta la
procedura, dalla raccolta del campione, alla sua preparazione,
all’amplificazione dell’acido nucleico e alla rivelazione degli
ampliconi
