centro di ricerca, trasferimento ed alta formazione

CENTRO DI RICERCA, TRASFERIMENTO ED ALTA FORMAZIONE
“ STUDIO A LIVELLO MOLECOLARE E CLINICO DI MALATTIE CRONICHE, INFIAMMATORIE, DEGENERATIVE E
NEOPLASTICHE PER LO SVILUPPO DI NUOVE TERAPIE”
DIRETTORE : ENRICO MAGGI
Progetto per assegno di ricerca
Decorrenza 1 dicembre 2011
TITOLO DELLA RICERCA:
Coniugati stabili di proteine allergeniche con adenine modificate per la modulazione della risposta Th2
nelle malattie allergiche
Settore disciplinare della ricerca:
06/B1 (MED/09), 06/A2 (MED46)
Introduzione: E’ noto che la produzione di IL-4, IL-5 ed IL-13 da parte dei linfociti TH2 caratterizza la
risposta effettrice verso gli allergeni ambientali nei soggetti atopici. Tuttavia, numerosi studi condotti hanno
dimostrato che le cellule TH2 possono essere redirezionate, almeno in vitro, verso fenotipi più protettivi
caratterizzati dalla produzione prevalente di IFN-gamma (cellule TH1) attraverso l’uso di sostanze ad attività
immunostimolante capaci di indurre la produzione di IL-12 ed interferoni da parte delle cellule dell’immunità
innata. Molti ligandi naturali o sintetici di recettori Toll-like (TLRs) si sono dimostrati potenti
immunostimolanti delle risposte TH1, tra i quali oligonucleotidi contenenti dimeri CpG (CpG-ODN), RNA a
doppia o singola elica (ds e ssRNA) ed imidazochinoline. Molto recentemente è stata descritta una nuova
famiglia di eterocicli derivati dall’adenina per aggiunta in posizione -8 di un gruppo OH (8-idrossi adenina)
che, per sostituzioni in posizione -9 e -2, mostrano capacità immunostimolanti sia in vitro che in vivo per
attivazione di TLR7. Per la loro attività adiuvante, gli immunomodulanti in genere, e, a questo proposito, le 8idrossi adenine, sono di particolare interesse per la possibilità di essere impiegati nelle pratiche vaccinali
nelle quali è auspicabile una regolazione negativa della risposta antigene-specifica orientata verso il fenotipo
TH2 come nelle malattie allergiche o nei tumori. Alcuni Autori, hanno dimostrato sia in vitro come il legame di
un adiuvante come gli oligodesossinucleotidi CpG a proteine allergeniche renda il composto ancora più attivo
nel ridirezionamento della risposta effettrice. Inoltre, l’immunoterapia specifica con tale coniugato in
pazienti sensibilizzati al polline di ambrosia si è dimostrata efficace nel controllo dei sintomi ma anche nella
riduzione della produzione di IL-4 ed IL-5 da parte dei linfociti T sia circolanti che infiltranti i siti di flogosi.
E’ intuitivo infatti che indirizzare contemporaneamente verso la stessa cellula presentante l’antigene sia
l’adiuvante attivo che la proteina allergenica come nel caso di un prodotto coniugato in modo stabile possa
consentire di i) impiegare minori quantità di adiuvante (con minori effetti tossici) e verosimilmente ridurre il
boost allergenico (con riduzione del numero delle immunizzazioni); ii) agire esclusivamente sulla risposta
specifica per l’antigene (riducendo la liberazione di mediatori della flogosi); iii) modulare la quantità di
adiuvante fino alla dose minima efficace per re-indirizzare la risposta immunitaria.
Obiettivi: a) sintesi di 8-idrossi adenine variamente sostituite in posizione 9- e 2- atte ad essere coniugate
tramite legame ammidico a proteine allergeniche; b) coniugazione chimica di 8-idrossi adenine attive a
proteine allergeniche di varia origine (Dermotophagoides pteronyssinus, allergeni alimentari) e studio
dell’attività modulante dei composti rispetto all’adiuvante solubile in sistemi di coltura in vitro di cellule
umane; c) identificazione dei meccanismi molecolari (recettori, fattori di trascrizione) attivati dai composti
attivi; d) studio degli effetti in vivo dei composti ottenuti in modelli sperimentali murini di asma bronchiale e
di allergia alimentare.
Metodiche: 1) sistemi di stimolazione in vitro di cellule dell’immunità innata (monociti, cellule dentritiche) o
specifica (linfociti B) con 8-idrossi adenine modificate in posizione 9- e 2- solubili o coniugate chimicamente
con allergeni per la produzione nel supernatante di citochine/chemochine modulatorie (IL-12, IFN-alfa, IL-10,
CXCL10) od infiammatore (TNF-alfa, IL-6, IL-23, IL-21) applicando tecniche ELISA. Le cellule e gli
stimolanti saranno anche studiati per la regolazione di mRNA o proteine citoplasmatiche per le stesse
citochine/chemochine con real-time PCR e Western blot. 2) sistemi di transfezione stabile o transiente di
linee cellulari stabilizzate per l’espressione di recettori Toll-like, NOD e NplR3 per lo studio dell’attività
stimolatoria da parte di 8-idrossi adenine modificate solubili o coniugate e loro inibizione con siRNA specifici.
3) sistemi di coltura di cellule mononucleate circolanti o di popolazioni cellulari purificate (CD4+, CRTH2+) da
soggetti atopici per lo studio di linee cellulari a breve termine allergene-specifiche (risposta proliferativa
specifica, produzione di citochine, regolazione di fattori di trascrizione, espressione di mRNA per citochine)
utilizzando 8-idrossi adenine modificate solubili o coniugate chimicamente. 4) sistemi di espansione di
popolazioni linfocitarie omogenee (cloni cellulari T) specifiche per allergeni con uso di 8-idrossi adenine
modificate o coniugate chimicamente. 5) sistemi di stimolazione di basofili circolanti con allergene o 8-idrossi
adenine modificate coniugate per modulazione dell’espressione di molecole di superficie (CD63) e sistemi di
inibizione del legame delle IgE allergene-specifiche a proteine allergeniche non modificate o coniugate a 8idrossi adenine modificate.
Ricadute e sviluppi: La possibilità che adiuvanti di una nuova classe (8-idrossi adenine) opportunamente
modificati e coniugati chimicamente con molecole allergeniche (o altre proteine antigeniche) siano in grado di
modificare la risposta effettrice T dell’uomo verso fenotipi più protettivi, apre importanti prospettive nelle
pratiche vaccinali. In particolare, questo studio potrà fornire le basi sperimentali per migliorare
l’immunoterapia specifica nelle malattie allergiche, l’immunoterapia dei tumori e l’immunoterapia nei soggetti
con sistema immunitario immaturo.
Il Responsabile della ricerca
Prof. Enrico Maggi
Prof. Ordinario di Medicina Interna
Viale Pieraccini 6 - 50134 Firenze. Tel. +39-055-4271352 Fax +39-055-4271500 E-mail: [email protected]