Danti-Ricci

Bressanone, 21-24 Settembre 2015
XXXIV Scuola Annuale di Bioingegneria
“Sviluppo di modelli 3D bioibridi del cancro per test
in vitro avanzati”
Ing. Serena Danti, PhD
Dr. Claudio Ricci, PhD
[email protected]
Modelli in-vitro - 1
I modelli in vitro, qualsiasi sia il loro scopo, devono replicare il più possibile le caratteristiche,
biochimiche fisiche morfologiche e fsiologiche, del sistema in studio per poter essere predittivi
Mattei G., et al. 2014
24/09/2015
2
Modelli Tumorali
Ricci C., et al. 2013
24/09/2015
3
Modelli Murini in-vivo
Esistono diversi approcci per creare un modello tumorale murino
24/09/2015
4
Modelli Murini in-vivo
Motivi etici:
Motivi scientifici:
Motivi economici:
•
24/09/2015
Responsabilità morale nei confronti degli
animali;
Sperimentazione animale soggetta a
variabilità ed a difficoltà di estrapolazione
alla specie umana;
Tempi e costi.
Bisogna adottare ogni metodo scientifico che
Rimpiazzi gli animali superiori (vertebrati senzienti)
Riduca il numero degli animali
Raffini le tecniche di sperimentazione per diminuire la
sofferenza.
5
Modelli in vitro 3D – 1
(Classico)
Sferoidi Umani Tumorali
Gli sferoidi sono i modelli 3D più ampiamente utilizzati,
un piccolo aggregato cellulare (20 μm – 1 mm)
strettamente legato che tende a formarsi quando
cellule trasformate sono mantenute in condizioni non
aderenti.
Esistono differenti metodi per la realizzazione, quello più utilizzato
è lo spinner flask, in cui il fluido è messo in turbolenza in questo
modo previene l’adesione e promuove l’aggregazione cellulare
Questi modelli hanno vari problemi tra cui un pessimo gradiente di diffusione (i farmaci sono sono più
grossi di molecole come O2) e la mancanza di mezzi accurati per test vitalità cellulare in coltura 3D
24/09/2015
6
Modelli in vitro 3D – 2
(Avanzato)
Gel Embedding
L’insuccesso degli sferoidi nel mimare
ECM ha portato a nuovi modelli i
quali prevedono l’uso di gel biologici
come substrato per la crescita degli
sferoidi
COLLAGENE
ALGINATO
BD Matrigel™
Basement Membrane Matrix
derived from mouse
sarcoma that contains:
Collagen type IV
Laminin
ECM molecules
And various soluble signal
24/09/2015
In questi modelli abbiamo un’ architettura che simula
ECM e su cui le cellule possono organizzarsi.
Comunque rimangono i limiti degli sferoidi in quanto
le cellule tendono ad aggregarsi lo stesso perche’
questi gel non hanno un rigido crosslinken networks
e quindi soffrono della limitazione del trasporto
7
Modelli in vitro 3D – 3
(Avanzati)
L’utilizzo di polimeri più complessi per formare una vera architettura e in cui è possibile variare le proprietà
chimico-fisiche e meccaniche.
Labhasetwar & Mooney separatamente
studiano il tumore del seno (linee cellulari
MCF-7) e del cavo orale all’interno di
microparticelle porose composte da acido
poli-lattico (PLA) o copolimeri di Acido
Lattico e Glicolico (PLGA).
24/09/2015
Anche Fischbach utilizza PLGA ma
questa volta con dimensione non di
microparticelle ma un disco di
diametro di ≈ 8mm e spessore 1 mm
in cui a seminato una linea di
carcinoma squamoso del cavo orale.
Dhiman et al. studiano la crescita
della MCF-7 all’interno di di uno
scaffold con porosità differenti a
seconda della deacetilazione della
chitina.
8
Modello 3D in vitro - 4
Modello 3D tumorale
Gli elementi fondamentali per un modello
tumorale:
1) Cellule (colture primarie o linee cellulari)
2) Stimoli Chimico/Fisici (fattori di crescita,
stimoli meccanici)
3) Supporto 3D poroso (scaffold)
24/09/2015
9
Tecnologie di fabbricazione per scaffold 3D
Visti i precedenti modelli lo scopo è quello di creare uno scaffold ad hoc in cui si possa
ricreare un’architettura simile alla matrice extracellulare e dove le cellule tumorali
possano organizzarsi.
Tecnologie utilizzate
1) Elettrofilatura
(Electrospinning)
3) Prototipazione rapida
(Rapid Prototyping)
2) Stampaggio per compressione e
lisciviazione di particolato
(Compression Molding & Particle
Leaching)
24/09/2015
4) Emulsione e
Liofilizzazione
(Emulsion & freezedrying)
10
Elettrofilatura – 1
L’electrospinning è un processo
produttivo che consente di
ottenere filamenti continui di
materiale sintetico del diametro
straordinariamente piccolo,
inferiore al micron. Il getto
polimerico viene stirato
all’interno di un elevato campo
elettrico. I filamenti così prodotti
raggiungono diametri
dell’ordine di 100 nm.
24/09/2015
11
Elettrofilatura – 2
Micrografie elettroniche (SEM) a vari ingrandimenti di
uno scaffold ottenuto tramite elettrofilatura. E’
possibile vedere la struttura delle fibre ultrafini e le
loro dimensioni.
24/09/2015
12
Rapid Prototyping - 1
La tecnica di Prototipazione Rapida è largamente utilizzata per fabbricare scaffold polimerici. E’
molto versatile e molto precisa in quanto è controllata tramite PC e quindi è possibile creare vari tipi
di forme, grandezze e strati che si alternano dando luogo a strutture porose con un’ottima
riproducibilità
Pfister A. et al., 2004
24/09/2015
13
Rapid Prototyping - 2
Tra queste, la Modellazione per Deposizione dal Fuso (FDM) permette di avere fibrose 3D (3D Fiber
Deposition). Esistono anche tecniche di deposizione di fibre da soluzione.
Moroni L., et al. 2005
Gli scaffold vengono caratterizzati attraverso il diametro della fibra ottenuta (che può essere variato
variando il diametro dell'ugello o la velocità di deposizione), la spaziatura tra le fibre nello stesso strato, la
spessore dello strato, e la configurazione delle fibre depositate entro l'intera architettura.
24/09/2015
14
Compression Molding & Particle Leaching
Dispersione
Materiale
(Polimero fuso,
monomero o molecola
da reticolare)
Particelle
idrosolubili
(NaCl)
Stabilizzazione (solidificazione o reticolazione) nell’apposito stampo
Lavaggio delle particelle in acqua distillata per
ottenere una struttura porosa
24/09/2015
15
Emulsione & Liofilizzazione
Emulsione: è una dispersione, più o meno stabile, di un fluido sotto forma di minutissime
goccioline o bollicine (fase dispersa) in un altro fluido non miscibile (fase continua o fase
disperdente o veicolo).
Alcol
polivinilico
(PVA)
+
Soluzione
acquosa di
gelatina
Dopo il processo di congelamento il PVA
reticola e l’acqua evaporata dà luogo ad
un supporto spugnoso con molti pori
interconnessi
24/09/2015
Emulsione: microbolle, si
crea una schiuma
Liofilizzazione:
l’acqua viene
sublimata
16
Modelli Tumorali
Modello 3D tumorale
Gli elementi fondamentali per un modello
tumorale:
1) Cellule (colture primarie o linee cellulari)
2) Stimoli Chimico/Fisici (biochimici,
meccanici)
3) Scaffold
24/09/2015
17
Colture Cellulari
Le colture preparate direttamente da un tessuto si dicono colture primarie; le cellule isolate da un
qualsiasi tessuto animale sono in grado di compiere un numero finito di divisioni cellulari in vitro,
dopodiché vanno incontro a degenerazione e morte. Tale fenomeno avviene indipendentemente dalla
presenza di metaboliti appropriati per la crescita e si indica come senescenza.
In genere il numero di “cicli” che una cellula è in grado di effettuare in vitro dipende anche dall’età
dell’animale.
Le linee cellulari continue derivano da singole cellule in cui mutazioni spontanee o indotte hanno
annullato il programma genetico della senescenza.
Si dicono perciò immortali: proliferano in modo continuo in presenza degli opportuni metaboliti. Molte
linee cellulari continue sono state ottenute a partire da tessuti tumorali (es. HeLa).
Le cellule trasformate, invece, presentano caratteristiche simili alle cellule cancerose: sono
immortali, proliferano in vitro fino a raggiungere una densità maggiore delle cellule normali e, spesso,
crescono senza aderire ad alcuna superficie.
Le colture si distinguono a seconda che le cellule siano in sospensione o aderenti.
Le cellule di origine emopoietica, che normalmente crescono in mezzo fluido, crescono in
sospensione e si moltiplicano in vitro senza aderire.
Le cellule che, invece, fanno parte di tessuti solidi crescono in vitro aderendo alla superficie delle
piastre da coltura.
24/09/201
18
Tumori
I TUMORI o NEOPLASIE rappresentano l’insieme di una popolazione di cellule somatiche dell’organismo
avente quasi sempre origine monoclonale, con capacità replicativa illimitata e indipendente.
Crescita cellulare non regolata da stimoli esterni (autonoma), capacità di invadere i
tessuti e di metastatizzare e colonizzare siti a distanza.
Neoplasia Maligna
Carcinoma
Sarcoma
Tessuto Epiteliale
Tessuto Mesenchimale
(Es. Adenocarcinoma Duttale del
Pancreas, Carcinoma Mammella,
Carcinoma Squamoso del Polmone o
del testa\collo)
(Es. Adiposo – Liposarcoma, Muscolare
Striato – Rabdomiosarcoma , Osso –
Osteosarcoma)
24/09/2015
19
Tumori - 2
I Tumori sono patologie a carattere genetico il cui livello di espressione è la singola cellula: sono ereditabili
ma nella maggior parte avvengono mutazioni nelle cellule somatiche con errori intrisechi nella replicazione
del DNA o esposizione ad agenti cancerogeni
24/09/2015
20
Tumori - 3
All’interno della cellula
sono molti i punti in cui
è possibile intervenire
per inibire i percorsi
biochimici (pathways)
compromessi.
24/09/2015
21
Tumori - 4
Negli ultimi anni il ruolo del miroroambiente tumorale (TME) si è dimostrato essere fondamentale per
capire come si sviluppa il tumore e per cercare nuovi target terapeutici e prognostici, infatti sono molti gli
elementi cellulari (Sistema Immunitario, fibroblasti etc. ) e le proteine coinvolte nello sviluppo tumorale
Joyce J., et al. 2013
24/09/2015
22
Tumori - 5
Fattori e processi importanti che portano dal tumore in-situ alla metastasi sono la transizione epitelialemesenchimale (epithelial-mesenchymal transition, EMT), gli esosomi (in cui all’interno si accumulano miRNA), le
proteine di mobilità ed il rimodellamento della matrice extracellulare
Quail DF., et al. 2013
24/09/2015
23
Adenocarcinoma Duttale del Pancreas (PDAC)
Nel 75% dei pazienti il PDAC viene diagnosticato in una fase già molto avanzata per la mancanza
di marker, quindi la sopravvivenza dal momento della diagnosi è molto bassa (5-18 mesi)
La chemioterapia mostra un beneficio solo nel 20% dei pazienti ma non è risolutiva.
24/09/2015
24
Microambiente PDAC
Il microambiente del PDAC
è molto complesso: oltre alle
cellule epiteliali sono presenti
le cellule staminali tumorali e
le cellule stellate, il cui ruolo è
ancora non chiaro, i
fibroblasti e tutto il pool di
proteine implicate nel
rimodellamento della matrice
extracellulare
24/09/2015
25
Colture Primarie
Micro-dissezione Laser
Avere colture primarie di tumore può essere
fondamentale per ricreare un sistema realistico del
tumore in vitro
Isolamento e coltura
24/09/2015
26
24/09/2015
27
24/09/2015
28
Colture Primarie
Nelle colture primarie, rimane
la morfologia del tessuto
tumorale insieme a tutte le
componenti cellulari.
24/09/2015
29
24/09/2015
30
Modelli Tumorali
Modello 3D tumorale
Gli elementi fondamentali per un modello
tumorale:
1) Cellule (colture primarie o linee cellulari)
2) Stimoli Chimico/Fisici (biochimici,
meccanici)
3) Scaffold
24/09/2015
31
Stimoli Chimico/Fisici
1) Fattori di Crescita: molecole solubili addizionate nel terreno di
coltura, molecole del microambiente.
2) Bioreattori: sistemi che provocano una movimentazione del
liquido di coltura ed agiscono sulle cellule tramite campi di forza.
3) Stimoli topografici: caratteristiche apportate sulle superfici di
adesione delle cellule per stimolarne il differenziamento,
l’orientazione o semplicemente l’adesione.
24/09/2015
32
Modelli Avanzati
Investigare colture primarie di
adenocarcinoma con vari tipi di
scaffold per capire quale supporto
e quale tecnologia sia la migliore
per sviluppare un modello in vitro.
24/09/2015
33
Campagna Sperimentale
1) Elettrofilatura
PEOT/PBT
(poly(ethylene ossi) terephthalate
– poly(butylene) terephthalate)
Scaffold
2) Compression
Molding & Particle
Leaching
PEOT/PBT
(poly(ethylene ossi) terephthalate
– poly(butylene) terephthalate)
3) Emulsione &
Liofilizzazione
Sterilizzazione
Cellule
Analisi
PVA/Gelatina
DISC
CM
PVA
(polyvinilalcohol)
Etanolo, lavaggi con antibiotici/antifungini
Colture primarie di PDAC
SEM (microscopia a scansione elettronica)
Metabolismo cellulare (AlamarBlue)
Istologia (ematossilina & eosina)
ISSID-
Immunoistochimica
2013
24/09/2015
34
Diagramma Sperimentale
Resezione Chirurgica, DCP
Duodenopancreasettomia
totale.
Ricci C., et al. 2013
24/09/2015
3
5
Morfologia degli Scaffold
PVA
24/09/2015
CM
DISC
36
Colonizzazione cellulare degli Scaffold
Scaffold
CM
DISC
Cellule
24/09/2015
37
Colonizzazione cellulare degli Scaffold
Scaffold
PVA
Cellule
24/09/2015
38
Attività Metabolica
DISC
PVA
CM
24/09/2015
39
Analisi Istologica
•
•
•
•
•
24/09/2015
Fissazione
Processazione
Inclusione in
paraffina
Taglio
Colorazione
40
Ematossilina & eosina
10X
20X
40X
15 giorni
8 giorni
5 giorni
2 giorni
4X
24/09/2015
41
Ematossilina & eosina
24/09/2015
42
Ematossilina & eosina
Formazioni di dotti
CM
24/09/2015
DISC
43
Ematossilina & eosina
PVA
24/09/2015
44
Immunoistochimica
EPIDERMAL
CITOCHERATINA
GROWTH
TRANSFORMING
FACTOR
PANCREATICA
METALLOPROTEINASI-9
GROWTH FACTOR
ACTINA
DESMINA
RECEPTOR
Marcatori molecolari (IHC)
24/09/2015
Tempo
(giorni)
EGF-R
Pan-CK
TGF-β
MMP-9
ACTINA
DESMINA
2
3
3
3
3
1
0
5
3
3
3
3
2
0
8
3
3
3
3
0/1
0
15
3
3
3
3
0
0
45
Immunoistochimica MMP-9
PVA
Coltura 2D
24/09/2015
CM
Tumore
DISC
controllo
46
Immunoistochimica MMP-2
PVA
Coltura
2D
24/09/2015
CM
DISC
Tumore
47
CONCLUSIONI - 1
Il modello 3D avanzato per lo studio del PDAC in vitro ha permesso di
identificare il tipo di scaffold più idoneo per queste cellule, cioè quello
che dà luogo alla rigenerazione di strutture simil-tumorali (PVA).
Infatti:
1) È risultato fattibile e riproducibile
2) Ha permesso di valutare la migrazione cellulare delle
colture di PDAC
3) Ha permesso di osservare la transizione
epiteliale/mesenchimale
Lo studio di modelli 3D avanzati di tumore in vitro può generare nuova
conoscenza indispensabile per sviluppare nuovi farmaci e sconfiggere
queste patologie.
24/09/2015
48
Ringraziamenti
University of Pisa
Prof. Boggi Ugo
Prof. Campani Daniela
Dr. Funel Niccola
Dr. Danti Serena
Dr. Trombi Luisa
Dr. D’Alessandro Delfo
Cancer Center
Amsterdam
Dr. Giovannetti elisa
University of Twente
Prof. Moroni Lorenzo
24/09/2015
49
Bressanone, 21-24 Settembre 2015
XXXIV Scuola Annuale di Bioingegneria
GRAZIE PER
L’ATTENZIONE
“Sviluppo di modelli 3D bioibridi del cancro per test in vitro avanzati”
Ing. Serena Danti, PhD - Dr. Claudio Ricci, PhD
[email protected]