Screening genetico di Gata4 e Nkx2,5 nelle cardiopatie congenite

120
Case Records IFC/CNR
Recenti Prog Med 2011; 102: 120-125
Screening genetico di Gata4 e Nkx2,5 nelle cardiopatie congenite:
cinque casi familiari
Silvia Pulignani, Ilenia Foffa, Monica Cresci, Simona Vittorini, Lamia Ait-Alì, Maria Grazia Andreassi
Riassunto. Mutazioni nei geni Gata4 e Nkx2.5 sono state
associate a diverse forme ereditarie di cardiopatia congenita (CC), in particolare di difetto del setto atriale e/o ventricolare. Il ruolo di tali mutazioni in casi familiari di CC non è,
tuttavia, ancora ben definito.
Riportiamo 5 casi di CC con una storia familiare di CC. I dati
ottenuti suggeriscono che le mutazioni nei geni Gata4 e
Nkx2.5 si presentano con una frequenza piuttosto bassa in
casi familiari di CC, sottolineando l’elevato grado di eterogeneità della malattia congenita e i limiti dello screening
genetico nella pratica clinica quotidiana. Sulla base delle
conoscenze attuali, è difficile stabilire il rischio di cardiopatia congenita nella progenie di adulti operati per correzione di una cardiopatia congenita.
Summary. Genetic screening of Gata4 and Nkx2.5 mutations
in hereditary congenital heart defects: 5 familial cases.
Parole chiave. Cardiopatie congenite, gene Gata4, gene
Nkx2,5.
Key words. Congenital heart defects, Gata4 gene, Nkx2.5
gene.
Introduzione
ziato la presenza di mutazioni nei geni Gata4 e
Nkx2.5 in forme familiari di malattia espressa in
quadri clinici sia sindromici che isolati3,6.
La reale incidenza di mutazioni in casi familiari rimane, tuttavia, non definita.
Presentiamo cinque casi familiari di pazienti affetti da CC con una storia familiare positiva per
malformazioni cardiache (figura 1 alla pagina a
fronte), nei quali è stato eseguito lo screening genetico di Gata4 e Nkx2.5 al fine di identificare mutazioni patogenetiche all’interno delle singole famiglie.
Le cardiopatie congenite (CC) rappresentano
le malformazioni congenite più frequenti, con
un’incidenza generale di circa 1 caso per 1000 nati vivi1,2. L’incidenza varia in accordo alle forme di
CC: per le forme moderate e gravi è circa 6/1000
nati vivi; 19/1000 nati vivi se viene inclusa anche
la valvola aortica bicuspide, ed aumenta a 75/1000
nati vivi, se si includono anche i piccoli difetti del
setto ventricolare presenti alla nascita ed altre lesioni minori2.
I difetti del setto atriale e ventricolare sono le
CC più comuni, anche nel nostro Paese1. Negli ultimi anni, studi condotti su modelli animali di topi knockout hanno permesso di identificare un network molecolare evolutivamente conservato, costituito da una fitta rete di fattori di trascrizione, che
esercita un importante ruolo nel corretto sviluppo
cardiaco3,4.
In particolare, mutazioni dei fattori Gata4 e
Nkx2,5, geni che sono espressi nelle prime fasi della morfogenesi cardiaca e responsabili del processo di sepimentazione cardiaca e di un corretto sviluppo vascolare, potrebbero portare a difetti del
setto atrio-ventricolare3,5.
Infatti, studi di sequenziamento genico condotti su pazienti con difetti del setto hanno eviden-
Single gene mutations in Gata4 and Nkx2.5 genes have
been identified as a causative factor for various clinical
forms of hereditary congenital heart diseases (CHDs), especially for cardiac septal defects. However, the role of Gata4 and Nkx2.5 mutations in familial CHD is not clear yet.
We report 5 cases of familial CHD with a positive history of
cardiac septal defects. Our data suggest that mutations of
either the Gata4 or Nkx2.5 genes are very uncommonly
found in familial cases of CHD, supporting the genetic heterogeneity of cardiac congenital defects and the limitation
of genetic testing in clinical setting.
Casi clinici
Caso 1: bambino di 1 mese con diagnosi alla nascita
di un difetto interventricolare e interatriale.
L’anamnesi familiare ha rivelato una storia positiva
di CC, in particolare la sorella maggiore è deceduta ad 1
mese e mezzo di vita per atresia polmonare con difetto
interventricolare e malformazione intestinale non meglio definita (figura 2).
Caso 2: bambina di 1 mese di vita, giunta presso il
nostro Dipartimento di Cardiologia con sospetto di CC
cianogena. L’eco-doppler cardiaco ha documentato la
presenza di un piccolo difetto interatriale e di un difetto interventricolare ampio da malallineamento, oltre
alla presenza di un’aorta dilatata a cavaliere del difetto e rami polmonari ipoplasici da 3,5 a 4 mm e confluenti.
UO Ricerca Genetica, Istituto di Fisiologia Clinica CNR e Fondazione G. Monasterio CNR-RegioneToscana, Pisa e Massa.
Pervenuto il 24 gennaio 2011.
S. Puglinani et al.: Screening genetico di Gata4 e Nkx2,5 nelle cardiopatie congenite
Figura 1. Difetti cardiaci riscontrati nei 5 pazienti analizzati
SP
1 mese
DIV-DIA
DIV-AP
1 mese
DIV; piccolo DIA;
aorta dilatata a cavaliere
7 anni
DIA
Stenosi
Sub-aortica
Analisi genetica
DIA
3 anni
VDDU
TOF
L’anamnesi familiare ha
messo in evidenza una storia
positiva di CC; il padre presenta una stenosi polmonare congenita non trattata (figura 2).
Caso 3: bambino di 7 anni
al quale è stato diagnosticato
un difetto interatriale tipo
ostium secundum con shunt sinistro-destro significativo con
sovvracarico destro. All’ecodoppler è stato possibile osservare un aumento del volume
delle sezioni destre e una turbolenza a livello del tratto di efflusso destro legata all’iperafflusso. Le sezioni sinistre sono
risultate normali.
L’anamnesi familiare ha
evidenziato una storia positiva
di CC in quanto il fratello presenta una stenosi subaortica
(figura 2).
Caso 4: bambina di 3 anni
ricoverata presso il nostro Dipartimento di Cardiologia con
diagnosi di ventricolo destro a
doppia uscita (tipo Fallot) e
con anomalia di decorso della
discendente anteriore. La diagnosi documentava anche la
presenza di una malformazione ano-rettale e di atresia duodenale, subito corretta tramite
intervento chirurgico. L’anamnesi familiare ha rivelato la
presenza di un fratello precedentemente operato di tetralogia di Fallot (figura 2).
Caso 5: donna di 46 anni
giunta presso il nostro ospedale con diagnosi di duplice difetto del setto interatriale sottoposta a procedura di occlusione
del difetto principale. L’anamnesi familiare ha mostrato una
familiarità per CC. La madre è
stata operata per un difetto interatriale nel 1990 e la figlia
ha subìto un intervento correttivo per un difetto interventricolare (figura 2).
Ogni paziente è stato sottoposto ad uno screening genetico dei geni Gata4 e Nkx2.5.
46 anni
DIA
DIV
Figura 2. Albero genealogico della famiglie in cui ricorre la cardiopatia congenita. Il probando è indicato da una freccia ed i familiari affetti sono indicati dal simbolo pieno.
I probandi sono stati sottoposti a sequenziamento genico
dei 7 esoni, di cui il primo non
codificante, del gene Gata4 (figura 3) e dei due esoni del gene
Nkx2,5 (figura 4) e delle vicine
regioni introniche coinvolte nel
meccanismo di splicing. Inoltre, è stata analizzata la regione 3’UTR del gene Gata4 a livello della porzione terminale
dell’esone 7 come descritto precedentemente7,8.
121
122
Recenti Progressi in Medicina, 102 (3), marzo 2011
ATG
1
2
3
4
5
6
3'UTR
7
5'UTR
TAD2
TAD1
ZF1
ZF2
NLS
NH2
COOH
Figura 3. Rappresentazione schematica del gene Gata 4 (TAD1:transcriptional activation domain 1;
TAD2: transcriptional activation domain 2; NLS: nuclear localisation signal; ZF1: N-terminal zinc finger; ZF2: C-terminal zinc finger).
ATG
1
5'UTR
TN
2
HOMEOBOX
3'UTR
NK2
COOH
NH2
Il sequenziamento genico è
stato eseguito mediante l’impiego della piattaforma ad alta processività GenomeLab
GeXP Genetic Analysis System (Beckman). La sequenza
ottenuta è quindi stata confrontata con la sequenza di riferimento ottenibile attraverso un software specifico basato sul programma Gene Bank
BLAST (Basic Local Alignment
Search Tool).
Risultati
Lo screening genetico ha
evidenziato la presenza di molteplici varianti polimorfiche
nelle regioni sia codificanti che
non, e nella regione 3’UTR del
gene Gata4 (tabella 1).
Nell’esone 1 non codificante del gene Gata4 abbiamo riscontrato un polimorfismo (c.543 c>t), presente in due soggetti con una frequenza allelica vicina a quella descritta nella popolazione di controllo.
Figura 4. Rappresentazione schematica del gene Nkx2.5 (TN: tinman domain; Homeobox: homeodomain; NK: nucleotide kinase domain).
Tabella 1. Varianti geniche osservate nel gene Gata4.
Localizzazione
Esone 1 (non codificante)
Variante
nucleotidica
Variante
nuova/nota
MAF
-543 c>t
Nota
0,29
c.1129 a>g S377G
Nota
0,11
IVS 2
-116 t>c
Nota
0,2
IVS 2
-64 g>c
Nota
0,2
IVS 4
-202 c>t
Nuova
IVS 4
-174 t>c
Nota
0,26
IVS 5
+56 c>a
Nota
0,5
3’-UTR
+354 a>c
Nota
0,3
3’-UTR
+426 c>t
Nota
0,5
3’-UTR
+517 c>g
Nota
0,44
3’-UTR
+532 t>c
Nota
0,42
3’-UTR
+563 c>g
Nota
0,34
3’-UTR
+587 a>g
Nota
1
3’-UTR
+852 g>a
Nota
0,3
3’-UTR
+1158 c>t
Nota
0,08
3’-UTR
+ 1256 a>t
Nota
0,3
3’-UTR
+1355 g>a
Nota
0,1
3’-UTR
+1521 c>g
Nota
0,32
Esone 6
MAF: Minor Allele Frequency
S. Puglinani et al.: Screening genetico di Gata4 e Nkx2,5 nelle cardiopatie congenite
In un solo paziente, nell’esone 6, è stato riscontrato
un polimorfismo genetico non-sinonimo a livello dell’aminoacido 377 nella regione carbossi-terminale del gene (c.1130 a>g p.Ser377Gly), che sembra non apportare
alcun cambiamento funzionale nella proteina.
Lo screening genico delle regioni introniche del gene
Gata4 ha evidenziato diversi polimorfismi con frequenze simili a quelle riscontrate nella popolazione di controllo e tutte già precedentemente descritte 7.
Al contrario, è stata osservata una nuova variante genica nell’introne 4 del gene, non riportata in letteratura
(910-202 c>t). Sebbene si tratti di una variante lontana
dal sito di splicing, la sua possibile influenza sulla stabilità dell’mRNA resta da verificare.
Infine, l’analisi della regione 3‘UTR ha portato all’identificazione di un elevato numero di polimorfismi,
già descritti in precedenza con una frequenza allelica
elevata anche nella popolazione di controllo7.
Per quanto riguarda il gene Nkx2,5, il sequenziamento genico ha rilevato la presenza di una sola variante genetica, un polimorfismo nell’esone 1 del gene (c.63 a>g
E21E) in due dei soggetti analizzati. Tale variante non apporta alcun cambiamento aminoacidico nella sequenza, risulta già descritta in letteratura e si presenta con una frequenza elevata anche nella popolazione di controllo9.
Discussione
Nonostante i progressi raggiunti nell’identificazione del ruolo cruciale dei fattori di trascrizione
cardiaci, la patogenesi della maggior parte delle
cardiopatie congenite rimane al momento non definita e rappresenta una priorità di ricerca di rilevante interesse clinico e scientifico.
Ad oggi, infatti, sono state riscontrate molteplici mutazioni a livello dei geni che codificano per
questi fattori, sia nella regione codificante (mutazioni sinonime e/o non-sinonime) e sia nella regione non-codificante, mutazioni che sembrano partecipare allo sviluppo anomalo del cuore8,10.
Il gene Gata4 è uno dei fattori di trascrizione
più precocemente espressi nella differenziazione
dei cardiomiociti e, ad oggi, sono state descritte più
di 67 mutazioni (47 nella porzione codificante e 20
nella regione non codificante del gene) (figura 5).
Le mutazioni con le conseguenze più gravi si localizzano nelle regioni N-terminale e C-terminale,
poiché distruggono la struttura secondaria della
proteina, inibiscono il legame con il DNA e/o alterano l’interazione e la sinergia tra Gata4, Nkx2.5
e Tbx5, fondamentale nelle prime fasi della cardiogenesi per una corretta settazione cardiaca ed
un corretto sviluppo vascolare11.
Altre varianti geniche sono state, invece, riscontrate nella regione 3’ non tradotta (3’UTR) del
gene Gata4, costituita da 1525 pb nella porzione
terminale dell’esone 77.
Il gene Nkx2.5 inizia ad essere espresso nel
cuore fetale intorno al settimo giorno di vita embrionale e continua ad essere espresso nel miocardio degli atri e dei ventricoli durante tutto lo
sviluppo e nella vita adulta (figura 6 alla pagina
seguente).
È risultato, quindi, evidente che Nkx2.5 svolge
un ruolo fondamentale non solo nella differenziazione delle cellule miocardiche nel feto, ma anche
nella vita postnatale12.
La maggior parte delle mutazioni fino ad oggi
descritte su Nkx2.5 interessano l’omeo-dominio e
sono responsabili di una ridotta capacità di legare
il DNA e di una perdita della funzione regolatrice
della proteina13-15.
Nella regione intronica dell’esone 4 del gene
Gata4 è stata identificata una nuova variante genetica, la cui frequenza nella popolazione generale e la cui funzionalità restano da determinare.
L’assenza di mutazioni patogenetiche riscontrata in questi cinque pazienti caratterizzati da
una forte familiarità per CC sottolinea l’estrema
complessità che si cela dietro l’eziologia delle
stesse.
Figura 5. Rappresentazioni schematiche delle mutazioni ad oggi conosciute nel gene GATA4.
123
124
Recenti Progressi in Medicina, 102 (3), marzo 2011
Figura 6. Rappresentazioni schematiche delle mutazioni ad oggi conosciute nel gene Nkx2,5.
Dato l’elevato grado di eterogeneità che caratterizza tali malformazioni, risulta difficile definire la
componente genetica delle CC, sia per l’elevato numero di geni implicati e per le molteplici interazioni tra i vari fattori di trascrizione sia per il fatto che
malformazioni cardiache simili possono originare
da anomalie congenite differenti, e viceversa4.
Inoltre, grande attenzione è stata recentemente focalizzata sul ruolo di altri meccanismi molecolari che possono cooperare con i fattori genetici
nell’eziologia delle CC 16,17.
I nuovi meccanismi eziopatogenetici includono
il ruolo delle mutazioni somatiche e le alterazioni
dei meccanismi post-trascrizionali e, quindi, epigenetici. In particolare, la regolazione post-trascrizionale ad opera di microRNA, processi di metilazione e di acetilazione, sembra svolgere un ruolo chiave nel normale sviluppo cardiovascolare14,18.
La regione 3’UTR, importante sito di legame per
l’RNA messaggero (mRNA), è fondamentale per la
corretta espressione genica sia durante la gametogenesi sia durante lo sviluppo embrionale19,20.
Dal nostro studio è emerso un numero consistente di polimorfismi nella regione 3’UTR del gene Gata4. Questi dati rafforzano l’ipotesi che “varianti comuni” possano avere un ruolo nell’eziopatogenesi della CC17. Infatti, una frequenza diversa di polimorfismi a singolo nucleotide (SNPs) all’interno della regione 3‘UTR, alterando il legame tra i microRNA ed i
loro target, potrebbe influenzare la regolazione dei geni e il rischio individuale di sviluppare la malattia21,22.
Conclusioni
Le cardiopatie congenite rappresentano i difetti alla nascita clinicamente più rilevanti e la principale causa di morte durante il primo anno di vita, nel mondo occidentale.
Inoltre, pazienti adulti dopo intervento chirurgico per la correzione di una cardiopatia congenita sono una popolazione in costante crescita, che si
stima sarà 1,4 milioni entro il 202023. Molti di questi pazienti con CC, quindi, avranno l’opportunità
di riprodursi. È difficile stabilire sulla base delle
conoscenze attuali il rischio di CC nella progenie
di questi adulti operati.
Studi futuri si propongono di migliorare le conoscenze dei difetti genetici e molecolari coinvolti nello sviluppo delle CC e di chiarire il meccanismo con
cui i vari fattori genetici interagiscono tra di loro e
con il quale essi cooperano con fattori ambientali.
Bibliografia
1. Tuscany Registry of Congenital Defects; http://
www.rtdc.it.
2. Hoffman JI, Kaplan S, Liberthson RR. Prevalence of
congenital heart disease. Am Heart J 2004; 147: 42539.
3. Nemer M. Genetic insights into normal and abnormal heart development. Cardiovasc Pathol 2008; 17:
48-54.
4. Olson EN, Srivastava D. Molecular pathways controlling heart development. Science 1996; 272: 6716.
5. Clark KL, Yutzey KE, Benson DW. Transcription factors and congenital heart defects. Annu Rev Physiol
2006; 68: 97-121.
6. Bruneau BG. The developmental genetics of congenital heart disease. Nature 2008; 451: 943-8.
7. Reamon-Buettner SM, Cho SH, Borlak J. Mutations
in the 3’-untraslated region of GATA4 as molecular
hotspots for congenital heart disease (CHD). BMC
Med Genet 2007; 25: 8-38.
8. Zhang W, Li X, Zhong-yuan MA, et al. GATA4 and
NKX2.5 gene analysis in Chinese Uygur patients
with congenital heart disease. Clin Med J 2009; 122:
416-9.
S. Puglinani et al.: Screening genetico di Gata4 e Nkx2,5 nelle cardiopatie congenite
9. Zhang W, Li X, Shen A, Jiao W, Guan X, Li Z. Screening NKX2.5 mutation in a sample of 230 Han Chinese children with congenital heart diseases. Genet
Test Mol Biomarkers 2009; 13: 159-62.
10. Zhang L, Tumer Z, Jacobsen JR, Andersen PS, Tommerup N, Larsen LA. Screening of 99 Danish patients with congenital heart disease for GATA4 mutations. Genet Test 2006; 10: 277-80.
11. Chen Y, Mao J, Sun Y, et al. A novel mutation of GATA4 in a familial atrial septal defect. Clinica Chimica Acta 2010; 411: 1741-5.
12. Thompson JT, Rackley MS, O’Brien TX. Upregolation of the cardiac homeonox gene Nkx2-5 (CSX) in
feline right ventricular pressure overload. Am J
Physiol 1998; 274: H1569-73.
13. Garg V. Insight into the genetic basis of congenital
heart disease cell. Mol Life Sci 2006; 63: 1141-8.
14. Reamon-Buettner SM, Borlak J. Somatic NKX2-5
mutations as a novel mechanism of disease in complex congenital heart disease. J Med Genet 2004; 41:
684-90.
15. Stallmeyer B, Fenge H, Nowak-Gottl U, Schulze-Bahr
E. Mutational spectrum in the cardiac transcription
factor gene NKX2.5(CSX) associated with congenital
heart disease. Clin Genet 2010; 78: 533-40.
16. Lange UC, Schneider R. What an epigenome remembers. Bioessays 2010; 32: 659-68.
Indirizzo per la corrispondenza:
Dott. Maria Grazia Andreassi
Consiglio Nazionale delle Ricerche
Istituto di Fisiologia Clinica
UO Ricerca Genetica
54100 Massa
E-mail: [email protected]
17. Shieh JTC, Srivastava D. Heart malformation: what
are the chances it could happen again? Circulation
2009; 120: 269-71.
18. Cordes KR, Srivastava D, Ivey KN. MicroRNA in
cardiac development. Pediatr Cardiol 2010; 31: 34956.
19. Conne B, Stutz A, Vassalli JD. The 3’ untranslated
region of messenger RNA: a molecular “hotspot” for
pathology? Nat Med 2000; 6: 637-41.
20. Stebbins-Boaz B, Richter JD. Translational control
during early development. Crit Rev Eukaryot Gene
Expr 1997; 7: 73-94.
21. Chen JM, Ferec C, Cooper DN. A systematic analysis of disease associated variants in the 3’ regulatory regions of human protein-coding genes II: the importance of mRNA secondary structure in assessing
the functionality of 3’UTR variants. Hum Genet
2006; 120: 301-333.
22. Chen K, Fengju S, George AC, Qingyi W, Xishan H,
Wei Z. Polymorphisms in microRNA targets: a gold
mine for molecular epidemiology. Carcinogenesis
2008; 29: 1306-11.
23. Deanfield J, Thaulow E, Warnes C, et al. Task force
on the management of grown up congenital heart
disease, European Society of Cardiology; ESC Committee for Practice Guidelines. Eur Heart J 2003; 24:
1035-84.
125