Strumenti e Tecniche di studio in patologia

Strumenti e Tecniche
di studio
in patologia
Gli strumenti della patologia:
• Microscopia
• Biologia molecolare
• Indagini biochimiche
Microscopia Ottica
citopatologia ed istopatologia
citochimica ed istochimica
immunocito(isto)chimica
immunofluorescenza
Microscopia
Elettronica
A trasmissione
A scansione
Campione citologico
• Persa “la geografia spaziale”dell’organo / tessuto, i criteri
diagnostici si basano quasi esclusivamente sulle caratteristiche delle
cellule
– Caratteristiche morfologiche di nucleo e citoplasma
• forma
• colore
• dimensione
– Pattern di aggregazione
cytopath.co.uk
Citologia esfoliativa
cellule esfoliate spontaneamente si ritrovano in:
– Urine
– Espettorato
– Secrezioni
– Versamenti
– Liquor (liquido cerebrospinale)
Citologia per esfoliazione provocata
• Cellule attivamente asportate dalla superficie cutanea, di una
mucosa o di una lesione
Citologia per aspirazione con ago sottile
http://www.vetmed.wsu.edu/resources/Techniques/images/fna_technique.jpg
Campione istologico
Mantenuti “siti, orientamento e rapporti” delle
componenti tessutali prelevate
Anche nelle lesioni che si discostano molto
dall’anatomia dell’organo da cui derivano, è mantenuta
“la geografia spaziale” tra epitelio, stroma, vasi
Fissazione del campione
Quantità di fissativo da utilizzare = rapporto 1:10
…in caso di campioni di grandi dimensioni…
1
Lesioni più
rappresentative
2
Consentire
un’adeguata
fissazione “a cuore”
Attenzione!!!!!
+
Elevato n° di pezzi
Scarsa quantità di fissativo
Ridotta fissazione
Inadeguata fissazione….alterazione della morfologia
cellulare…preparato istologico illeggibile!!!!
Buona fissazione
Scarsa fissazione
Attenzione!!!!!
Tessuti ricchi di sangue (milza, lesioni
emorragiche, ecc.) necessaria la
sostituzione periodica del fissativo
1) Incompleta fissazione
2) Formazione di pigmenti formalinici
Fissazione
Scopi:
1)
Immobilizzazione dei costituenti
cellulari e tissutali
2) Inattivazione enzimi autolisanti
3) Inattivazione batteri
4) Conferimento di stabilità
strutturale ai costituenti chimici
del protoplasma
Fissazione completa dopo 24 ore
Requisiti dei fissativi
• Elevato potere di
penetrazione
• Fissazione uniforme
• NO coartazione tissutale
• Preparazione dei pezzi per
l’inclusione in paraffina
• Compatibilità con numerose
colorazioni istochimiche ed
immunoistochimiche
FISSAZIONE MEDIANTE….
Agenti chimici
Agenti fisici
- congelamento
- calore
- composti organici
- composti inorganici
Fissativi semplici
• Formaldeide
- in commercio al 40% in soluzione acquosa (formalina)
- si usa al 10% (90 volumi di acqua, 10 volumi di
formalina), neutra e tamponata
- assenza di neutralità: produzione di acido formico nella
soluzione (riduzione dell’effetto di fissazione!!!)
Alto grado di penetrazione
No eccessivo indurimento
dei tessuti
No dissoluzione dei lipidi
Immersione per lungo tempo
Formazione di legami a
ponte tra residui di lisina
NO modificazione
importante della struttura
proteica
Pericolosità dei fissativi
Formaldeide:
- Tossica
- Infiammabile
- Irritante
1) Fissazione
2) Disidratazione
3) Chiarificazione
4) Inclusione in paraffina
5) Taglio delle sezioni
6) Colorazione
50 %
etanolo
70 %
etanolo
Dis
95 %
idr
at a
zio etanolo
ne
Tessuto
fresco
Fissazione in
formalina
100 %
etanolo
xylolo
paraffina
Inclusione in paraffina
Taglio
delle sezioni
sezione
vetrino
Colorazione
Identificazione
N° rif. Istologico
Tessuto od organo
Specie animale
Colorazione
Colorazioni cito-istochimiche
- forniscono informazioni sul contenuto e sulla natura
delle sostanze chimiche contenute nelle cellule
(citochimica) o nei tessuti biologici (istochimica)
Alcian
- sfruttano la proprietà di alcuni
reagenti di interagire con specifici
composti chimici contenuti in cellule e
tessuti formando dei prodotti “colorati”
visibili al microscopi ottico
- utilizzabili anche per rilevare la
presenza di alcuni tipi di agenti biologici
all’interno dei tessuti
(es. batteri, funghi, protozoi)
Grocott
Ziehl-Neelsen
Tecniche immunologiche
Visualizzazione di una reazione antigene-anticorpo
mediante l’utilizzo di marcatori
fluorocromi
IMMUNOFLUORESCENZA
Complesso enzima +
substrato cromogeno
IMMUNOISTOCHIMICA
PRINCIPIO DI BASE
Immunofluorescenza
Fluorocromi:
fluoresceina, texas
red, rodamina, ecc.
DIRETTA
INDIRETTA
Immunocitochimica
Immunoistochimica
Enzima
substrato
perossidasi
1)
3)
DAB (3,3diaminobenzidina
tetraidrocloruro)
AEC (3-amino-9etilcarbazolo)
CN (4-cloro-1-naftol)
1)
2)
Fast red
Fast blue BB
2)
Fosfatasi
alcalina
DIRETTA
Preparati citologici o sezioni
istologiche sottoposte a reazioni
immunocito(isto)chimiche portano alla
formazione di un prodotto “colorato”
che può essere analizzato al
microscopio ottico
INDIRETTA
Applicazioni dell’immunoistochimica:
• ricerca di base
• diagnostica routinaria
Esempi in campo diagnostico:
- individuazione di antigeni di agenti patogeni nei tessuti
- discriminazione tra neoplasie di diversa istogenesi
- migliorare la caratterizzazione di neoplasie appartenenti ad uno
stesso gruppo (es. linfomi)
- identificare l’origine di una metastasi di cui non si conosce il
tumore primitivo (per es. marcatori tessuto specifici)
Valutazione di marker prognostici/predittivi nei tessuti neoplastici
PCR - Polymerase Chain Reaction
(Reazione a Catena della Polimerasi)
tecnica in vitro per l’amplificazione esponenziale di una
sequenza di DNA disposta tra due regioni a sequenza nota
l’amplificazione richiede la presenza di primers, ossia
oligoncleotidi a singola filamento complementari alle
estremità della regione a sequenza nota
Consente il reperimento di quantità
anche minime di materiale genetico
(DNA) presente nei campioni inviati
RT (reverse transcription) – PCR:
variante della tecnica PCR che
consente di amplificare una molecola
di DNA partendo da un insieme di
RNA totali estratti da un tipo
cellulare
http://www.gene-quantification.de/block.html
ESEMPI DI APPLICAZIONI DELLA PCR
1. Identificazione di agenti patogeni in campioni biologici
umani o animali, o negli alimenti (virus e batteri )
2. Identificazione di organismi geneticamente modificati
(OGM)
3. Ricerca di farine di origine animale nei mangimi
destinati all'alimentazione del bestiame
4. Analisi del DNA in medicina legale (es. test di
paternità)
5. Diagnosi di malattie genetiche