Strumenti e Tecniche di studio in patologia Gli strumenti della patologia: • Microscopia • Biologia molecolare • Indagini biochimiche Microscopia Ottica citopatologia ed istopatologia citochimica ed istochimica immunocito(isto)chimica immunofluorescenza Microscopia Elettronica A trasmissione A scansione Campione citologico • Persa “la geografia spaziale”dell’organo / tessuto, i criteri diagnostici si basano quasi esclusivamente sulle caratteristiche delle cellule – Caratteristiche morfologiche di nucleo e citoplasma • forma • colore • dimensione – Pattern di aggregazione cytopath.co.uk Citologia esfoliativa cellule esfoliate spontaneamente si ritrovano in: – Urine – Espettorato – Secrezioni – Versamenti – Liquor (liquido cerebrospinale) Citologia per esfoliazione provocata • Cellule attivamente asportate dalla superficie cutanea, di una mucosa o di una lesione Citologia per aspirazione con ago sottile http://www.vetmed.wsu.edu/resources/Techniques/images/fna_technique.jpg Campione istologico Mantenuti “siti, orientamento e rapporti” delle componenti tessutali prelevate Anche nelle lesioni che si discostano molto dall’anatomia dell’organo da cui derivano, è mantenuta “la geografia spaziale” tra epitelio, stroma, vasi Fissazione del campione Quantità di fissativo da utilizzare = rapporto 1:10 …in caso di campioni di grandi dimensioni… 1 Lesioni più rappresentative 2 Consentire un’adeguata fissazione “a cuore” Attenzione!!!!! + Elevato n° di pezzi Scarsa quantità di fissativo Ridotta fissazione Inadeguata fissazione….alterazione della morfologia cellulare…preparato istologico illeggibile!!!! Buona fissazione Scarsa fissazione Attenzione!!!!! Tessuti ricchi di sangue (milza, lesioni emorragiche, ecc.) necessaria la sostituzione periodica del fissativo 1) Incompleta fissazione 2) Formazione di pigmenti formalinici Fissazione Scopi: 1) Immobilizzazione dei costituenti cellulari e tissutali 2) Inattivazione enzimi autolisanti 3) Inattivazione batteri 4) Conferimento di stabilità strutturale ai costituenti chimici del protoplasma Fissazione completa dopo 24 ore Requisiti dei fissativi • Elevato potere di penetrazione • Fissazione uniforme • NO coartazione tissutale • Preparazione dei pezzi per l’inclusione in paraffina • Compatibilità con numerose colorazioni istochimiche ed immunoistochimiche FISSAZIONE MEDIANTE…. Agenti chimici Agenti fisici - congelamento - calore - composti organici - composti inorganici Fissativi semplici • Formaldeide - in commercio al 40% in soluzione acquosa (formalina) - si usa al 10% (90 volumi di acqua, 10 volumi di formalina), neutra e tamponata - assenza di neutralità: produzione di acido formico nella soluzione (riduzione dell’effetto di fissazione!!!) Alto grado di penetrazione No eccessivo indurimento dei tessuti No dissoluzione dei lipidi Immersione per lungo tempo Formazione di legami a ponte tra residui di lisina NO modificazione importante della struttura proteica Pericolosità dei fissativi Formaldeide: - Tossica - Infiammabile - Irritante 1) Fissazione 2) Disidratazione 3) Chiarificazione 4) Inclusione in paraffina 5) Taglio delle sezioni 6) Colorazione 50 % etanolo 70 % etanolo Dis 95 % idr at a zio etanolo ne Tessuto fresco Fissazione in formalina 100 % etanolo xylolo paraffina Inclusione in paraffina Taglio delle sezioni sezione vetrino Colorazione Identificazione N° rif. Istologico Tessuto od organo Specie animale Colorazione Colorazioni cito-istochimiche - forniscono informazioni sul contenuto e sulla natura delle sostanze chimiche contenute nelle cellule (citochimica) o nei tessuti biologici (istochimica) Alcian - sfruttano la proprietà di alcuni reagenti di interagire con specifici composti chimici contenuti in cellule e tessuti formando dei prodotti “colorati” visibili al microscopi ottico - utilizzabili anche per rilevare la presenza di alcuni tipi di agenti biologici all’interno dei tessuti (es. batteri, funghi, protozoi) Grocott Ziehl-Neelsen Tecniche immunologiche Visualizzazione di una reazione antigene-anticorpo mediante l’utilizzo di marcatori fluorocromi IMMUNOFLUORESCENZA Complesso enzima + substrato cromogeno IMMUNOISTOCHIMICA PRINCIPIO DI BASE Immunofluorescenza Fluorocromi: fluoresceina, texas red, rodamina, ecc. DIRETTA INDIRETTA Immunocitochimica Immunoistochimica Enzima substrato perossidasi 1) 3) DAB (3,3diaminobenzidina tetraidrocloruro) AEC (3-amino-9etilcarbazolo) CN (4-cloro-1-naftol) 1) 2) Fast red Fast blue BB 2) Fosfatasi alcalina DIRETTA Preparati citologici o sezioni istologiche sottoposte a reazioni immunocito(isto)chimiche portano alla formazione di un prodotto “colorato” che può essere analizzato al microscopio ottico INDIRETTA Applicazioni dell’immunoistochimica: • ricerca di base • diagnostica routinaria Esempi in campo diagnostico: - individuazione di antigeni di agenti patogeni nei tessuti - discriminazione tra neoplasie di diversa istogenesi - migliorare la caratterizzazione di neoplasie appartenenti ad uno stesso gruppo (es. linfomi) - identificare l’origine di una metastasi di cui non si conosce il tumore primitivo (per es. marcatori tessuto specifici) Valutazione di marker prognostici/predittivi nei tessuti neoplastici PCR - Polymerase Chain Reaction (Reazione a Catena della Polimerasi) tecnica in vitro per l’amplificazione esponenziale di una sequenza di DNA disposta tra due regioni a sequenza nota l’amplificazione richiede la presenza di primers, ossia oligoncleotidi a singola filamento complementari alle estremità della regione a sequenza nota Consente il reperimento di quantità anche minime di materiale genetico (DNA) presente nei campioni inviati RT (reverse transcription) – PCR: variante della tecnica PCR che consente di amplificare una molecola di DNA partendo da un insieme di RNA totali estratti da un tipo cellulare http://www.gene-quantification.de/block.html ESEMPI DI APPLICAZIONI DELLA PCR 1. Identificazione di agenti patogeni in campioni biologici umani o animali, o negli alimenti (virus e batteri ) 2. Identificazione di organismi geneticamente modificati (OGM) 3. Ricerca di farine di origine animale nei mangimi destinati all'alimentazione del bestiame 4. Analisi del DNA in medicina legale (es. test di paternità) 5. Diagnosi di malattie genetiche