Tecnica dipreparazione dei vetrini istologici Cos'è l'istologia? Prof. P. Marco Epidermide di cavallo - C. Ballarin, G. Ra Preparazione del materiale istologico • Problema 1 • I tessuti vanno incontro a fenomeni di degradazione • Problema 2 • La luce può attraversare solo sezioni molto sottili • Problema 3 • La maggior parte dei tessuti sono molli • Problema 4 • I tessuti sono praticamente incolori campione (preparato istologico) Schem a di preparazione di un vetrino Fas della preparazione i • • • • • • • • • • Prelievo del materiale Fissazione 1°Taglio (bisturi) Disidratazione e diafanizzazione Inclusione in paraffina 2°Taglio (microtomo) o Sezionamento Deparaffinatura e Idratazione Colorazione 2a Disidratazione Montaggio Prelievo del materiale • Tipi di prelievo • Strumenti per il prelievo o o o o o o Biopsie escissionali Biopsie endoscopiche Agobiopsie Agoaspirato Reperti chirurgici Reperti autoptici Bisturi Punch per biopsia Aghi per biopsia Pinze per biopsia Raschietti Tamponi rapidi, mat molto fresco, non mag 1 cm diamtero Prelievo del materiale Bisturi Punch per biopsia Prelievo del materiale Aghi per biopsia Prelievo del materiale Pinze per biopsia Fissazione • Scopo della fissazione (pH, T, microrganismi, stress fisici e chimici) FISICA: congelamento rapido del tessuto, immerso in azoto liquido a T: -170 °C disidratazione e inclusione, direttamente al sezionamento. CHIMICA: in funzione dei componenti che s'intende osservare • La fissazione è l’operazione più importante della tecnica istologica • Dalla fissazione dipende la buona riuscita di un preparato istologico perché permette di mantenere inalterata la struttura dei tessuti NO Fissazione • Fissativi coagulanti (denaturano le proteine) – Etanolo (perdita del 95% dei lipidi del campione) – Acido picrico al 2% – Cloruro mercurico al 7% • Fissativi non coagulanti (gelificano le proteine) – – – – • Formaldeide in soluzione al 10% (formalina) Acido acetico 100% Tetrossido d’osmio al 7% (non scioglie i lipidi) Congelamento rapido in azoto liquido Si possono anche utilizzare miscele di più fissativi Fissazione • Caratteristiche dei fissativi • Potere e velocità di penetrazione (natura campione, spessore, 12-24h. Problema: indurimento) • Effetto sui componenti chimici del tessuto – Azione sulle proteine – Azione sui lipidi • Modificazioni del tessuto • Tossicità 1°Taglio, Disidratazione e Diafanizzazione dopo lavaggio • Scopo del 1° taglio - bisturi • Scopo della 1^ disidratazione: spazio alla paraffina (inclusione); meno molle per il taglio • • • • • Etanolo 80% Etanolo 90% Etanolo 95% Etanolo 100% Xilolo (Diafanizzazione). Scopo: rimuovere etanolo (imm paraffina), diafan. 1^ Disidratazione Inclusione • Scopo dell’inclusione: sez sott per attraversare luce. • Paraffina per fissazione chimica, per sezionamento. – Miscela di cere a basso punto difusione contenitori sagomati Inclusione in paraffina Inclusione in paraffina T= 50 °C Inclusione in paraffina Anche resina epossidica (indicata per M.E. sez più sottili), resine idrofile e metacrilati 2° Taglio - Sezionamento • Scopo del 2° taglio: spessore, • • • • Microtomo Microtomo Microtomo Microtomo • Spessore sezioni sottili a slitta a rotazione elettronico congelatore 2–10 m (microscopiaottica) FIX CHIMICA. Sez 5-10 m poi su portaoggetti (criostato) FIX FISICA. T= -20 -45 °C, vetrini raffreddati 2° Taglio microtomo rotativo 2° Taglio 2° Taglio 2° Taglio • Recupero delle sezioni sottili Deparaffinatura e Idratazione • Scopo deparaffinatura: SOLO per Fix chimica • Scopo idratazione: coloranti idrofili. 1. Xilolo per rimuovere paraffina 2. Reidratazione con slz etanolo decrescenti 3. Acqua distillata
