VITAMINA D
E
AUTOIMMUNITA’
A. ANTICO
Produzione di vitamina D2 e vitamina D3
VITAMINA D
gruppo di pro-ormoni liposolubili derivati del
ciclopentanoperidrofenantrene.
due sono le forme principali con attività biologica simile:
radiazione(Dsolare
ultravioletta B
colecalciferolo
3)
(lunghezza d'onda fra 290 e 315 nm)
forma naturale, sintetizzato negli animali dal 7-deidrocolesterolo per
esposizione alla luce del sole
ergocalciferolo (D2)
Deriva da ergosterolo (lieviti e piante), forma sintetica della vitamina D2
utilizzata per vitaminizzare gli alimenti.
Bikle, D. J Clin Endocrinol Metab 2009
Copyright ©2009 The Endocrine Society
VITAMINA D
D2 + D3
25-idrossilasi epatiche
CYP27A1
CYP2R1
CYP3A4
calcifediolo - 25(OH)D3
CYP2J3
§anche in altri tessuti come paratiroide rene, e nei
cheratinociti è stata dimostrata l’attività delle 25idrossilasi.
REGOLAZIONE SISTEMA ORMONALE
VITAMINA D
Meccanismo di trasporto
1alfa-idrossilazione renale
calcitriolo
Interazione con il recettore specifico
calcifediolo
Dusso AS et al. Am J Physiol Renal Physiol 2005
MECCANISMO DI TRASPORTO
Vitamin D Binding Protein (DBP)
glicoproteina circolante
5% dei siti di legame accolgono vit D e i suoi metaboliti
svolge un ruolo di tamponamento dei livelli ematici di vit D con
sottrazione della stessa dal catabolismo e/o dall’azione
Megalina
è localizzata nel tubulo renale prossimale
riassorbe il complesso 25(OH)D-DBP filtrato dal rene
conserva i livelli circolanti di 25(OH)D
favorisce l’attivazione dello stesso da parte di 1-alfa idrossilasi
renale
Ruolo della Megalina e DBP-3 intracellulare nella consegna e
idrossilazione di 25(OH)D
• 25(OH)D legato alla DBP è filtrata dal rene e captata dalle cellule dei tubuli
prossimali attraverso endocitosi Megalina mediata.
•La DBP è degradata e 25(OH)D rilasciato è consegnato a 1 alfa-idrossilasi da
IDBP-3 o reimmesso in circolazione legato a DBP
Dusso AS et al. Am J Physiol Renal Physiol 2005
BIOATTIVAZIONE VITAMINA D
1α-idrossilasi renale garantisce il ristretto range di concentrazione
normale del calcitriolo: è controllata da
regolatori positivi
ipocalcemia
restrizione dietetica di fostati
PTH
Calcitonina
GH
IGF1
regolatori negativi
fibroblast growth factor 23 (FGF 23)
frizzled-related protein 4 (FRP-4)
matrix extracellular phosphoglycoprotein (MEPE)
prodotto del gene Klotho
1,25(OH)2D3
BIOATTIVAZIONE VITAMINA D
Dusso AS et al. Am J Physiol Renal Physiol 2005
BIOATTIVAZIONE VITAMINA D
Siti di produzione extrarenale di 1,25(OH)2D
Colon
Cellule dendritiche
Cellule endoteliali
Cervello
Ghiandola mammaria
Insule pancreatiche
Ghiandole paratiroidee
Placenta
Prostata
Cute
•
•
il gene che controlla l’espressione e l’attività di 1α-idrossilasi negli altri tessuti
o cellule è identico a quello renale (locus cromosomiale 12q13.1-q13.3)
in essi l’enzima è regolato molto diversamente in base alle funzioni
autocrine/paracrine di 1,25(OH)2D3 prodotto localmente
BIOATTIVAZIONE VITAMINA D
l’espressione e attivazione di 1α-idrossilasi
extrarenale
9 è controllata da fattori locali (citochine e fattori di crescita)
9 Nei macrofagi è stimolata da INFgamma, LPS e infezioni virali.
9 Nelle DC è associata allo stadio di maturazione delle stesse cellule.
9 nei macrofagi e in DC non è soggetta a un feedback negativo
1,25(OH)2D3 -mediato
La sintesi di 1,25(OH)2D3 dipende dai livelli dei
precursori circolanti
Sistema endocrino della Vitamina D
Norman, A. W Am J Clin Nutr 2008
Distribuzione tessutale di VDR
1. Adiposo
2. Surrene
3. Osso
4. Midollo osseo
5. Cervello
6. Ghiandola mammaria
7. Cellule neoplastiche
8. Cartilagine
9. Colon
10. Ovaio
11. Epididimo
12. Follicolo pilifero
13. Intestino
14. Rene
15. Fegato
16. Polmone
17.
18.
19.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
Linfociti T e B
Muscolo cardiaco
Muscolo embrionale
Osteoblasto
Cellule pancreatiche β
Ghiandole paratiroidee
Parotide
Ipofisi
Placenta
Prostata
Retina
Cute
Stomaco
Testicolo
Timo
Tiroide
Utero
INTERAZIONE COL RECETTORE SPECIFICO: VDR
Gli effetti biologici di 1,25(OH)2D3 sono mediati da VDR: appartiene
alla superfamiglia dei recettori ormonali nucleari modulanti
l’espressione genica delle cellule bersaglio
È composto da una singola catena polipeptidica di 427 aa e 3 domini funzionali:
¾ C-terminale che lega l’ormone
¾ La parte DNA legante
¾ N-terminale per i processi di trascrizione
Dusso, A. S. et al. Am J Physiol Renal Physiol 2005
Legame VDR-1,25(OH)2D3
Dusso, A. S. et al. Am J Physiol Renal Physiol 2005
BIOAZIONI GENOMICHE NON CLASSICHE
Inibizione della crescita cellulare
Regolazione dell’apoptosi
Controllo della differenziazione cellulare
Prevenzione della trasformazione neoplastica
Controllo del sistema renina-angiotensina
Controllo della secrezione dell’insulina
Controllo della funzione muscolare
Controllo del sistema nervoso
Modulazione della risposta immune
Legame VDR-1,25(OH)2D3
Norman A W Endocrinology 2006
Aspetti strutturali di 1,25(OH)2D3
Norman A W Endocrinology 2006
MODULAZIONE DELLA RISPOSTA IMMUNE
1,25(OH)2D3 agisce
interferendo su fattori di trascrizione nucleare NF-AT e NF-kB
direttamente legandosi a elementi che rispondono alla Vitamina D
(VDRE) nelle regioni promotrici dei geni delle citochine
Esercita effetti prodifferenziativi su:
Antigen Presenting Cells (APC)
Cellule dendritiche
monociti
macrofagi
Linfociti T e B
Cellule NK
REGOLAZIONE DELLA RISPOSTA IMMUNE
immunità innata
La risposta immune innata coinvolge l’attivazione di Toll Like Receptor (TLR)
nei PMN, monociti, macrofagi, nelle cellule epiteliali (epidermiche, gengive,
intestino, vagina, vescica e polmone)
L’attivazione di TLR induce la produzione di peptidi antimicrobici, la
catelicidina e molecole O2 reattive che uccidono il microrganismo
L’espressione di catelicidina è indotta da 1,25(OH)D sia nelle cellule della
linea mieloide sia nelle cellule epiteliali
Bikle, D. J Clin Endocrinol Metab 2009
REGOLAZIONE DELLA RISPOSTA IMMUNE
immunità adattativa
Induzione di DC “tolleranti” che aumentano Treg
CD4+ CD25+ Foxp3 e inibiscono Th1/Th17
APC (monociti, macrofagi, cellule dendritiche)
•Arresto differenziazione e maturazione delle DC e loro capacità di produrre mediatori
proinfiammatori (IL-12p40 che eterodimerizza per formare sia IL-12 sia IL-23 )
•Aumento secrezione IL-10 e espressione ILT3
•Soppressione dell’espressione delle molecole MHC di classe II su APC
•Soppressione dell’espressione delle molecole costimolatorie (CD40,CD80, CD86)
REGOLAZIONE DELLA RISPOSTA IMMUNE
immunità adattativa
Linfociti T
•Inibizione della proliferazione
antigene-stimolata dei Th1 e
La sintesi attiva didella
1,25
(OH)di2D
secrezione
citochine
di
3
tipo Th1 (,IFN-γ,IL-2) IL-12, e
IL-17 da parte di Th17
Modula funzione •eAumento
fenotipo
di APC di
della produzione
IL-4, IL-5, IL-10 e dello
sviluppo di Th2 attraverso un
Inibisce lo sviluppo
dei Th1
effetto diretto su CD4+ nativi
•Aumento della frequenza dei
Induce Treg e T Treg
NK
Induce Treg e T NK
Linfociti B
Induzione di apoptosi e
inibizione di proliferazione,
generazione di B memoria,
differenziazione in
plasmacellule e produzione di
immunoglobuline
T NK
Stimolazione delle funzioni
regolatorie
Cutolo, M. Rheumatology 2008
Livelli decisionali
1,25(OH)2D3, forma attiva dell’ormone, non è il composto ideale
da dosare per valutare lo stato della vitamina D:
livelli circolanti circa mille volte più bassi di quelli di 25(OH)D3
vita media di sole 4-6 ore
carenza di vitamina D aumenta i livelli di PTH che normalizza i
livelli 1,25(OH)2D3, rendendo il dosaggio inutile per valutare lo
stato della vit D
25(OH)D3 è il metabolita usato per stabilire lo stato della
vitamina D:
È la forma circolante più predittiva in quanto non attiva e
scarsamente regolata
ha una emivita di circa 2-3 settimane
Livelli decisionali 25(OH)D
< 20 ng/mL : carenza
20 – 30 ng/mL : insufficienza
> 30 ng/mL : valori auspicabili
Sono stabiliti sulla base dell’osservazione che:
L’assorbimento del calcio intestinale nelle donne in menopausa è
massimo se si portano i livelli di 25(OH)D a 32ng/mL
La concentrazione di PTH negli adulti raggiunge il nadir quando i
valori di vitamina D sono > 32ng/mL
I bambini hanno lo stesso fabbisogno degli adulti
L’intossicazione da vitamina D si definisce la concentrazione > 150
ng/mL associata a ipercalcemia, ipercalciuria e spesso iperfosfatemia
Holick MF, Chen TC, Am J Clin Nutr 2008
Test clinici per il dosaggio di 25(OH)D
“If the medical community is to make progress in
correcting widespread hypovitaminosis D, 25OHD
measurement must be standardized.”
Binkley N et al, J Clin Endocrinol Metab 2004
Alto grado di variabilità tra metodi e tra
laboratori che usano lo stesso metodo dovute
alle diverse tecnologie utilizzate, alcune delle quali prevedono
purificazione del campione prima della quantificazione finale
alla mancanza di materiali di riferimento su cui realizzare la
standardizzazione
Roth HJ et al, Ann Clin Biochem 2008
Test clinici per il dosaggio di 25(OH)D
Radioimmunoassay (RIA)
Cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC)
Cromatografia liquida-spettroscopia di massa (LC-MS)
Chemiluminescenza (CLIA)
Enzyme ImmunoAssay (EIA)
HPLC è considerato un metodo di riferimento ma è
indaginoso e scarsamente standardizzato
LC-MS si sta affermando come procedura
standardizzata, strumento costoso, procedura richiede
tempi lunghi
CLIA e EIA sono i più utilizzati nei laboratori di medie
dimensioni
Assay method on LIAISON (CLIA)
25 OH Vitamin D TOTAL è un CLIA per
la determinazione quantitativa di 25(OH)D
Metodo diretto, competitivo
• 1st incubation, 10’
25 OH Vitamin D è dissociata da DBP e si lega ad
uno specifico anticorpo in fase solida
• 2nd incubation, 10’
Tracer 25 OH vitamin D è aggiunto legato a isoluminolo
Gli anticorpi policlonali usati sono gli stessi impiegati per the DiaSorin RIA
assays, la specificità anticorpale è simile
Il totale riconoscimento dei metaboliti idrossilati D2 and D3 assicura un
reale follow-up per la terapia
“The 25 OH Vitamin D antibody shows no reactivity to the 3-epi form of
25 hydroxyvitamin D3 “
Singh RJ et al, J Clin Endocrin Metabol 2006
L IA IS O N 2 5 O H V ita m in D T o ta l (n g /m L
Correlazione con RIA
160
A total of 109 samples was
tested by LIAISON® 25 OH
Vitamin D TOTAL and by a
radioimmunoassay
method
(RIA).
The resulting regression
equation was:
140
120
100
80
60
LIAISON® = 1.19 (RIA) +
0.31;
R = 0.95.
40
20
0
0
20
40
60
80
RIA (ng/mL)
100
120
140
Carenza di Vitamina D
Aumenta l’insorgenza e la
mortalità per cancro
Garland CF et al. Am J Public Health 2006
Aumenta l’insorgenza di
malattie cardio-vascolari
Krause R et al. Lancet 1998
Aumenta il rischio di sviluppare
disturbi del SNC
McGrath J et al. Schizophr Res 2002
Aumenta il rischio di insorgenza
di malattie autoimmuni
Ponsonby AL et al. Toxicology 2002
Carenza di Vitamina D e MAI
aumentato rischio per Diabete tipo I, S. M., A.R., LES
-
Stene LC et al, Diabetologia 2000
Ponsonby A et al, Toxicology 2002
Bambini trattati con vitamina D nel primo anno di vita,
seguiti per 31 anni, mostrano una riduzione di
insorgenza di Diabete tipo I del 78% rispetto a
coetanei non trattati
-
Hypponen E et al, Lancet 2001
Donne trattate con > 400 UI di vitamina D/die
mostrano una diminuzione del rischio di sviluppare S.M.
e A.R. > 40%
-
Munger KL et al, Neurology 2004
Merlino LA et al, Arthritis Rheum 2004
Diabete autoimmune tipo I
macrofagi e T citotossici CD8+ regolati dai Th1 IL-12 dipendenti
•1,25 (OH)2D3 da sola riduce l’incidenza dell’insulite
e previene lo sviluppo del Diabete se somministrata
ai topi NOD da 3 settimane di età;
• a 8 settimane è efficacie solo associata a IS
Mathieu C et al, Academic Press 1997
NOD
Analogo 1,25(OH)2-16,23Z-diene-26,27-6fluoro-19-nor D3
(BXL-219) capace da solo di bloccare il decorso
della malattia diabetica nei NOD adulti per la sua
aumentata stabilità metabolica:
arresta la maturazione di DC
inibisce la produzione di IL-12 e l’infiltrazione Th1
aumenta la frequenza dei Treg nei linfonodi pancreatici che inibisce la risposta Th1 vs IA-2
ristabilisce la capacità di Th1 di rispondere ai segnali che inducono apoptosi
Gregori G et al, Diabetes 2002
arresta la progressione immunologica e previene l’insorgenza clinica del Diabete sopprimendo la
produzione di chemochine da parte delle cellule beta capaci di richiamareTh1 effettori nelle
insule pancreatiche
Giarratana et al, J Immunol 2004
GASTRITE AUTOIMMUNE
Th-1 effettori patogenetici CD4+ CD25riconoscono un epitopo sulle subunità
dell’ATPase
Hanno capacità citolitiche, perforina e FasFas ligando mediate, regolate da restrizione
genica MHC indotta
Causano citolisi e apoptosi di APC: le cellule
parietali possono agire come APC (aumento
molecole MHC, espressione CD 80 CD86)
Stimolano la produzione di autoanticorpi da
parte dei B presenti nella mucosa
D’Elios MM, Gastroenterol 2001
GASTRITE AUTOIMMUNE
Rilascio di ATPase nel turn-over cellulare
Disegno dello
studio:
molecolare tra Hp e ATPase
? Mimetismo
e/o spreading epitopico
Determinare la prevalenza dello stato di 25(OH)D nei
pazienti con GAI diagnosticata istologicamente
ATPase
ATPase
confrontarlo con 25(OH)D di una popolazione
di
B cells
riferimento delineata
sulla nostra realtà
MHC
ATPase
T cells
25(OH)D di
pazienti
confrontarlo con
patologie gastriche correlate
Anti ATPase
che presentano
FI
B cells
Anti-FI
Metodo indiretto di Kairisto
•Modello statistico per la stima dell’intervallo di riferimento che elabora dati
derivanti da soggetti non “di riferimento” ipotizzando che gran parte dei
fino a 50
risultati provenienti da pazienti non ricoverati derivano da accertamenti di
Orig. distr.
tutti
Femmine
Maschi
>50 anni
anni
screening e si riferiscono a individui senza patologia correlata
Observations: 36384
29401
6983
5157
31227
•Rappresenta
un approccio
stima dell’intervallo
di 20,75
Mean:
21,30 interessante
21,27 nella21,24
24,35
riferimento quando è possibile utilizzare campioni molto numerosi
SD:
12,76
12,44
14,13
13,74
12,52
Lower ref.
Vantaggi4,9
limit:
5,3
5,3
6,4
5,2
Underl.
•Lapercentile:
procedura è semplice
2,72%ed economica
2,70%
2,52%
2,59%
2,69%
Upper ref.
•I limiti
da dati ottenuti
47,4 nelle stesse
40,3 condizioni
44,5preanalitiche,
41,7 con
limit: sono derivati 45
le stesse
Underl.modalità analitiche e nella stessa popolazione in cui saranno utilizzati
percentile:
97,50%
97,50%
97,54%
97,54%
97,53%
•È possibile ripartire i risultati sulla base di variazioni biologiche (età, sesso …)
Metodo indiretto di Kairisto
Distribuzione di riferimento
36.384 osservazioni
Cittadella (PD) 45,39°
Vicenza
45,33°
Latisana
45,47°
Udine
46,04°
Lower ref. limit: 5.42 Underl. percentile: 2.70
Upper ref. limit: 43.78 Underl. percentile: 97.5
Mean: 21,78
SD: 13.12
45.0
40.0
90%
35.0
Vit. D ng/mL
30.0
75%
25.0
Media %
20.0
50%
15.0
10.0
25%
5.0
10%
0.0
tutti
percentili
90%
75%
50%
25%
10%
tutti
36,0
26,6
17,1
8,7
3,0
Femmine
Maschi
fino a 50 anni
Femmine Maschi fino a 50 anni
35,8
37,0
40,4
26,6
26,6
31,2
17,3
16,5
21,0
8,8
8,3
12,9
3,0
3,0
7,4
>50 anni
>50 anni
35,1
25,9
16,5
8,1
3,0
Gruppo di controllo
Range età
(n soggetti)
patologia
Media
(ng/mL)
DS
(ng/mL)
Media
percentile
67.1%
< 10 anni
(49)
controllo
22.9
11.3
20-40 anni
(79)
Controllo
25,3
12,2
19.5
14.7
40-80 anni
(84)
Controllo
Controllo
20-80 anni
Nessuna
(163) terapia e/o
malattia
21.3 metabolica
12.2
Soggetti “living indoor”
Paratormone nei limiti di norma
73.5%
58.0%
62.9%
100.0%
90.0%
80.0%
rachitsmo
percentili
70.0%
osteoporosi
60.0%
50.0%
40.0%
30.0%
20.0%
10.0%
0.0%
< 10 anni
età
1
< 10 anni
2
20-40
3
40-80
4
20-80
20-40
40-80
20-80
Media ± DS
ng/mL
Media
percentile
da
a
22.9 ± 11.3
25.3 ± 12.2
67.1%
35.3%
89%
73.5%
39.6%
92%
19.5 ± 14.7
21.3 ± 12.2
58.0%
10.0%
89%
62.9%
27.2%
88%
Casistica Cittadella
concentrazione media vitamina D
Range età
(n soggetti)
patologia
Media
(ng/mL)
DS
(ng/mL)
Media
percentile
20-80 anni
(163)
Controllo
21,3
12,2
62.8%
20-80 anni
(54)
Flogosi
linfocitaria
aspecifica
22,2
13,5
37-80 anni
(42)
Gastrite
autoimmune
APCA +
65.4%
40%
tiroide
21% Hp+
9,8
5,6
29.5%
20-80 anni
(21)
Gastrite
atrofica
multifocale
11.03
8,4
34.3%
100.0%
90.0%
80.0%
percentili
70.0%
60.0%
50.0%
40.0%
30.0%
20.0%
10.0%
0.0%
control
APCA+
GAI
HP+
patologia
media ± DS
ng/mL
Media
percentile
da
a
controllo (20-80)
21.3 ± 12.2
62.9%
27.2%
88%
Apca+ (20-80)
22.2 ± 13.5
65.4%
26.0%
91%
GAI (37-80)
9.8 ± 5.6
29.5%
11.6%
46%
Gastrite Hp+ (20-80)
11.3 ± 8.4
34.3%
10.0%
59%
Interazioni batterio-ospite nella patogenesi
dell’infezioni da H. pylori
VITAMINA D
La vitamina D, liposolubile, viene inglobata nelle
micelle formate dall'incontro dei lipidi idrolizzati
con la bile, entra nell'epitelio intestinale per
diffusione passiva dove viene incorporata nei
chilomicroni i quali entrano nella circolazione
linfatica.
La quantità di calciferolo proveniente dagli alimenti
è molto bassa e la maggior parte di vitamina D viene
sintetizzata a livello cutaneo per azione della luce
ultravioletta.
CONCLUSIONI
Holick M F Mayo Clin Proc. 2006
CONCLUSIONI
La concentrazione media di 25(OH)D nella
nostra popolazione selezionata è 21.3 ng/mL
(63% percentile)
La concentrazione media di 25(OH)D nei
pazienti con gastrite autoimmune è 9.8
ng/mL (30% percentile)
La concentrazione media di 25(OH)D nei
pazienti con gastrite da Hp è 11.3 ng/mL
(34% percentile)
Ipotesi speculativa
Soggetti geneticamente predisposti con Carenza/insufficienza cronica
AZIONE
Standardizzazione metodi
livelli di 25(OH)D necessari
per l’omeostasi immunologica
negli adulti e bambini
Vitamina D repleting
Previene aggressione
Aggressione autoimmune
AZIONE
Sperimentazione degli agonisti
di VDR nell’uomo
Vitamina D repleting
Non blocca aggressione
Malattia autoimmune
PROBLEMI APERTI?
RINGRAZIAMENTI
Davide Giavarina
Antonio Fortunato
Giuliano Soffiati
Graziano Kodermaz
RINGRAZIAMENTI
professione….. Amici
