Multiplex Real-Time RT-PCR

Protocollo di
Real-Time RT-PCR
per la diagnosi del fitoplasma della
Moria del Pero
Claudio Ratti, Chiara Lanzoni e Carlo Poggi Pollini
Moria del pero
(Candidatus Phytoplasma pyri)
Fitoplasmi:
Microrganismi procarioti
unicellulari che, a differenza dei
batteri, non possiedono pareti
cellulari e che si possono
sviluppare esclusivamente su
tessuto vivo d’un ospite.
Genoma a DNA:
cromosoma relativamente piccolo
(530-1200 kbp)
Genoma virale: 1,8-350 kbp
E. coli: 4.000 kbp
- Diagnosi molecolare
Basata sulla sintesi della catena complementare di DNA ad
opera di un’enzima (la polimerasi) in una reazione a catena (PCR
= polymerase chain reaction).
1955 A. Kronembreg e coll.
(Stanford University)
Scoperta della DNA-polimerasi cellulare
primers
DNA da amplificare
DNA polimerasi
DNA polimerasi
primer
Nucleotide
(dNTP)
1983 Kary.B. Mullis utilizzò la DNA polimerasi in una
reazione di polimerizzazione ciclica: la PCR
Premio Nobel per la Chimica nel 1993.
APERTURA
DOPPIA
ELICA DEL
DNA
LEGAME
DEI
PRIMERS DI
INNESCO
DUPLICAZIONE
DEL DNA
STAMPO
IL MECCANISMO DELLA PCR:
GLI STEP DELLA PCR:
1) Denaturazione a
94°C
2) Appaiamento dei
primers a 50-60°C
3) Estensione a
72°C
Amplificazione esponenziale
Per una PCR di 35 cicli:
34 miliardi di copie
ELEMENTI NECESSARI PER LA REAZIONE DI
AMPLIFICAZIONE
Primers
DNA polimerasi
Desossi Nucleotidi trifosfati
(dNTP)
Base Azotata
(Adenina, Timina,
Citosina, Guanina, Uracile)
DESOSSIRIBOSIO
DNA STAMPO
LA REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI
(POLIMERASE CHAIN REACTION)
GLI «INGREDIENTI» FONDAMENTALI DELLA PCR:
Primers:
corte sequenze di DNA complementari alle 2
estremità del framento da amplificare
dNTPs (dATP,dGTP,dCTP,dTTP):
nucleotidi trifosfati,
‘mattoni’ per costruire i nuovi filamenti
Taq polimerasi
(buffer, MgCl2):
enzima (DNA polimerasi) che compie la reazione
DNA stampo:
Squenza bersaglio
PCR
(reazione a catena della polimerasi)
Per i virus il cui genoma è costituito da RNA, si utilizza la
trascrittasi inversa, che consente la sintesi di un primo filamento di
DNA (cDNA) sul quale si innesca la reazione a catena della
polimerasi
Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction
(RT-PCR)
Bassa concentrazione del Fitoplasma nella pianta:
NESTED – PCR (nPCR)
 aumento della sensibilità, riduzione degli inibitori
5’
3’
- DNA TARGET
-
Primo step:
Primers Esterni
I AMPLIFICATO
Secondo Step:
Primers Interni
II AMPLIFICATO
RIVELAZIONE ED ANALISI DEL PRODOTTO DI AMPLIFICAZIONE
Nested-PCR
 Tecnica molto sensibile ma può presentare diverse
limitazioni, in particolare nell’esecuzione di saggi su
larga scala:
 molto laboriosa con alto dispendio di tempo;
 rischio di contaminazioni molto elevato.
Multiplex Real-Time PCR
Real-Time PCR: Caratteristiche
 È possibile monitorare in ogni istante la cinetica della reazione di
PCR mediante il rilevamento di una fluorescenza
Si riesce a misurare l’amplificazione in tempo reale durante la fase esponenziale
della PCR, quando cioè l’efficienza di amplificazione è influenzata
minimamente dalle variabili di reazione, permettendo di ottenere risultati
quantitativi molto più accurati rispetto alla PCR tradizione “end point”.
Real-Time PCR: Caratteristiche
Rilevamento della fluorescenza associata
all’amplificazione
Il prodotto di PCR non viene analizzato su gel di
agarosio
Analisi del prodotto di fluorescenza tramite computer
Bioneer
LightCycler
Roche
LightCycler® 480 System
Roche
iQ5 Real-Time PCR Detection System
Bio-Rad
7700
Applied Biosystems
Mx4000® Multiplex
Quantitative PCR System
STRATAGENE
Real-time nucleic acid detection system
7900HT Fast Real-Time PCR System
Applied Biosystems
ABI PRISM 7000 SDS Applied
Biosystem
Mx3000P® QPCR System
STRATAGENE
Real-Time PCR: Caratteristiche
Baseline → il segnale di fluorescenza è accumulato ma è al di sotto del limite di
rilevazione dello strumento
Linea soglia → linea che interseca tutte le curve di amplificazione dei campioni
all’inizio delle fase esponenziale
Ciclo soglia (CT) → è la frazione di ciclo in cui la fluorescenza emessa attraversa
la linea soglia
Il valore che assume è INVERSAMENTE PROPORZIONALE alla
quantità iniziale di DNA
Rn indica la fluorescenza relativa calcolata dal software: Rnf - Rnb
Classificazione chimiche di rilevazione
 Quasi tutti gli attuali sistemi Real Time PCR sono basati sull’emissione di un segnale
di fluorescenza direttamente proporzionale alla quantità di amplicone formato.
 Sistemi basati su molecole leganti il doppio filamento di DNA:
•Etidio Bromuro
•SYBR Green
•BOXTO
 Sistemi basati sull’idrolisi di sonde
• TaqMAN
 Sistemi basati su primer o sonde marcate:
• Molecular Beacon
• Scorpion Primer
• LUX Primer
• Simple probe
• FRET hybridization probes
• Plexor Technology
TaqMAN
CARATTERISTICA: presenza sonda.
–
–
–
–
–
Oligonucleotide di circa 14-18 bp
Ibridazione lungo la sequenza bersaglio
Reporter al terminale 5’ e Quencher al terminale 3’
Il terminale 3’ non può essere esteso dalla Taq Polimerasi
Temperatura di dissociazione circa 10°C più elevata
rispetto alla coppia di primer usati nella reazione
TaqMAN
Forward primer
Taq
Taq Polimerasi
Probe
R
Q
Reverse primer
From PacMan to TaqMan - a computer game revisited
The TaqMan process is based on the PacMan principle - a computer game introduced more than twenty years ago.
http://www.vetscite.org/issue1/tools/leute_2_0800.htm
Estrazione degli acidi nucleici
Estrarre gli acidi nucleici del fitoplasma + acidi nucleici della
pianta dai tessuti vegetali
Protocollo CTAB
Protocollo SPOT
Omogeneizzazione di 1 gr. di nervature con sabbia e
tampone Dellaporta (grinding buffer)
Centrifugazione a 4000rpm per 5 min a 4°C
Centrifugazione del sopranatante a 11000rpm per 25
min a 4°C
Risospensione pellet in tampone di estrazione Doyle &
Doyle, trasferimento in tubo Eppendorf e incubazione a
60°C per 30 min.
Protocollo di estrazione
CTAB
(5 h)
Aggiunta di cloroformio:alcol isoamilico (IAA) (24:1) e
centrifuga a 6000rpm per 5 min a RT
Precipitazione fase acquosa con 1 vol. di isopropanolo
freddo a -80°C per 15 min.
Centrifugazione a 13000rpm per 15 min a 4°C
Lavaggio del pellet con etanolo 70% e precipitazione
con sodio acetato (NaOAc) e etanolo assoluto a -80°C
per 10 min.
Centrifugazione a 13000rpm per 15 min a 4°C
Lavaggio del pellet con etanolo 70% e risospensione
con 100μl di acqua distillata sterile trattata con DEPC
(dietilpirocarbonato)
Macinare 1gr di floema in 5 mL di Tampone di estrazione
Caricare 5 uL di ogni campione omogeneizzato su dischetti
di nylon e asciugare
Protocollo di estrazione
Aggiungere 100 uL di buffer di risospensione
SPOT
(15 - 20 min)
Denaturare10 min a 95 C
Centrifugare le strip almeno 2 min.
Prelevare 2 uL e aggiungerli alla mix di Real Time.
Sonde TaqMAN - PD
Sonde e primers specifici per il fitoplasma della
Moria del Pero sono stati disegnati su una zona
variabile del gene 16S rDNA, utilizzando il
software Primer Express 2.0 (Applied Biosystem).
Controllo endogeno: primers e sonda disegnati
sul gene che codifica per la sub-unità 18S.
Marcate con due fluorocromi differenti
all’estremità 5’, per poterle usare simultaneamente
nella reazione.
Real-Time PCR: PCR singola
PD
18 S
Real-Time PCR: PCR “duplex”
PD + 18S
Come ottimizzare la sensibilità della
diagnosi
• Diagnosi classica: amplificazione DNA del
Fitoplasma (nPCR, Real-Time PCR…)
• Il Fitoplasma (DNA) ha una bassa concentrazione
nella pianta.
• Il Fitoplasma produce un alto numero di copie di
RNA durante la propria moltiplicazione.
• L’RNA è indice di attività metabolica del
Fitoplasma
• Amplificare anche l’RNA del Fitoplasma per
aumentare la sensibilità della diagnosi
DNA vs. RNA in protocollo CTAB
DNA vs. RNA in protocollo SPOT
RT-PCR vs. PCR in protocollo CTAB
RT-PCR vs. PCR in protocollo SPOT
Multiplex Real-Time PCR: conclusioni
 Alta specificità
 Alta sensibilità
 Riproducibilità dei risultati
Multiplex Real-Time RT-PCR:
 Sistema “chiuso”: rischio di contaminazione molto
limitato e assenza di falsi positivi
 Saggi molto rapidi: circa 1/4 del tempo richiesto
dai protocolli classici di nested-PCR
 Presenza del controllo endogeno (18 S) rende il
metodo più affidabile: assenza di falsi negativi
 La SPOT Real-Time RT-PCR risulta la tecnologia
ideale da applicare alla diagnosi del fitoplasma
della Moria del Pero, in particolare per analisi su
larga scala