Descrizione tecnica dell`analisi

RELAZIONE TECNICA
Diagnosi molecolare di Fibrosi Cistica:
Analisi di mutazione del gene CTFR
Che cosa è la Fibrosi cistica?
LA Fibrosi cistica (FC) è una grave malattia ereditaria, cronica, evolutiva; un bambino ogni 2700
nasce con questa malattia. Nei pazienti affetti da FC le secrezioni delle ghiandole esocrine (cioè i
liquidi biologici come il muco, il sudore, la saliva, lo sperma, i succhi gastrici) sono molto più densi
e viscosi del normale. I problemi più gravi sono a carico dei polmoni, dove il muco estremamente
denso può causare problemi respiratori ed infezioni. Anche i succhi pancreatici sono più densi del
normale, causando problemi digestivi. Infine, i pazienti affetti da FC sono scarsamente fertili, a
causa dell'eccessiva densità del loro liquido spermatico e delle secrezioni vaginali. La malattia si
manifesta per lo più entro i primi anni di vita, talora più tardivamente, e può esprimersi con
maggiore o minore gravità in individui diversi. Pertanto viene tratta con terapie che variano da
soggetto a soggetto, costituite per lo più da fisioterapia, antibiotici, aerosolterapia, estratti
pancreatici e vitamine. Il decorso e la prognosi della FC sono notevolmente migliorati negli ultimi
decenni, sopratutto per i pazienti diagnosticati precocemente. Nonostante ciò, allo stato attuale la
guarigione non è possibile e la durata media della vita è comunque ancora ridotta rispetto a quella
della popolazione generale.
Come si trasmette la FC?
La FC è una malattia che si trasmette con modalità autosomica recessiva, determinata da alterazioni
del DNA, chiamate "mutazioni", che insorgono in entrambe le copie del gene CFTR (Cystic
Fibrosis Transmembrane Regulator). I geni vengono ereditati in coppie, derivando uno dal padre e
uno dalla madre. Negli individui malati entrambe le copie del gene per la FC sono alterate. Gli
individui che possiedono una sola copia del gene alterato e una normale sono invece privi di ogni
sintomo, ma sono portatori sani. I bambini malati di FC potranno nascere solo se entrambi i genitori
sono portatori sani. Due genitori portatori sani avranno una probabilità del 25% di avere figli affetti
da FC. Dalla stessa unione i figli avranno una probabilità su due (50%) di nascere portatori sani,.
come i genitori.
Come si esegue l'analisi genetica per la Fibrosi Cistica?
L'unico modo per identificare i portatori sani è quello di effettuare un test sul DNA alla ricerca di
mutazioni nel gene della FC. L'analisi è però complicata dal fatto che esistono numerosissime
mutazioni (ad oggi oltre 900), alcune delle quali rare, molte altre ancora sconosciute. Generalmente,
il test genetico viene eseguito tenendo conto di 34-200 mutazioni (a seconda del tipo di analisi
effettuata), scelte tra le più frequenti nell'area geografica in questione e che nel complesso permette
di identificare circa il 90 % dei portatori. Il test genetico non è in grado di identificarle tutte. In casi
particolari, adeguatamente valutati dal genetista, può essere eseguito anche un test genetico che
prevede l'analisi di mutazione dell'intero gene, con conseguente ricerca di tutte le mutazioni finora
scoperte. Il gene responsabile della malattia è stato identificato e localizzato sul cromosoma 7 e la
proteina codificata è detta CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator). La proteina CFTR ha
un ruolo importante in quanto regola la quantità di cloro che viene secreta insieme ai liquidi
biologici. Nei pazienti affetti da FC il gene della CFTR è alterato, in genere a causa di mutazioni
puntiformi. Queste alterazioni fanno si che la proteina non venga più prodotta, o che venga prodotta
ma in una forma non funzionante. A causa del deficit della proteina, le secrezioni contengono una
scarsa quantità di acqua e di sali, che ne modifica drasticamente le proprietà.
La mutazione più frequente è la delezione del codone codificante per la fenilalanina 508 (D F508)
che è presente in eterozigosi nel 57% dei pazienti; essa provoca la incompleta glicosilazione della
proteina che viene degradata ancora prima di raggiungere la superficie della membrana cellulare. E’
stata anche dimostrata una correlazione tra l’agenesia dei vasi deferenti e una variante allelica
polimorfa del gene CFTR, nota come polimorfismo 5T, che consiste in una regione di
polipirimidine (polyT) di lunghezza variabile all’interno dell’introne 8. La variabilità si manifesta
sotto forma di tre alleli chiamati 5T, 7T, 9T a seconda del numero di timine presenti. In particolare,
l’allele 5T è associato ai cromosomi mutati dei maschi che presentano agenesia dei vasi.
Che risultati può dare l'analisi genetica per la Fibrosi cistica?
A seguito dell'analisi genetica per la fibrosi cistica si possono ottenere due tipi di risultati:

l'analisi può individuare nel DNA del paziente la presenza di una mutazione a livello di una
copia del gene CFTR, mentre l'altra copia è normale. Si dice che il soggetto risulta portatore
in eterozigosi di quella mutazione, e questo risultato significa che il paziente è un portatore
sano.

L'analisi può individuare nel DNA del paziente la presenza di mutazioni in entrambe le
copie del gene CFTR. Si dice che il soggetto risulta eterozigote composto (2 mutazioni
diverse) o omozigote (2 mutazioni uguali); questo risultato significa che il paziente è affetto
da FC.

L'analisi genetica non individua nel DNA del paziente la presenza di mutazioni del gene
CFTR. Si dice che il soggetto risulta "negativo". Questo risultato significa che il soggetto ha
una probabilità diminuita, rispetto a prima dell'analisi, di essere un portatore. Non è
possibile che l'analisi escluda in assoluto la probabilità di essere un portatore, perché non è
possibile escludere la presenza di tutte le numerosissime mutazioni del gene della FC.
E' importante ricordare che:
o la probabilità di essere un portatore di FC è maggiore per un soggetto che sia parente
di un malato o un portatore. In questo caso è necessario prima identificare la
mutazione del malato o del portatore presente in famiglia (mutazione familiare) e poi
ricercarla nel parente. Se il parente risulta non avere nel suo DNA la mutazione
familiare, la sua probabilità di essere portatore diventa estremamente bassa.
o La probabilità di essere portatori di FC è minore ma comunque presente anche nel
soggetto che non è parente di un malato o un portatore. In questo caso per chi si
sottoponga alla ricerca delle più frequenti mutazioni del gene della FC e non risulta
avere nel suo DNA nessuno di queste la probabilità di essere un portatore diventa
bassa.
Rischio di avere un figlio affetto da FC se
Probabilità residua di
essere portatore se il
un paziente della coppia è
Entrambi i pazienti sono
test è negativo
portatore/l'altro negativo al test
negativi al test
0
1:25
non applicabile
1:2500
70
1:82
1:331
1:27400
75
1:99
1:396
1:39200
80
1:124
1:494
1:61000
85
1:165
1:661
1:109200
90
1:246
1:984
1:242100
95
1:491
1:1964
1:964400
frequenza ipotizzata del portatore 1:25 rif.: da Lemma W. et al. N.Engl. J. Med. 1990.322:295
% di mutazioni FC
identificabili
Descrizione tecnica dell'analisi
L'analisi di mutazione del DNA viene condotta operando inizialmente una reazione enzimatica di amplificazione del
DNA, conosciuta come Polymerase Chain Reaction (PCR), che consente di amplificare in vitro una specifica regione
della molecola, copiando in varie fasi successiva, fino ad ottenerne milioni di copie. In tale maniera viene amplificata
la regione codificante e parte della regione intronica per ciascun esone del gene investigato, e contemporaneamente
ne viene eseguita una marcatura con biotina; i prodotti di PCR così ottenuti vengono ibridati su strip. Gli ibridi
biotinilati sono successivamente rivelati utilizzando la streptavidina coniugata con fosfatasi alcalina e un appropriato
substrato colorato.
Livello diagnostico: screening 34 mutazioni
detection rate: 76%
MUTAZIONI INVESTIGATE
Esone/Introne
Variazione nucleotidica
Effetto della mutazione
2183AAG
1
Del A-2184 ed A-2183G
frameshift
G85E
3
G-386A
Gly-85Glu
R117H4
4
G-482A
Arg-117His
621+1GT
Intr 4
G-621+1T
5'splice mut
711+1GT
Intr 5
G-711+1T
5' slice mut
711+5GT
Intr 5
G-711+5A
mRNA slicing mut
852del22
6a
Delez. 22 bp (852)T
frameshift
R347P
7
G-1172C
Arg-347Pro
T338I
7
C-1145T
Thr-338Ile
R347P
7
G-1172C
Arg-347Pro
1259insA
8
Inser. 1 bp
frameshift
1677delTA
10
Delez. TA (1677)
frameshift
I502T
10
T1637C
Ile-502Thr
1706del17
10
Delez. 17bp
Delez. slicing site
DI507
10
Delez. 3bp
Delez. Ile506 o Ile507
DF508
10
Delez. 3bp (1652-1655)
Delez. Phe508
F508C
10
T-1655C
Phe-508Ser
1717-1GA
Intr. 10
G-1717-1A
mRNA splicing mut
G542X
11
G-1756T
Gly-542stop
S549R
11
T-1779G
Ser-549Arg
G551D
11
G-1784A
Gly-551Asp
R553X
11
C-1789T
Arg-553stop
Q552X
11
C-1782T
Gln-552stop
2789+5GA
Intr. 14b
G-2789+5A
5' splice mut
L1065P
17b
T3326C
Leu-1065Pro
R1066H
17b
G-3329A
Arg-1066His
L1077P
17b
T3362C
Leu-1077Pro
D1152H
18
G-3586C
Asp-1152His
R1158X
19
C3604T
Arg-1158stop
R1162X
19
C-3616T
Arg-1162stop
3849+4AG
Intr. 19
A3849+4G
Creaz. splice site
G1244E
20
G-3863A
Gly-1244Glu
W1282X
20
G-3978A
Trp-1282stop
4016insT
21
Inser. 1bp
frameshift
N1303K
21
C-4041G
Asn-1303Lys
4382delA
24
Delez. A (4382)
frameshift