1.delle
Preliminari
Biochimica
proteine
a.
Prof. M. Bolognesi
Denaturazione
delle proteine
a.a. 2007/2008
b.
Riduzione e alchilazione
dei ponti disolfuro
c.
Determinazione
delle subunità
2. Analisi dei segmenti
a.
Frammentare le subunità
in peptidi
b.
Edman degradation
3. Ricostruzione della
sequenza
a.
Allineamento
di sequenze
b.
Assegnazione
Eloise Mastrangelo
disolfuri
Spettrometria di massa
¾ Serve a misurare la massa delle molecole.
molecole
¾ Fornisce la massa molecolare, e anche la formula molecolare
¾ La molecola deve essere ionizzata, così da misurare il rapporto
massa/carica (m/z) dello ione risultante.
Sorgente
La sorgente serve
a volatilizzare e
ionizzare il
campione
Analizzatore
L'analizzatore
serve a misurare il
rapporto m/z degli
ioni prodotti
Detector
Il detector serve
a rivelare gli ioni
che arrivano
dall'analizzatore
I componenti dello spettrometro
Sorgente
g
Analizzatore
Detector
m/z
Spettro
Computer
Sorgente
Analizzatore
Sorgenti:
•
•
•
•
•
Sorgente EI (impatto
elettronico)
Sorgente CI (ionizzazione
chimica)
Sorgente FAB (fast atom
bombarment)
Sorgente electrospray
Sorgente MALDI (Matrix
Assisted Laser Desorption and
Ionization).
Analizzatori:
•
•
•
•
Analizzatore
A
li
t
magnetico
ti
Analizzatore a quadrupolo
Analizzatore a trappola
ionica ((ion-trap)
p)
Analizzatore TOF (time of
flight – tempo di volo)
M
Meccanismi
i i di iionizzazzione
i
i
•
•
•
•
e-:
Espulsione di
Protonazione:
Cationizzazione:
Deprotonazione:
M
M + H+
M + Cat+
MH
+.
M + eMH+
MCat+
M- + H+
ESI MS (Electron Spray Ionization)
ESI-MS
Sorgente di ionizzazione che utilizza un gas inerte (di solito azoto) per provocare un processo di nebulizzazione. Questo processo avviene in
soluzioni (metanolo e acqua), che vengono poi nebulizzate in una camera a cui è applicato un campo elettrico (ottenuto applicando una differenza
di potenziale di 3-4 kV). La nebulizzazione comporta la formazione di piccole goccioline di solvente che contengono delle specie ionizzate
( li carico:
(analita
i le
l proteine
i vengono caricate
i
positivamente
ii
mentre zuccheri
h i o oligonucleotidi
li
l idi negativamente).
i
)
Solvente polare e volatile
Man mano che il solvente contenuto nelle
goccioline evapora, queste si rimpiccioliscono
fino a che la repulsione elettrica , aumentata a
causa della forte densità elettrica, supera la
tensione superficiale della goccia; a questo punto
la gocciolina “scoppia”, creando una corrente di
i i che
ioni
h vengono indirizzati
i di i ti verso l’analizzatore.
l’ li t
N2
3-4 kV
Regione di vuoto intermedio
MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption
Ionization)
MALDI usa un laser per rompere e ionizzare le molecole del campione che viene fissato ad una
matrice chimica (acido picolinico, acido succinico, acido caffeico ecc), su un target
1) Irradiazione mediante laser delle molecole della miscela (matrice - analita).
2) Espulsione di un aggregato di analita solvatato dalle molecole di matrice.
matrice
3) Desolvatazione con conseguente trasferimento di un protone (reazione acido-base tra matrice e analita).
In ge
genere
e es
si ha
a il ttrasferimento
as e
e to d
di u
un p
protone
oto e da
dalla
a matrice
at ce a
all’analita
a a ta ; nelle
e e tec
tecniche
c e MALDI e FAB il p
processo
ocesso d
di
osservazione in modo positivo è quello più frequente.
Adatto per proteine. Pesi molecolari fino a 300 KDa
FAB (Fast Atom Bombardment)
FAB usa un raggio
i di atomi
t i veloci
l i di Ar
A o Xe
X o di ioni
i i Cs
C + per rompere e ionizzare
i i
le
l molecole
l l
del campione che viene disciolto in un solvente poco volatile come il glicerolo.
Adatto per peptidi e piccole proteine
Questo tipo di spettrometro separa gli ioni in base al tempo necessario per
compiere
i
un determinato
d t
i t percorso. All’uscita
All’
it dal
d l campo elettrico,
l tt i
glili ioni
i i possiedono
i d
la stessa energia cinetica, ma una diversa velocità a seconda del rapporto m/z.
Lasciandoli correre perciò in una regione libera da campi (un tubo sotto vuoto
spinto)
p
) essi raggiungeranno
gg g
il rivelatore in tempi
p diversi. Il tempo
p di volo è
proporzionale alla massa/carica.
L'analizzatore a quadrupolo consiste in un tubo rettilineo in cui è fatto il vuoto ed in cui sono presenti
quattro barre parallele, disposte simmetricamente intorno all'asse del tubo, di sezione circolare oppure
iperbolica.
l
Lo ione entra nell'analizzatore
ll'
l
parallelamente
ll l
all'asse
ll'
z, ed
d è spinto dai
d campi elettrici
l
continuo e oscillante a seguire una traiettoria a spirale .
Può essere considerato una variante dell'analizzatore a quadrupolo. Anzichè permettere agli ioni di
attraversare ill campo quadrupolare,
d
l
la
l trappola
l ionica trattiene tutti gli
l ioni all suo interno. Lo spettro di
d
massa è generato variando il potenziale elettrico in modo da espellere in sequenza dalla trappola verso il
rivelatore gli ioni secondo un valore m/z crescente.
Gli ioni vengono quindi analizzati da metodi come Time of Flight (ToF), trappola
ionica e Quadrupolo. Ognuno di questi metodi produce uno spettro di massa dove l’asse
x rappresenta il range di massa dell’analizzatore e l’asse y il numero degli ioni
individuati.
( m + n ( H + )) 555 .1 + 1
m
=
= 556 .1
+
Δt ∝
1
n( H )
z
leucine enkephalin
Platform II, BMB, The University of Leeds
04-Oct-199910:12:26
TEST01 32 (1.679) Cm (3:34)
Scan ES+
2.87e5
556.1
100
MH+
ESI-MS analysis of leucine enkephalin, YGGFL
C l l t d MW 555
Calculated
555.2
2D
Da
Measured MW 555.1 Da
%
557.2
558.3
578.1
381.1
0
m/z
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
(M+Na)+
650
Lisozima
hen egg lysozyme
Platform II, BMB, The University of Leeds
25-Jan-200010:00:37
LYS01A 1 (1.392) Sm (SG, 2x1.00); Sb (10,10.00 )
A9;1590.6
100
A8
1789.2
A:
Scan ES+
2.16e6
14305.67±0.42
A10
1431.6
m ⎛ Mw+ nH+ ⎞
⎟⎟
= ⎜⎜
z ⎝
n
⎠
A11
1301.4
%
A12
1193.1
1601.4
1801.3
A7
2044.6
1441.3
A13
1101.5
2049.7
1310.5
0
m/z
1000
1200
1400
1600
1800
2000
2200
2400
n+1 n
Assunzione: 2 picchi successivi avranno numeri di ionizzazione successivi
Prima si ricava n, poi si ricava Mw
Prima della spettrometria di massa bisogna separare le proteine presenti in una
miscela complessa utilizzando ad esempio gel bidimensionali o metodi
cromatografici.
t
fi i
spot 22
Two-dimensional Coomassie Blue-stained gel of human prostasomes (preparative run)
¾ Le proteine intere sono più difficili da analizzare in uno spettrometro
di massa, e la misura della massa di una proteina intera dà informazioni
limitate.
¾ La maggior parte degli approcci in proteomica coinvolgono un
processo di frammentazione delle proteine in piccoli pezzi che sono
analizzati
li
i per id
identificare
ifi
la
l proteina.
i
¾ Comunemente le proteine vengono digerite con degli enzimi, come la
tripsina in peptidi.
tripsina,
peptidi
¾ I peptidi vengono analizzati per determinare la loro massa. L’intero
set di masse osservate generalmente appartiene ad una singola proteina.
proteina
Ma ogni singola massa di un peptide può essere prodotta da differenti
proteine. L’identificazione delle proteine avviene mediante la
combinazione delle masse osservate.
¾Il processo della misura di un set di masse di peptidi da una proteina e il
matching contro un database, si chiama peptide mass fingerprinting.
Protein Identification by Peptide Mass Fingerprinting (PMF)
Trypsin cleavage sites: Arg and Lys
P t i
Protein
Digestion
K
K
R
R
.....
m3
Peptide mass fingerprinting
by MALDI-TOF
MALDI TOF MS
m1
m2
m4
m/z Da
Database searches
mr exper.
Protein
Identification
m1
m2
m3
......
902.546
971.477
1234.690
mr theor.
902.535 Da
971.447 Da
1234.690 Da
Diff.
Residues
0.012
0.030
0.000
124-131
188-195
136-146
Peptide sequence from
the database
GLFIIDPK
EYFEAANK
HITINDLPVGR
Riadattata da Lamond e Mann, 1997
Peptide Fingerprinting spectrum from spot 22 acquired with the ETTAN MALDI-ToF mass spectrometer from
Amersham Biosciences (Uppsala, Sweden)
2-D separated protein spots
Peptide Mass Fingerprinting (PMF)
MALDI-TOF
ID via Database Searching
L’approccio più comune di un software è di utilizzare un
database proteico e per ogni sequenza proteica calcolare tutti i
peptidi che può produrre.
produrre Una volta che sono state trovate
queste corrispondenze, molti programmi calcolano la probabilità
che il match risultante sia o meno un falso-positivo.
I programmi che fanno peptide mass fingerprinting sono Mascot,
PeptIdent,
p
, Profound e Genome Fingerprint
g p
Scanningg (GFS).
(
)
Ad es. Mascot può fare ricerche basate su PMF, MS/MS o sequenze parziali di aa (sequence Query).
Utilizza diversi database (SwissProt, NCBI, MSDB).
N.B. non c’è alcuna determinazione strutturale diretta della sequenza amminoacidica.
¾ L’identificazione viene raggiunta soltanto nel caso in cui una
sequenza con un PMF corrispondente a quello sperimentalmente
ottenuto sia nota.
nota
¾ Questo metodo di identificazione è particolarmente efficiente
quando
d il genoma dell’organismo,
d ll’
i
e quindi
i di le
l sequenze
amminoacidiche delle proteine da esso derivanti, è conosciuto.
I dati archiviati nei database biologici riguardano la
sequenza primaria delle proteine e i software di
confronto tra dati di frammentazione sperimentali
p
e
teorici possono tenere conto soltanto di poche
possibili modificazioni chimiche degli amminoacidi
( h ne alterano
(che
l
l massa))
la
2-D separated protein spots
Peptide Mass Fingerprinting (PMF)
MALDI-TOF
ID via Database Searching
No ID
MS/MS
ESI-Ion Trap
ID via Database Searching
Tandem Mass Spectrometry (MS-MS)
•
•
•
•
•
•
•
Utile per sequenziare le proteine
Si usa uno spettrometro con più di un analizzatore
La proteina viene digerita e i frammenti peptidici sono introdotti nello
strumento
I peptidi vengono separati nel primo stadio di MS
Un pò di peptidi vengono selezionati per una seconda analisi in MS. Questi
ppeptidi
p
ppossono essere selezionati in base alla massa, all’intensità del ppicco o
altro
Il singolo peptide viene frammentato
mediante un processo di bombardamento
con atomi, chiamato CID
(collision-induced dissotiation).
I frammenti sono analizzati
b
[N]+[M]-H
y
[C]+[M]+H
[N]=molecular mass of neutral N-terminal group
[C]= molecular mass of neutral C-ter group
[M]= molecular mass of the neutral amino acid residues
Gli ioni prodotti dalla rimozione dei residui al C terminale sono
chiamati ioni b, quelli rimossi all’N terminale ioni y
ESI-MS/MS
Protein
b ions, sequence: ATAVVDGAFK
AT
A
V
V
D
G
A
F
K
MS-MS spectrum of peptide m/z 978.6 from spot 36 corresponding to Peroxiredoxin2 (TSA protein) The
spectrum was acquired with LCQDeca mass spectrometer (ThermoFinnigan, SanJose,CA)
9P id mass fingerprinting
9Peptide
fi
i i
9Peptide
p
fragment
g
ion search
Comparazione delle masse dei frammenti generati da
un certo peptide per ESI-MS con le masse teoriche
dei frammenti generati “in
in silico
silico” da tutti i peptidi
con la stessa massa presenti in database
9Peptide
9P
tid sequence tag
t
Sequenza aminoacidica ottenuta dall’interpretazione
dello spettro
p
ESI-MS/MS di un certo ppeptide,
p
ricerca
nei database della proteina che contiene almeno un
peptide con quella determinata massa e quella
specifica sequenza
¾PMF: identification of conserved proteins
¾MS/MS and db search: identification of conserved
peptides
tid in
i less
l conservedd proteins
t i
2-D separated protein spots
Peptide Mass Fingerprinting (PMF)
MALDI-TOF
ID via Database Searching
No ID
MS/MS
ESI-Ion Trap
ID via Database Searching
No ID
De novo sequencing
