08-PTMS e Seq

Spettrometria di Massa applicata alla
PROTEOMICA
1.
MALDI-TOF:
–
Determinazione di mappe peptidiche mediante digestione “in gel”
di spot separati su E-2D da estratti proteici totali
–
Identificazione rapida di proteine a partire da tale mappa
peptidica (Peptide Mass Fingerprinting)
2.
Nanospray o HPLC-ESI associato a TQ o IT:
–
CID: frammentazione di peptidi selezionati
–
Identificzione di proteine attraverso gli spettri di
frammentazione di tali peptidi (sequenza amminoacidica)
Identificazione di proteine attraverso
”peptide mass finger print”
Algoritmi e Programmi
Three main groups:
- programs using proteolytic peptide fingerprint for
protein identification (PeptIdent, MultiIdent,
ProFound);
- programs additionally operating with MS/MS spectra
(PepSea, MASCOT, MS-Fit, MOWSE) or with
MS/MS only;
- programs operating with MS/MS only (SEQUEST,
PepFrag, MS-Tag, Sherpa).
Databases disponibili per
l’identidicazione di proteine
SWISS-PROT is a database of annotated protein sequences; it also contains
additional information on function of the protein, its domain structure,
posttranslational modification(s), etc.;
- TrEMBL is a supplement to SWISS-PROT, which contains all protein sequences,
translated from nucleotide sequences of the EMBL database;
- PIR-International (Protein Identification Resource, National Biomedical Research
Foundation, Washington, USA) is also an annotated database of protein
sequences;
- NCBInr (National Center of Biotechnological Information) is a database containing
sequences translated from DNA sequences of GenBank and also sequences from
PDB, SWISS-PROT, and PIR databases;
- ESTdb (Expressed Sequence Tags database, NCBI, NIH).
- programs operating with MS/MS only (SEQUEST, PepFrag, MS-Tag, Sherpa).
ANALISI DEI PESI MOLECOLARI DEI PEPTIDI OTTENUTI
PER DIGESTIONE SPECIFICA DI UNA PROTEINA
L’identificazione di una proteina dipende dai seguenti parametri:
9Accuratezza nella determinazione della massa dei frammenti
9Numero delle masse sottomesse per l’interrogazione del database
9Distribuzione delle masse
9Numero delle masse che sono in accordo fra quelle sperimentali e
quelle teoriche per la proteina del database
9Dimensione del database di sequenze proteiche
9Numero delle modificazioni a carico della proteina considerate
Effetto dell’errore di massa sul matching di peptidi
a)
mass error = 0.5 Da
b)
Mass error = 0.35 Da
c)
mass error = 0.2 Da
d)
mass error = 0.1 Da
e)
mass error = 0.05 Da
f)
mass error = 0.01 Da
RIASSUMENDO
una volta effettuata la 2D-PAGE (compresa analisi dell’immagine):
•
Prelevare lo spot e sottoporlo a trattamento
proteolitico specifico
•
Analizzare mediante MS la miscela di peptidi
ottenuti ⇒ SPETTRO DI MASSA ⇒ PEAK LIST
•
Eseguire una ricerca su banche dati di sequenze
proteiche
con
la
lista
dei
pesi
molecolari
determinati con la spettrometria di massa
Nel caso di mancata identificazione:
•
Selezionare eventuali peptidi da sequenziare
(il p.m. del peptide deve essere < 2.5 kDa)
N.B.
Una sequenza corretta di 5-6 residui
amminoacidici può essere sufficiente
per l’identificazione di una proteina
L’identificazione viene raggiunta soltanto nel caso in cui
una sequenza con un Peptide Mass Fingerprint (PMF)
corrispondente a quello ottenuto sperimentalmente sia
nota.
Questo metodo di identificazione è particolarmente
efficiente quando il genoma dell’organismo, e quindi le
sequenze amminoacidiche delle proteine da esso
derivanti, è conosciuto.
N.B. non c’è alcuna determinazione strutturale diretta
della sequenza amminoacidica
Procedura usata
per ricerca in database di proteine
Si forniscono al motore di ricerca i risultati ottenuti con lo spettro di
massa (PMF) e informazioni generiche:
- peso molecolare della proteina
- Punto isoelettrico
- Eventuali modificazioni note
- Banca dati su cui effettuare la ricerca
- Mass error
- Enzima proteolitico usato
Il motore di ricerca seleziona fra le
proteine presenti in banche dati quelle
compatibili con le informazioni ed i
parametri di ricerca forniti.
Si ripete la ricerca nel caso in cui i
risultati non siano statisticamernte
validi.
Si possono eventualmente modificare i
parametri di ricerca.
Si procede all’analisi della/e proteina/e con lo score più alto.
Si valuta la presenza di eventuali modificazioni che
potrebbero aver prodotto variazioni del PM di peptidi non
trovati e si esegue un’analisi inversa sullo spettro di massa.
Come incrementare la specificità della ricerca
Informazioni aggiuntive
9Sequenza amminoacidica di almeno un peptide
(MS/MS o Degradazione di Edman)
9Amminoacido N-terminale
9Composizione amminoacidica della proteina
9Western Blot ed immunorivelazione specifica
Ricerca MASCOT dati MS/MS
• L’identificazione di una proteina viene fatta su
database di sequenze proteiche, sia attraverso il
suo fingerprint (spettro di massa di un digerito
proteolitico) sia attraverso la sequenza di peptidi
selezionati. Le masse osservate negli spettri di
massa
acquisiti
vengono
comparate
con
quelle
teoriche; ad ognuna viene attribuito un punteggio
(score).
• Gli
score
attribuiti
ad
ogni
peptide
vengono
“combinati” in modo da ottenere uno “score” per
l’intera proteina.
Analisi quali-quantitativa degli amminoacidi
Gli attuali metodi a disposizione per questo tipo di analisi comportano tre
passaggi fondamentali:
9 Idrolisi della proteina con liberazione degli amminoacidi che la
costituiscono.
9 Separazione degli amminoacidi presenti nell'idrolizzato.
9 Quantificazione dei diversi amminoacidi.
1) IDROLISI
Condizioni: HCl 6N, 110°C, 24 h.
2) Separazione e quantificazione degli amminoacidi presenti nell'idrolizzato:
9 Solubilizzazione aa in tampone a pH 2 (tutti carichi positivamente)
9 Separazione cromatografica degli amminoacidi e loro quantificazione.
(es. polistireni solfonati: scambiatori cationici forti)
9 Eluizione: gradiente di forza ionica e di pH.
9 Rivelazione post-colonna (es. ninidrina; OPA).
L'assorbanza o la fluorescenza di ciascun picco è proporzionale alla
concentrazione dell'amminoacido.
Degradazione di Edman
H O
N C
S
+
O
H2N C C Asp
Phe
Phe
Arg C
O
CH3
Fenilisotiocianoato
Labeling
H S
H H O
-
Su peptidi isolati!
O
N C N C C Asp
Phe
Phe
Arg C
CH3
O-
Release
S
O
N
N
CH3
O
H
PTH-alanine
+
H2N Asp
Phe
Phe
Arg
C
O-
Peptide shorthened by one residue
In condizioni alcaline, il fenilisotiocianato (PTC) reagisce con i residui N-terminali
di proteine/peptidi.
Il residuo aminoterminale, derivatizzato con un “marcatore identificabile”, viene
rilasciato e rivelato.
Il peptide restante rimane intatto.
Serie
di
reazioni
eseguita
automaticamente in:
“SEQUENZIATORI
AUTOMATICI
DI PROTEINE”.
Teoricamente si possono identificare
fino a 60 residui della porzione Nterminale
l'identificazione
della
degli
proteina;
amminoacidi
rilasciati nei cicli successivi diventa
problematica, a causa degli effetti
cumulativi di reazioni incomplete e di
reazioni secondarie del processo di
degradazione.
Questi apparecchi permettono di poter
lavorare con quantità molto basse di
proteina: nell'ordine di decine di pmoli.
Sequenziamento di peptidi con MALDI-TOF
Sequenziamento di peptidi con MALDI-TOF