Laboratorio Interdipartimentale di
Chimica e Biologia di Peptidi e Proteine
Polo Scientifico e Tecnologico di Sesto Fiorentino
Università di Firenze
Il ruolo della Chimica e della Fisica
per le Scienze della Vita:
Il loro contributo allo sviluppo di
una diagnostica innovativa.
Prof. Anna Maria Papini,
www.unifi.it/peptlab
Studio dei meccanismi molecolari
di condizioni fisiologiche e patologiche
Cais do Sodre Metro Station Lisboa,
Antonio Dacosta
Mondo Macroscopico
Gentilemente concesso
dal Pr. M. Verdaguer a OpenLab
Mondo Molecolare
Lewis Carroll, Through the looking-glass, Penguin Books, London, 1998
Illustrations by John Tenniel
Composizione chimica di una tipica cellula eucariota
50% delle proteine sono modificate!
COMPLESSITA’ BIOLOGICA
Da 30.000 geni umani
300.000 – 3.000.000 forme distinte di proteine
Studio dei meccanismi molecolari
di condizioni fisio-patologiche
Mondo
macroscopico
Mondo
molecolare
metro …
nano metro …
1 / 1 000 000 000 = 10 - 9
mole …
molecola …
10+23
1
Hermann Emil Fischer
1899: isola via idrolisi di alcune proteine tre
amminoacidi (valina, prolina, idrossiprolina)
Peptide
dal Greco πεπτος (digeribile)
Berlin University, Germany.
b. 1852; d. 1919
Proteina
dal Greco πρώτα (di primaria importanza)
1899: Fischer inizia a lavorare sulla chimica delle proteine
GLYCINE (Gly, G); MW=75.07g/mol (Aminoethanoic acid)
Henri Braconnot (1780-1855)
1820: “Sur la conversion des matières
animales en nouvelles substances par le
moyen de l’acide sulfurique”
It’s the first time in which a pure amino acid was obtained from a protein by acid hydrolysis.
He boiled gelatin with sulfuric acid for 5 hours, neutralized the acid with calcium carbonate,
evaporated the filtrate from the calcium sulfate to a syrup and left it to stand for about a month.
At the end of this time there was crystals that possessed a sweet taste: he thought that the
product was a sugar so he named it “sucre de gélatine”
1846: experimental data in support
of the correct composition of
glycine (C2H5NO2) after studies on
“sucre de gélatine” also called
“leimzucker”
E. N. Horsford
G. J. Mulder
A. Laurent
LYSINE (Lys, K); MW=146,16g/mol (2,6-diaminohexanoic acid)
H. Hlasiwetz (1825-1875),
J. Habermann (1841-1914)
O
H2N
CH
1873: “Ueber die Proteinstoffe”
(CH2)4
NH2
Heinrich Ferdinand Edmund Drechsel (1843-1897 )
1889: “Zur Kenntniss der Spaltungsprodukte des Caseins”
He hydrolyzed casein by boiling with hydrochloric acid in the presence
of stannous chloride, removed the tin, crystallized out the glutaminic
acid hydrochloride crude and then diluted the sirup mother liquor and
treated it with phosphotungstic acid. The heavy precipitate was
decomposed with barium hydroxide, the excess of this reagent was
carefully precipitated and the solution was acidified with hydrochloric
acid and concentrated to a sirup. After crystallization, it was redissolved
and the solution was diluted with alcohol and ether. At the end he found
the chloroplatinate salt that crystallize in long prisms.
C
OH
MPT
Glicosilazione
Lipidazione
Fosforilazione
Metilazione
Chelazione di ioni
metallici
Deimminazione
Solfatazione
1903: Fisher riesce a sintetizzare e caratterizzare
il primo polipeptide costituito da 18 amminoacidi legati tra loro
H-Leu-(Gly)3-Leu-(Gly)3-Leu-(Gly)8-Gly-OH
Elongazione della catena peptidica nella direzione C Æ N
utilizzando cloruri di α-alogeno acidi
R
R
R'
Cl
Br
O
H2N
H
N
Br
COOH
O
COOH
R'
NH3
mediante legame peptidico
(legame ammidico)
R
H
N
H2N
O
COOH
NH4Br
R'
Fischer E., Otto E. Ber. Dtsch. Chem. Ges., 1903, 36, 2106-2116; Fischer E. Ber. Dtsch.
Chem. Ges., 1907, 40, 1754-1767.
A cosa porta la sintesi chimica di un dipeptide se non
sono protette le funzioni che sono ugualmente reattive
e che non vogliamo far reagire?
Una miscela di
almeno 4 prodotti
Vincent Du Vigneaud
Premio Nobel per la Chimica 1955
“Per l’isolamento la
caratterizzazione e la prima sintesi
dell’ormone polipetidico Ossitocina”
(1949-1953)
Cornell University Ithaca, NY, USA
b. 1901; d. 1978
*Stimola la contrazione uterina
nel corso del travaglio
*Stimola la produzione di latte
*Favorisce il comportamento materno
Frederick Sanger
Primo Premio Nobel per la Chimica nel
1958
“per il suo lavoro sulla struttura delle
proteine, e in particolare dell’insulina”
University of Cambridge, United Kingdom
b. 1918
Secondo Premio Nobel per la Chimica nel 1980 per aver
contribuito alla comprensione delle sequenze di basi negli acidi
nucleici insieme a W. Gilbert e P. Berg (DNA recombinante)
Robert B. Merrifield
Premio Nobel per la Chimica 1984
“per lo sviluppo e la messa a punto
della metodologia di sintesi chimica di
peptidi su supporto solido"
Rockeffeller University, New York, NY,
USA. b. 1921-2004
J. Amer. Chem. Soc., 85,
2149-2154 (1963).
Sintesi Peptidica su Fase solida
HR n+1
R n+1
H OH
R 1O RO1 R 1 R 1
Y
NY N N
O O O OH
NHY
2 N H 2 N XN N N
H
H
H
H
O
H
O RO
R
O O
O
R
2 n n
Ripetizione
per
n-volte
dei
cicli
Deprotezione
Polimero
selettiva
solido
con
deldel
un
gruppo
Distacco
Accoppiamento
del
peptide
Accoppiamento
del primo
didella
deprotezione
e
gruppo
funzione
capace
di
amminica
protettore
desiderato
successivo
dalla resina
amminoacido
sulla
accoppiamento
(elongazione
che
deve
ancorare
reagireprotetto
con
l’ultimo
la
funzione
e
amminoacido
deprotezione
protetto
delle
funzione
amminica
della
catena)
carbossilica
amminoacido
dell’amminoacido
della
da
sulla
catene
funzione
laterali
amminica
introdurre
sequenza
Side chain
protecting group
Sintesi Peptidica su Fase Solida
X O
H
N C C OH + Linker Resin
H
α
N -Protecting group
Side chain
protecting group
Nα-Protecting
X O
H
N C C O Linker Resin
H
group
Direzione C Æ N
Ancoraggio del primo
amminoacido ad un
suporto solido
Side chain
protecting group
X O
H2N C C O Linker Resin
H
Repetitive cycles
1) Protected amino acid
2) Coupling reagent
3) Deprotction of the N-alpha
Side chain
protecting group
Nα-Protecting group
H Xn
N C
H
Xn
H2N C
H
O
C
Side chain
protecting group
Xm O
CH C
H
N
O
C
H
N
C
H
Distacco finale del peptide
dal supporto solido e
O Linker Resin
n-1
Xm
Cicli Ripetitivi
contemporanea
deprotezione delle catene
O
C
OH
n-1
laterali degli amminoacidi
Robert B. Merrifield e il suo primo prototipo di
sintetizzatore automatico di mini-proteine (peptidi)
Piattaforma Technologica
di peptidi e proteine
Sintesi e
Purificazione
Automatic batch multiple solid-phase synthesizer
Semi-automatic continuous-flow peptide synthesizer
Manual batch solid-phase synthesizer with heating control
Microwave unit
Analytical HPLC units
Semi-preparative HPLC units
...
...
Foglietti β
α-Elica
Contributo della fisica allo studio
delle interazioni tra materia e radiazioni
Per ottenere
informazioni
sulla struttura
tridimensionale delle
proteine
3D Structure of
Insulin
Primo Premio Nobel per la Fisica 1901
In riconoscimento degli
straordinari servigi resi per la
scoperta dei rimarcabili
RAGGI che hanno preso il
suo nome (successivamente
chiamati Raggi-X)
Wilhelm Conrad Röntgen
From Nobelprize.org. 17 Mar 2011
Basato sul concetto di emissione stimolata
introdotto da Einstein nel 1917
Premio Nobel per la Fisica 1964
Charles Hard Townes
Nicolay Gennadiyevich Basov
Aleksandr Mikhailovich Prokhorov
"for fundamental work in the field of quantum electronics, which has led to the construction of oscillators and amplifiers based on the maser‐laser principle"
Maser:"microwave amplification by stimulated emission of radiation“
The word "laser“ replaces "microwave" by "light".
Premio Nobel per la Chimica 2002
John B. Fenn
Koichi Tanaka
Kurt Wüthrich
" Per lo sviluppo di metodi per l’identificazione e le analisi
della struttura di macromolecole biologiche"
“Nuova luce sulla
moderna ottica”
Roy J. Glauber
“For his contribution
to the quantum
theory of optical
coherence”
Premio Nobel per la Fisica 2005
John L. Hall
Theodor W. Haensch
Prize motivation: "for their contributions to
the development of laser-based precision
spectroscopy, including the optical
frequency comb technique"
Piattaforma Technologica
di peptidi e proteine
Caratterizzazione molecolare
GC (Focus, Thermo)
HPLC
LC-MS (Surveyor, Thermo)
ESI-MS (LCQ Advantage, Thermo)
APCI-MS (LCQ Advantage, Thermo)
NMR (1H, 13C, 19F, 31P, MAS-NMR)
High-technological platform:
QTof Waters for nanoLC-MS/MS
Molecule characterization
Piattaforma Technologica
di peptidi e proteine
Caratterizzazione cellulare
Microscopio Confocale
Citofluorimetro
º Determinazioni strutturali (raggi x / NMR)
º Separazione e sequenziamento (LC-MS)
º Peptidi sintetici per saggi di affinità
NATURE MEDICINE 8(11): 1263, 2002
Fig. 1 - High-resolution Fourier-transform
ion cyclotron resonance mass spectroscopy
(FT-ICR-MS).
Qualche esempio...
º Anticorpi monoclonali terapeutici
THE LANCET 335: 735, 2000
º Anticorpi monoclonali terapeutici
º Vaccini terapeutici anti cancro
SEMIN. ONCOL. 29: 494, 2002
BIOPOLYMERS (PEPT. SCI.) 66: 200, 2002
PEPTIDI come PRODOTTI FARMACEUTICI approvati
dalla Food & Drug Administration
First Generation
Oxytocin
ACTH (1-24) & (1-39)
Vasopressin
Insulin
Glucagon
Calcitonins
TRH
Gonadorelin
Somatostatin
GHRH (1-29) & (1-44)
CRF (Human & Ovine)
Cyclosporin
Thymopentin
Thymosin Alpha-1
Secretins (Human & Porcine)
Parathyroid Hormone (1-34) & (1-84)
Vasoactive Intestinal Polypeptide
Brain Natriuretic Peptide
Cholecystokinin
Tetragastrin
Pentagastrin
Eledoisin
Second Generation
Carbetocin
Terlipressin
Felypressin
Buserelin
Deslorelin
Goserelin
Histrelin
Leuprolide
Nafarelin
Tryptorelin
Lecirelin
Lanreotide
Octreotide
Atosiban
Desmopressin
Pitressin
Lypressin
Ornipressin
ACE Inhibitors
(Enalapril, Lisinopril)
HIV Protease Inhibitors
New Generation
Abarelix
Cetrorelix
Ganirelix
Integrilin
Bivalirudin
Copaxone
Techtide P-289
Cubicin
Enfurvirtide
Ziconotide
Pramlintide
Exenatide
Biomarker
Una qualsiasi misurazione che predica una condizione
patologica di un paziente o la risposta ad una terapia e quindi
avente un putativo valore diagnostico e/o prognostico
‘Decision-Making Tools’ particolarmente importanti
nel processo di validazione di Trattamenti Terapeutici
Innovativi e personalizzati
Antigene or Anticorpo
MRI
Le proteine possono essere
aberrantemente modificate e scatenare una risposta
del sistema immunitario
Infezioni Virali o
Batteriche
Caratterizzazione di autoanticorpi nel siero di
pazienti come Biomarkers di malattia
Gli autoanticorpi riconoscono peptidi corti
negli antigeni proteici
Test basati su peptidi (epitopi lineari o conformazionali)
Peptidi mimetici della porzione di proteina modificata aberrantemente
IC50 11.8 nM
IC50 137 nM
Type I β-turn
[Pro7,Asn8(Glc),Thr10]CSF114
Conformeri a più bassa energia.
Regioni di β-turn e β-strand
sono evidenziate come ribbon
Type I’ β-turn
CSF114(Glc)
J. Med. Chem. 2006
49, 5072.
Disegnare & sviluppare sonde sintetiche per
identificare autoanticorpi nel siero di pazienti
affetti da malattie autoimmuni
Standardizzazione di test
diagnostici/prognostici
MS Abs
ÎPer
monitorare le malattie
Î Per valutare l’efficacia di
trattamenti terapeutici
personalizzati e innovativi
(alternativa a test sugli
animali)
Innovative
“Chemical Reverse Approach” to autoepitomics
Diagnostic/prognostic assays based on
Synthetic Antigenic Probes
Chemistry Today (2007) 25, 3, 14-16.
Specificity & High Affinity
Sensitivity
PTM
Current Prot. & Pept. Sci. (2003) 4, 277-284.
Zervas Award 2008
J. Med. Chem. (2001), 44, 2378-2381.
CSF114(Glc)
Multiple Sclerosis Antigenic Probe
OH
HO
HO
Asn(Glc)
The minimal epitope
recognized
O
HO
NH
O
NH
O
The glycopeptide antigen selected for the
development of MS PepKit
A diagnostic/prognostic test
to monitor Multiple Sclerosis
Ribbon diagram of the lowest energy
conformer of 200 calculated structures
derived from NMR data
Granted USA & Australian Patent (n. 2002316989) .
PCT WO 2003000733. Priority data FI2001A00011
Inventors: A.M. Papini, P. Rovero, M. Chelli, F. Lolli (Insight II Software, Biosym, San Diego)
Applicant: University of Florence.
Nature Medicine (2005) 11, 13.
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2005) 102, 10273-10278.
J. Neuroimmunol. (2005) 167, 131-137.
Neurology (2005) 65(5), 781-782.
Test Immunochimico su fase solida
Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA)
Supporto
solido
Rimozione
delle molecole
che non si
sono legate
Adsorbimento
del peptide
Aggiunta del siero
che contiene
Anticorpi
Anti-Igantisiero +
enzima
SP-ELISA
Sviluppo di
una reazione
colorimetrica
β-hairpin quale antigene peptidico
che riconosce anticorpi con elevata
specificità e affinità
Bioplex per la caratterizzazione di autoanticorpi
The BioPlex suspension array system incorporates
laser flow technology to analyze reactants in a
microtiter format
Peptide
Artrite Reumatoide
Anticorpi contro Fattori
Reumatoidi forti indicatori
di malattia ma markers
non specifici
Nelle giunture presenza di
PAD e produzione in situ
di anticorpi anti-filaggrina
citrullinata
Test per misurare Anticorpi anti-CCP usato per la
diagnosi e la prognosi dell’Artrite Reumatoide
Anticorpi contro Fattori
Reumatoidi forti indicatori
di malattia ma markers
non specifici
Artrite Reumatoide
Nelle giunture presenza di
PAD e produzione in situ
di anticorpi anti-filaggrina
citrullinata
Citrullinazione
(PAD- Peptidilarginina deimminasi)
NH2+
O
-O
NH3+
N
H
Arginine avec charge +
NH2
O
O
PADIs 4
-O
NH3+
N
H
NH2
Citrulline
Test per identificare Anticorpi anti-CCP usato per la
diagnosi e la prognosi dell’Artrite Reumatoide
Il segreto: azioni sinergiche
Progetti multidisciplinari “from bench to bedside”
Reverse
Approach
Clinical Research /
Literature/SMEs
GRP
Knowledge
Transfer
Modeling, Chemistry
Design & Synthesis
GRP
GLP
Diagnostic Device
Development
Detection &
Characterization
Knowledge
Transfer
•Improved quality of
Healthcare Services
GCP
Clinical Trials
CE Certification
•Rationalization of
Patient Research Resources
Se ho visto più lontano
degli altri è grazie ai
giganti sulle cui spalle
stavo seduto
I. Newton
Everything that goes on in biology
or medicine has a physical and chemical basis”
R. Lerner, Immunologist, Scripps Research Institute, 1998
Vi aspettiamo oggi pomeriggio
18 Marzo 2011 alle ore 14 e 30
al Polo Scientifico e Tecnologico
di Sesto Fiorentino
