peptidi e proteine - Università degli Studi di Perugia

11 & 21 Ottobre 2016
PLS
Raimondo Germani
Università degli Studi di Perugia
Dipartimento di Chimica, Biologia e Biotecnologie
 Far conoscere come le proteine siano dei co-polimeri naturali.
 Mettere in evidenza come queste biomacromolecole sono ottenute per
reazione di policondensazione.
 Far conoscere le peculiarità del legame ammidico/peptidico.
 Far conoscere le varie strutture della catena polipeptidica.
 Illustrare l’importanza delle proteine come Biomolecole fondamentali per
ogni organismo vivente.
 Evidenziare l’importanza delle relazione che intercorre tra struttura
(forma) della biomolecola e la sua funzione.
 Far conoscere i principali ruoli biologici delle proteine.
 Far conoscere le procedure di sintesi di una catena polipeptidica.
 Evidenziare l’azione catalitica di alcune proteine.
Conoscenze e abilità che lo studente
dovrebbe avere prima di iniziare a trattare
questi contenuti
 Conoscere le famiglie dei composti acilici (acidi carbossilici, cloruri acilici, ammidi, anidridi, esteri)
 Conoscere la reazione di sostituzione nucleofila acilica (SNAc)
 Conoscere l’ordine di reattività dei derivati acilici nella SNAc
 Conoscere il significato di conformazione di una struttura molecolare
 Conoscere e saper identificare la natura delle interazioni intermolecolari (non covalenti)
 Conoscere il concetto di velocità di una reazione
 Conoscere il ruolo svolto da un catalizzatore durante una reazione chimica
 Le proteine sono semplici molecole o polimeri?
Monomero
amminoacidico
 Alcuni nomi di proteine che conoscete
 Le proteine sono solo di origine animale?
Legame ammidico
 Cosa è la proteomica?
 Conoscete alcune funzioni delle proteine?
 Gli ormoni sono proteine?
 Cosa succede alle albumine dell’uovo quando viene cotto?
 Nel corpo umano dove si sintetizzano le proteine?
 Perché gli enzimi sono strutture polimeriche?
Insulina
Ormone regolatore
C254H377N65O76S6
Importanza del legame Ammidico
Esempi di farmaci contenenti il legame ammidico
La risonanza del gruppo ammidico comporta una serie di conseguenze.
La rotazione attorno al legame C—N è ristretta a causa del suo parziale carattere di doppio legame.
Il gruppo ammidico per questo motivo può esistere in 2 possibili conformazioni.
 Nella conformazione s-trans i due gruppi R sono da lati opposti rispetto al legame C-N.
 Nella conformazione s-cis invece sono dalla stessa parte rispetto al legame C-N.
 La conformazione s-trans del legame ammidico (peptidico) è più stabile della s-cis a causa
dell’ingombro sterica tra i gruppi R.
• Una ulteriore conseguenza della risonanza è che tutti e 6 gli atomi coinvolti nel gruppo
amminico giacciono sullo stesso piano.
• Tutti gli angoli di legame sono ~120° e i legami C=O e N—H sono orientati tra loro a
180°.
Rotazione impedita
Sei atomi giacciono
sullo stesso piano (3 C, 1O, 1N, 1H)
Piano ammidico
Formalmente è una
Reazione di condensazione
Legame
peptidico
(ammidico)
Un dipeptide può essere formato in un due differenti modi
1. Il COOH della cisteina può legarsi con NH2 dell’alanina, generando il dipeptide Cys-Ala.
2. Il COOH dell’alanina può legarsi al NH2 della cisteina, generando il dipeptide Ala-Cys.
La parola proteina dal greco “proteios = primario”, descrive una classe di composti di
primaria importanza per tutti gli organismi viventi.
Le proteine sono di diversi tipi e presentano funzioni diverse, si stima che quelle contenute nel
corpo umano siano > 100.000. Tutte le proteine sono costituite da amminoacidi.
Le proteine sono dei copolimeri dei 20 possibili monomeri. Sono polimeri ottenuti per
policondensazione, dove i vari monomeri sono legati tra di loro attraverso legami ammidici.
Legame ammidico
Gruppo ammino terminale
Gruppo carbossile terminale
Esempio di un dipeptide è l’aspartame, usato come dolcificante sintetico ipocalorico
CH3
O
O
O
HO
NH
O
NH2
Aspartame
Il metil estere del dipetide Asp-Phe
Ottenuto dagli L--amminoacidi aspartico e fenilalanina



L’aspartame è 180 volte più dolce del saccarosio.
Ambedue gli amminoacidi sono di configurazione L.
Se si sintetizza il dipeptide Asp-Phe con i due amminoacidi con
configurazione D, il composto ha, invece, un sapore amaro.
Esempi di oligopeptidi:
Peptidi relativamente semplici possono avere importanti funzioni biologiche:
Cys Tyr
S
Cys Tyr
Ile
Ponte disolfuro
S
Phe
Ponte disolfuro
S
Gln
Cys Asn
Pro
S
Gln
Cys Asn
Pro
Leu
H2NGly-
Ossitocina
Arg
H2NGly-
Vasopressina
 Ossitocina e vasopressina sono dei nonapeptidi. La loro sequenza è molto simile, eccetto per la
presenza di due residui ammino acidici. Questo è sufficiente a conferire ad essi una differente
attività biologica.
 La Ossitocina induce il travaglio e stimola il flusso di latte nelle partorienti.
 La Vasopressina controlla la pressione del sangue regolando la contrazione muscolare.
O
H
O
N
R
-
O
R
R1
+
N
R1
s-cis
R1
N
H
R
H
s-trans
10 Kcal/mole
Il legame ammidico è un legame forte, ed è richiesta energia per la sua formazione.
Il legame peptidico non si forma semplicemente mescolando in acqua due amminoacidi.
Per formare il legame ammidico è necessario convertire il gruppo -OH della funzione
carbossilica –COOH con un migliore gruppo uscente -Y.
Attivazione del gruppo carbossilico
O
O
OH
R
Y
R
Attivazione via acil cloruro
Gidrolisi = -3/-4 Kcal/mole
Gidrolisi = -7 Kcal/mole
Energia libera di idrolisi del legame ammidico
Energia libera di idrolisi per un alogenuro acilico
O
OH
R
O
O
O
SOCl 2
H
+
Cl
R
R
Cl
N
R1
R1
R
N
+
HCl
H
H
Buon gruppo uscente
Attivazione via sistema anidridico
O
R
O
X
Z
R
X = Ossigeno, Azoto
Nei sistemi biologici
l’attivazione passa tramite il
legame anidridico (e tioestereo)
Strutture tipo anidridi sono strutture a alta energia e potenziali risorse di energia. Ogni composto
con struttura anidridica possiede un Gidrolisi > -7.0 Kcal/mole
O
O
O
O
H3C
H3C
O
P
N
N
CH3
Anidride acetica
O
H3C
Acetilimidazolo
O
O
-
OH
Acetilfosfato
La riserva biologica di energia è l’ATP, che possiede la struttura anidridica nella catena
del gruppo trifosfato
NH2
Legami ad alto contenuto di energia
I°
N
N
II°
N
N
O
O
O
P
P
P
Adenosina-3’- Trifosfato
ATP
(coenzima)
O
HO
O
-
O
O
-
O
O
-
O
HO
OH
L’acido benzoico (sostanza tossica) può essere reso innocuo dall’organismo trasformandolo in acido
ippurico. Ciò avviene ad opera dell’ATP.
NH2
NH2
O
O
N
N
N
N
O
Anidride mista
N
N
-
-PPi
O
O
O
O
O
P
HO
O
P
O
-
O
O
P
O
-
O
N
N
-
P
O
O
O
HO
-
O
OH
HO
OH
NH2
Detossificazione
N
N
Glicina
O
O
O
N
N
-
-AMP
NH2
O
O
NH
O
-
O
O
P
O
-
O
Acido ippurico
O
HO
OH
Specie non tossica
Se per esempio se si ha a disposizione due ammino acidi come la fenilalanina e la cisteina abbiamo visto
che si possono formare dalla loro unione due dipeptidi: il dipeptide Fenilalanina-Cisteina o il dipeptide
Cisteina-Fenilalanina.
Nel primo caso il legame ammidico coinvolge il carbossile della fenilalanina e il gruppo amminico
della cisteina.
O
O
O
OH
+
NH2
H2N
H
O
NH
OH
SH
NH2
H
OH
SH
Nel secondo caso il legame ammidico coinvolge il carbossile della cisteina e il gruppo amminico
della fenilalanina.
O
O
H2N
H
H2N
OH
SH
+
H
O
OH
H2N
H
O
NH
SH
Chi controlla la sequenza nella biosintesi?
H
OH
•
•
Il ribosoma è costituito da due subunità
– Maggiore
– Minore
Ha la funzione di una stazione di lavoro
dove vengono assemblati gli amminoacidi
per ottenere la sequenza polipeptidica.
 La costruzione della sequenza peptidica inizia con l’attivazione del gruppo carbossilico del
primo amminoacido da parte dell’ATP con formazione di un legame anidridico misto tra il
carbossile dell’ammino acido e l’ATP.
 Il secondo passaggio consiste nell’attacco della molecola templato (il polinucleotide tRNA)
all’amminoacido attivato in maniera da rispettare la sequenza amminoacidica del polipetide o
proteina. (Reazione catalizzata dall’enzima amminoacil-tRNA sintasi)
Ogni amminoacido ha il suo specifico tRNA e un suo enzima amminoacil-tRNA sintetasi
Terminata la sintesi dell’amminoacil-tRNA c’è il riconoscimento della porzione del tRNA
(anticodone) con il mRNA (codone).
L’enzima Amminoacil tRNA sintetasi catalizza i vari passaggi:
1. Attivazione dell’amminoacido con ATP
+
H3N
O
R
O
-
intermedio anidridico
+
O
O
O
P
P
P
O
-
O
O
-
O
Ad
-PPi
O
-
O
Mg++
O
HO
O
H3N
R
P
-
O
O
O
O
HO
O
HO
Ad
OH
OH
2. Attacco all’ossidrile 3’ (o 2’) dell’acido adenilico terminale per dare l’amminoacil-tRNA.
tRNAOH
Ancoraggio via legame estereo
+
O
H3N
O
R
O
P
+
-
H3N
O
Ad
O
O
tRNA
R
O
HO
OH
O
Amminoacil-tRNA
+ AMP
La sequenza amminoacidica inizia con N-terminale del primo amminoacido formilato:
N-formilmetionil-tRNA. La formilazione impedisce al gruppo amminico del primo
ammino acido di partecipare alle successive reazioni (Azoto amminico trasformato in azodo
ammidico molto meno nucleofilo). La formilazione protegge il gruppo amminico del I° ammino
acido.
Terminata la sequenza amminoacidica l’enzima formilasi libera il gruppo amminico formilato.
tRNA
O
S
O
H3C
H
N-formilmetionil-tRNA
Agisce in un certo senso
come la resina
NH
O
Gruppo formilico
Cambia il comportamento chimico di N
Ribosoma
L’intero processo avviene nei
ribosomi e coinvolge due siti di
legame, quello peptidico (P) dove
cresce la catena peptidica, e quello
amminoacidico
(A)
dove
si
avvicendano i vari ammino acidi
legati al tRNA.
La reazione è catalizzata dall’enzima
peptidil transferasi.
La corretta sequenza amminoacidica è
regolata dal RNA messaggero mRNA
Non tutti i polipeptidi sono sintetizzati tramite tRNA e mRNA nei ribosomi.
Alcuni peptidi con basso numero di amminoacidi vengono sintetizzati tramite l’ausilio di
enzimi di grandi dimensioni multifunzionali: le sintetasi peptidiche (NRPS non
ribosomial peptide synthetase). La sintesi di questi peptidi richiede solo l’ausilio
dell’ATP per attivare la funzione carbossilica degli amminoacidi.
O
Esempio
O
OH
OH
NH
NH
O
H2N
O
HS
Glutatione: L-γ-glutamil-L-cisteinil-glicina
Molti di questi peptidi non ribosomiali presentano strutture cicliche, in cui
sono presenti ammino acidi modificati di tipo non proteico.
Enniatina B
Ciclosporina A
Isopenicillina N
Gramicidina S





Sono enzimi di grandi dimensioni
Sono prodotti da microorganismi come batteri e funghi
Le NRPS presentano una struttura ripetitiva
Il meccanismo prevede l’azione di gruppi tiolici -S-H (meccanismo tio-templato)
Sequenze amminoacidiche del sito attivo mettono in evidenza la presenza di
cisteina e serina
 Si forma un legame tioestere tra l’amminoacido e l’enzima
La Gramicidina S è un ciclo-decapeptide bioattivo isolato dal batterio Bacillus brevis che
mostra attività antibiotica (contro batteri gram positivi e negativi ed alcuni funghi).
La molecola è costituita da 2 identici pentapeptidi uniti testa-coda a formare un ciclo.
Bacillus brevis
Ciclo [-Val-Orn-Leu-(D)-Phe-Pro]2
La funzione del ciclodecapeptide è quella di complessare ioni di metalli alcalini
come Na+ e K+ e di trasportarli attraverso la membrana cellulare.
Crea un canale ionico nella membrana.
 Due molecole di Gramidina S si inseriscono nella membrana cellulare creando un
canale, gli ioni Na+ e K+ diffondono attraverso la membrana alterando il rapporto
elettrolitico dei due ioni nella cellula, determinandone la morte.
:http://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd
La struttura è costituita da 5 differenti amminoacidi ognuno usato due volte. Nella
struttura sono presenti due amminoacidi inusuali nei peptidi: la L-ornitina e la Dfenilalanina.
L-prolina
D-fenilalanina
CH3
H3C
O
L-valina
O
O
N
H
N
O
HN
NH
L-ornitina
CH3
L-valina
HN
H
N
CH3
CH3
O
O
O
CH3
L-leucina
NH
H3C
NH2
NH
O
O
O
L-ornitina
NH2
N
H
N
CH3
D-fenilalanina
L-valina
L-prolina
Come viene sintetizzata la Gramicidina S?
Si forma tramite una sequenza attivazionecondensazione utilizzando l’ATP come fonte di
energia e l’enzima Gramicidina Sintasi.
Amminoacido + ATP  Amminoacido-AMP + P-Pi
 La sintesi della Gramicidina S è quindi svolta completamente in assenza di tRNA e
mRNA.
 Tutte le informazioni per la sequenza peptidica (riconoscimento degli amminoacidi)
sono contenute nei siti attivi dei due enzimi che catalizzano il processo.


La struttura primaria di una proteina è la semplice sequenza degli amminoacidi.
La struttura secondaria di una proteina descrive come segmenti dello scheletro
peptidico si organizzano in uno schema regolare .
La struttura terziaria descrive la forma complessiva tridimensionale dell'intera spira
della molecola proteica.
La struttura quaternaria descrive come differenti molecole di proteine si uniscono per
produrre grandi strutture aggregate.




La struttura I è determinata degradando in maniera sequenziale la proteina.
Le strutture II, III e IV sono determinate tramite raggi-X o spettroscopia di
risonanza magnetica nucleare ( NMR).
Aumento della complessità
 La struttura primaria rappresenta semplicemente l’esatta sequenza degli
amminoacidi, vale a dire l’ordine con cui i monomeri amminoacidici si succedono
lungo la catena polimerica lineare della proteina.
 La sequenza degli amminoacidi influenza successivamente le strutture superiori,
che sono regolate dalle interazioni deboli tra vari siti della catena.
Dr. Frederick Sanger,
Premio Nobel per la Chimica
1958 e 1980
Sequenza peptidica
 Le conformazioni tridimensionali di regioni localizzate di una proteina sono
determinano la sua struttura secondaria. Queste regioni nascono a causa dei
legami idrogeno tra il protone N-H di una ammide e l’ ossigeno del C = O di
un altro gruppo ammidico.
 Due arrangiamenti sono particolarmente stabili l’-elica e il foglietto pigato
.
 La -elica si forma quando una catena
peptidica si attorciglia su se stessa in una
spirale destrorsa (in senso orario).






3,6 aminoacidi costituiscono un giro di elica (passo elica 0,54 nm)
I legami N-H e C = O puntano lungo l'asse dell'elica.
Tutti i legami C = O puntano in una direzione, mentre tutti i
legami N-H puntano nella direzione opposta.
Il gruppo C=O di un amminoacido interagisce via legame idrogeno a un gruppo N—H del 4°
amminoacido successivo lungo la catena. Così, il legame idrogeno avviene tra due amminoacidi
nella stessa catena (distanza N-H····O di 2,8 Å).
I legami idrogeno sono quasi paralleli all’asse dell’elica.
I residui R degli amminoacidi si estendono verso l'esterno dal nucleo del -elica.
La Prolina, il cui atomo di azoto fa parte di un anello a cinque membri, è più rigida degli altri
aminoacidi, e il suo legame C-N non può ruotare della quantità necessaria. Inoltre, non ha protoni
N-H con cui formare un legame idrogeno intramolecolare per stabilizzare l'elica. Così, la prolina
non può far parte di un -elica.
La struttura secondaria a fogli a pieghe si forma quando due o più di peptidi si dispongono uno
accanto all'altro. Tutti i -sheet hanno le seguenti caratteristiche:
 I legami C=O e N—H giacciono nel piano del foglietto.
 Il legame idrogeno si instaura tra i gruppi N-H e C = O dei residui amminoacidici vicini.
I gruppi R sono orientati sopra e sotto il piano del foglio, e si alternano da un lato all'altro lungo
una direzione.
 La disposizione a foglietto a pieghe si verifica più comunemente con aminoacidi con piccoli
gruppi R, come alanina e glicina. Con gruppi R grandi, le interazioni steriche impediscono le
catene di avvicinarsi insieme, e quindi la disposizione a foglio non può essere stabilizzata da
legami idrogeno.
La forza e l’elasticità del filo della ragnatela di ragno sono dovute alla presenza nella
catena proteica di regioni a foglietto ripiegato  e a regioni di -elica. Le regioni ad elica impartiscono l’elasticità, mentre le ragioni a foglietto ripiegato  impartiscono la
resistenza.
Differenti regioni della struttura secondaria della seta della ragnatela
La forma tridimensionale assunta dall’intera catena pepetidica è definita struttura
terziaria.



Le proteine generalmente si ripiegano in una conformazione di massima stabilità.
Nell’ambiente acquoso cellulare, questo generalmente dispone la maggior parte
delle catene laterali non polari all'interno della proteina, in cui le interazioni van der
Waals fra questi gruppi idrofobi aiutano a stabilizzare la molecola. In questa
disposizione, il maggior numero di gruppi polari e carichi rimangono sulla superficie
per massimizzare le interazioni a legame idrogeno con l’acqua.
La presenza di gruppi polari, di legami idrogeno e di gruppi laterali carichi -COO¯ e
–NH3+ possono stabilizzare la struttura terziaria tramite interazioni elettrostatiche.
La struttura quaternaria si origina quando due o più catene polipeptidiche si
aggregano tra loro tramite interazioni intermolecolari per dare origine ad un un
complesso proteico (sistema supramolecolare).
Rubisco
Emoglobina
• Ogni catena polipeptidica individuale è detta subunità della proteina totale.
• Un esempio è l’emoglobina che consiste di 2 subunità  e 2 subunità  tenute
insieme da forse intermolecolari in una forma compatta tridimensionale.
• La funzione dell’emoglobina è possibile solo quando le 4 subunità sono legate
insieme.
Le proteine sono generalmente classificate in base alla loro struttura tridimensionale

Le proteine fibrose sono costituite da catene di polipeptidi lineari lunghe che sono
intrecciate insieme per formare fasci. Queste proteine sono insolubili in acqua e
svolgono ruoli strutturali, dando forza e protezione ai tessuti e cellule.

Le proteine globulari sono arrotolate in forme compatte con superfici esterne idrofile
che le rendono idrosolubile. Enzimi e molecole di trasporto sono globulari per renderli
solubili nel sangue e in altri ambienti acquosi.
 Le -Cheratine sono le proteine che si trovano nei capelli, zoccoli, unghie, pelle e
lana.
 Sono composte quasi esclusivamente di lunghi tratti di unità di -elica.
 Sono molto insolubili in acqua.
 Le -Cheratine hanno anche un certo numero di residui di cisteina, e quindi possono
formare legami disolfuro tra le eliche adiacenti. Il numero di ponti disolfuro
determina la resistenza del materiale.
 Due eliche di -cheratina si attorcigliano a vicenda, formando una struttura chiamata
superelica. Questa a loro volta forma fasci sempre più grandi di fibre, in ultima analisi,
la formazione di una ciocca di capelli.
 La manipolazione dei legami disolfuro della -cheratina nei capelli può trasformare i
capelli da ricci in capelli lisci.
La Chimica della permanente
Per fare i capelli ricci bisogna prima rompere i ponti
disolfuro intercatena trasformandoli in gruppi tiolici
(–SH) per riduzione.
I gruppi tiolici S-H poi possono essere riossidati
rigenerando ponti disolfuro (S-S) intracatena e i
capelli diventano ricci.
Capelli lisci
Riduzione dei ponti disolfuro
Capelli ricci
L’ossidazione ricrea i ponti S-S
 Il collagene è la proteina più abbondante nei
vertebrati, si trova nei tessuti connettivi come
osso, cartilagine, tendini, valvole cardiache,
denti, pelle e vasi sanguigni.
 Gli amminoacidi L-glicina e L-prolina sono
presenti in una grande frazione di residui
aminoacidici, mentre la cisteina è poco presente.
 A causa dell'elevato contenuto di prolina, non si
può formare una -elica destrorsa. Invece, si
forma un elica allungata sinistrorsa, tre di queste
eliche si avvolgono l’una con l’altra per formare
un superelica destrorsa (o tripla elica).
Fibre di collagene
 Emoglobina e mioglobina sono proteine globulari.
 Esse sono chiamate proteine coniugate perché sono composte di una unità proteine e
una molecola non proteica chiamata un gruppo prostetico.
emoglobina
mioglobina
 Il gruppo prostetico di queste due proteine è l’eme, un
eme
composto di coordinazione organico contenente lo
ione Fe2+ complessato da atomi di azoto di un
composto eterociclico detto protoporfirina IX.
 Lo ione Fe2+ delle due proteine lega l’ossigeno nel
sangue.
 La Mioglobina stocca O2 nei tessuti, mentre
l’Emoglobina lo trasporta dove esso necessita.
Le strutture III e IV sono dovute alle interazioni intramolecolari e intermolecolari
–
Variazioni di temperatura, di pH, stress meccanico o la presenza di additivi (es. urea) sono
spesso sufficienti per distruggerle e causare la denaturazione della proteina.
• La denaturazione generalmente avviene sotto condizioni miti tali da non distruggere
generalmente la struttura primaria.
Riattivazione
Denaturazione
mite
Proteina attiva
Proteina inattiva
Proteina attiva
Denaturazione
• É accompagnata da cambi sia nelle proprietà fisiche che biologiche.
– La solubilità della proteina cambia drasticamente
•
•
Molti enzimi perdono tutta l’attività catalitica
Molte denaturazioni sono irreversibili
– In alcuni casi si verifica re-naturazione spontanea di una proteina spiegata alla sua struttura
terziaria stabile ed è accompagnata da un recupero completo delle funzioni biologiche.
CO O
-
CO O H
Protezione NH2
+
NH3
CO O
NH
-
I due amminoacidi sono
protetti in funzione della
sequenza ammino acidica
voluta; quindi sono fatti
reagire in presenza di un
agente di condensazione.
CO O
Protezione COOH
+
NH3
NH2
Condensazione
A secondo del gruppo deprotetto, la
sequenza sintetica può continuare
con il gruppo amminico o con quello
carbossilico.
O
NH
C HN
CO O
NH2-Deprotezione
COOH Deprotezione
O
H2N
C HN
O
CO O
NH
C HN
CO O H
Esempio
O
H3C
H
O
O
NH
OH
NH2
O
H3C
H
+
OH
H2N
NH2
Ala-Gly
Gruppi da proteggere
1. Potezione –NH2 Alanina
O
O
H3C
H
O
-
+
NH3
H3C
O
H
-
NH
PG
2. Potezione –COOH Glicina
O
O
+
H3N
+
O
-
H3N
O
PG
OH
3. Formazione legame ammidico
O
H3C
H
O
O
O
-
+
+
H3N
O
NH
DCC
PG
H3C
O
NH
H
O
NH
PG
PG
DCC =
N
C
N
4. Rimozione gruppi protettivi
O
H3C
H
PG
NH
NH
O
O
O
PG
H3C
H
O
NH
+
NH3
O
-
PG
 La sintesi in soluzione del legame peptidico va bene se usata per
costruire piccoli peptidi. Il metodo è molto laborioso ed è
impraticabile per la sintesi di grandi peptidi o proteine.
 Per sintetizzare grandi peptidi è molto più vantaggioso ed utile
utilizzare il metodo della sintesi in fase solida. Solid Phase Peptide
Synthesis (SPPS).
 La tecnica consiste nell’ancorare un ammino acido ad un polimero
insolubile e realizzare la sequenza primaria aggiungendo un ammino
acido alla volta. Poiché le impurità ed i reagenti sono solubili nei
solventi, al contrario del polimero, le fasi di purificazione sono molto
rapide ed efficienti. Alla fine la catena polipeptidica viene stacca dal
polimero.
Uno dei più comuni supporti solidi nella SPPS è un derivato del polistirene che contiene gruppi
clorometile (–CH2Cl), legati ad alcuni gruppi fenile del polimero (circa il 30%). La resina presenta quindi
dei gruppi clorobenzilici molto reattivi, adatti ad ancorare covalentemente gruppi che possono agire da
nucleofili.
Polistirene
Nu:
Ph
Ph
H2CO
HCl
Ph
Viene clorometilato circa il
CH2Cl
La clorometilazione viene oggi
fatta trattando il polimero con il
clorometiletere (ClCH2OCH3) e
SnCl4 come acido di Lewis.
Ph
30% del polistirene
Gruppo clorometile
Alla resina è ancorato il primo amminoacido. Il gruppo che dovrà formare in seguito il legame
ammidico, è mascherato tramite protezione.
Ancoraggio via COOH
R
Ph
HOOC
CH2Cl
NH
Boc
Ph
R
H
CH2OOC
NH Boc
H
Ph
Ph
Ancoraggio via NH2
R
Ph
PhCH2OOC
CH2Cl
NH2
Ph
R
H
CH2NH
COOCH2Ph
H
Ph
Ph
NH
CH2Cl + HOOC
R
Attacco del C terminale alla resina
H
NH
CH2 OOC
Purificazione mediante filtrazione e lavaggio
R
R
CF3COOH
CH2Cl2
Schema sequenza
sintetica
Reazione di deprotezione del gruppo es. Boc
NH2
CH2 OOC
Purificazione mediante filtrazione e lavaggio
R
R
NH
DCC
R1
Reazione per attaccare il secondo amminoacido
con l'ammino gruppo protetto
COOH
H
O R1
NH C
CH2 OOC
R
NH
H
+ Dicicloesilurea
Purificazione mediante filtrazione e lavaggio
R
CF3COOH
CH2Cl2
Reazione di deprotezione del gruppo es. Boc
O R1
NH C
CH2 OOC
R
R
NH2
H
Ripetizione dei vari passaggi
Bruce Merrifield
Premio Nobel per la Chimica nel 1984
 Con l’automatizzazione della
sua sintesi in fase solida egli
sintetizzò diversi polipeptidi.
 Nel 1962 sintetizzò un nonapeptide (bradykinin) in 8 giorni con una
resa totale del 68 %.
 Nel 1969 sintetizzò una ribonucleasi (124 ammino acidi), 369 reazioni
e 11.391 passaggi.
Oggi il Metodo di Merrifield è completamente automizzato
dddmag.com



Un robot, gestito da un computer, esegue i vari passaggi ripetitivi di accoppiamento,
lavaggio, protezione, deprotezione ed infine distacco della catena dalla resina.
Ogni passaggio avviene con alte rese.
Utilizzando questa procedura è possibile preparare circa 50 mg di polipeptide (20-30
amminoacidi) in maniera standard.
Effetto della resa dei singoli passaggi sulla resa complessiva
Numero residui
Ammino acidici
Resa complessiva (%) del peptide
96,0 (%)
99,8 (%)
11
66
98
21
44
96
31
29
94
51
13
90
100
1,7
82
Visto l’alto numero di passaggi, è fondamentale avere rese quasi quantitative nei vari step,
altrimenti la resa finale diventa veramente bassa.
Nei sistemi biologici la maggior parte delle trasformazioni chimiche cellulari sono catalizzate
da macromolecole dette enzimi, per la maggior parte sono di natura proteica, ma esistono
anche enzimi appartenenti agli acidi nucleici.
In base alla loro localizzazione nella cellula gli enzimi si possono classificare in:
idrosolubili e non solubili
l’α-chimotripsina, è un esempio di enzima idrosolubile, mentre la lipasi pancreatica è un
esempio di enzima che agisce all’interfaccia in mezzi microeterogenei come sono le
emulsioni.
Molto spesso gli enzimi vengono prodotti dalla cellula come precursori inattivi o “zimogeni”, che
vengono poi attivati nella sede in cui agiscono mediante tagli proteolitici.
Un esempio di questo tipo di attivazione è rappresentato dalle proteasi pancreatiche, prodotte dal
pancreas come zimogeni e riversate nell’intestino tenue dove assumono la forma cataliticamente
attiva.
Le caratteristiche che rendono gli enzimi dei catalizzatori importanti sono:
 Elevatissimo incremento di velocità- la velocità di reazione catalizzata da un enzima risulta da
6 a 12 ordini di grandezza superiore rispetto alla velocità della stessa reazione non
catalizzata;
 Condizioni di reazione blande- le reazioni catalizzate da un enzima avvengono in condizioni
piuttosto moderate, come bassa temperatura, pressione atmosferica e pH neutro, al
contrario di reazioni chimiche che molto spesso richiedono condizioni estreme di pH,
temperatura e pressione;
 Elevata specificità della reazione: gli enzimi sono altamente specifici sia per il substrato che
per il prodotto, per cui difficilmente si ottengono sottoprodotti, mentre la resa di prodotto si
avvicina al 100%, al contrario delle reazioni comuni che molto spesso producono
sottoprodotti indesiderati;
 Capacità di regolazione: l’attività enzimatica è rigidamente regolata mediante una serie di
meccanismi che vanno dagli effetti allosterici alla modificazione covalente, al controllo della
quantità di prodotto sintetizzato.
Ad esempio, le glicosidasi, che idrolizzano i polisaccaridi, aumentano la velocità di
reazione di un fattore più di 1017, modificando il tempo di reazione richiesto per
l’idrolisi da milioni di anni a pochi millisecondi.
Esempio di bio-polimero con funzione
catalitica (Enzima)
Enzima
Substrato
PM 480.000
Macromolecola
PM 60
Piccola molecola
Reazione catalizzata
(NH2)2CO + H2O → CO2 + NH3
Perché gli enzimi hanno una struttura polimerica?
L’efficienza catalitica di un enzima è legata alla sua azione multicatalitica, ciò è
all’azione contemporanea di più siti catalitici, che possono agire intramolecolarmente.
10
35
64
88
132
1. Una catena polimerica permette di avere numerosi siti catalitici, la flessibilità della
catena, inoltre, permette un arrangiamento dei siti catalitici in maniera di ottenere il
massimo effetto di prossimità.
64
132
35
10
88
Siti reattivi
2. Una catena polimerica permette di fornire una maggiore stabilità al complesso
Enzima-Substrato tramite interazioni deboli non covalenti.
3. Solo una lunga catena polimerica, una volta che si ripiega tridimensionalmente, è in
grado di fornire una complementarità stereochimica in grado di riconoscere la struttura
del substrato.
enzima
substrato
4. Solo una lunga catena polimerica, una volta che si ripiega tridimensionalmente, è in
grado di fornire un proprio microambiente di reazione.
Ulteriori ragioni perché gli enzimi devono essere delle macromolecole
 Associazioni multiple (cofattori, coenzimi, 2 substrati, ecc.)
 Funzioni multiple
 Associazione ad altri biolpolimeri
 Viscosità
 Proprietà idrodinamiche
 Etc.
Solo una catena polimerica comporta:
la formazione di un elevato
livello di complessità che determina
proprietà che non sono presenti nei
componenti di base
Sono altamente specifici nella loro azione
 Spesso, un enzima catalizza solo una singola reazione di un singolo substrato.
Il grado di specificità di un enzima è sempre molto grande e in alcuni casi totale. In natura esistono
numero moltissimi enzimi e la ragione di ciò è da ricercare proprio in questa loro caratteristica che
generalmente non permette l’uso dello stesso enzima per più reazioni diverse.
La specificità di un enzima si manifesta in vari modi:
esiste prima di tutto una specificità stereochimica a cui si uniformano tutti gli enzimi, quindi
Esiste una specificità di legame
Esiste una specificità di gruppo
Esiste una specificità di substrato
Specificità di ‘legame’ l’enzima riconosce solo il legame su cui deve agire, indipendentemente dal
contesto molecolare. Specificità di “gruppo” l’enzima è in grado di riconoscere sia il legame che il
gruppi adiacenti.
Specificità definita “assoluta” l’enzima riconosce e agisce soltanto su un particolare tipo di substrato.
Il motivo della specificità risiede soprattutto nella struttura tridimensionale dell’enzima, in particolare
nella struttura terziaria che ha un notevole effetto sulle distanze tra i vari residui amminoacidici.
Amminoacidi lontani tra loro nella struttura primaria possono essere avvicinati nella struttura terziaria
mediante un ripiegamento che porta ad una determinata conformazione; tale ripiegamento è reso
possibile da interazioni deboli come legami idrogeno, ponti disolfuro, forze di van der Waals, interazioni
idrofobiche ed interazioni elettrostatiche.
Differenti enzimi hanno differenti specificità
•
Alcuni agiscono specificatamente su un singolo substrato.
– L’amilasi, per esempio, catalizza solamente l’idrolisi dell’amido
per dare glucosio.
•
Altri enzimi, invece, sono in grado di operare su un “range” di
substrati.
– La papaina, enzima proteolitico, è proteina globulare costituita
da 212 ammino acidi (dal frutto della papaia) catalizza l’idrolisi
di molti tipi di legami peptidici.
Papaina
La demolizione dell'amido in frammenti più piccoli ha inizio nella bocca ad opera di una sostanza
presente nella saliva: l'amilasi salivare o ptialina.
L’amilasi è un enzima che catalizza la reazione di rottura del legame glucosidico 1-4 (idrolisi legame
acetalico) nei carboidrati complessi come l’amido, formando maltosio. L’amilasi è presente nella
saliva e nel succo pancreatico.
Amilasi
Amilasi
Amido
Maltosio
-amilasi salivare umana
Ca++, Cl-
Glucosio
L’azione catalitica dell’enzima.
 L’abilità dell’enzima è quella di stabilizzare, e cosi abbassare l’energia dello stato di
transizione (ST) o degli stati di transizione coinvolti nella reazione.
 Il sito attivo dell’enzima è complementare allo stato di transizione della reazione
che viene catalizzata.
 L’enzima interagisce (si associa o si lega) allo stato di transizione con costanti di
associazione che sono fino a 1012 volte più alte rispetto alle costanti di associazione
del substrato o del prodotto della reazione.
Tutte le reazioni chimiche che avvengono negli organismi viventi sono catalizzate dagli enzimi.
La catalisi procede attraverso la formazione di complessi tra l'enzima e i reagenti.
La più semplice reazione catalizzata da un enzima può essere così rappresenta da:
E + S  E-S  E-P  E + P
L’azione enzimatica si sviluppa attraverso un percorso che coinvolge inizialmente la
formazione di un complesso enzima substrato E-S, successiva conversione chimica multistep del substrato legato all’enzima nel complesso enzima prodotto E-P, ed in fine il rilascio
del prodotto dal complesso.
Turnover number
• Rappresenta il numero di molecole di substrato che l’enzima converte nell’unità di
tempo in prodotto. Generalmente si hanno valori di 103 al secondo.
Meccanismo della catalisi enzimatica
Chiave-serratura
Adattamento indotto
Molti enzimi, come già abbiamo accennato in precedenza, contengono (o hanno
bisogno) di cofattori per espletare la loro attività catalitica.
Cofattore


Può essere anche una specie inorganica, come per esempio lo ione Zn2+
Possono essere molecole organiche di piccole dimensioni detti coenzimi
Coenzima


Una specie chimica che subisce una trasformazione durante la reazione catalizzata
dall’enzima ed ha bisogno di essere rigenerato tramite un passaggio aggiuntivo.
Molti coenzimi derivano da strutture di vitamine .
– Esempi sono:






Coenzima A dal pantotenato (vitamina B3),
NAD+ dalla niacina
FAD dalla riboflavina (vitamina B2)
Tetraidrofolato dall’acido folico
Piridossale fosfato dalla piridossina (vitamina B6)
Tiamina difosfato dalla tiamina (vitamina B1)
Molti coenzimi derivano la loro struttura da quella delle vitamine, sostanze che vengono introdotte
con i cibi in quanto non sono sintetizzate dall’organismo. Alcuni esempi sono:
O
S
NH2
S
N
OH
O
O
-
H
O P O P O P
O
Acido lipoico
Trasferimento gruppi acilici
O
-
O
-
O
O
N
O
N
O
-
-
O
- P
O
COH
N
N
H
OH OH
Piridossale fosfato
Metabolismo amminoacidi
dalla Vitamina B6
NH2
N
N
O
O
H3C CH
3
HS
-
O
NH
NH
OH
-
O
O
O
P
O
O
N
N
O
P
O
-
-
Coenzima A
Trasferimento gruppi acilici
dalla Vitamina B3
OH
CH3
Adenosina trifosfato (ATP)
Fosforilazione
CoASH
+
O
O
O
P
O
OH
Poiché tutte le trasformazioni chimiche coinvolte nei processi biologici,
avvengono in un ambiente acquoso sono necessari speciali attivatori detti coenzimi, che
facilitano l’azione enzimatica. Variazioni strutturali di queste molecole portano a
drastiche variazione dell’attività biologica.
Coenzima A (un Tiol-coenzima)
Gruppo tioestere
O
HS-CoA +
CH3COO-
CoA
H3C
H acidi, sito nucleofilo per
reazioni di condensazionie
(reazione di Claisen)
S
Sito elettrofilo,
trasferimento
del gruppo
acile
L’α-chimotripsina è un enzima globulare di massa 24800 dalton, costituita da 291 residui
amminoacidici che costituiscono tre catene polipeptidiche unite da due ponti disolfuro intercatena; la
struttura tridimensionale ha la forma di un ellissoide compatto di dimensioni 51 X 40 X 40 Å,
paragonabile ad una sfera di raggio 22 Å. L’enzima presenta molte regioni con struttura β antiparallela
e poche regioni ad α elica; tutti i gruppi carichi sono sulla superficie della molecola (residui lisinici).
L’α-chimotripsina è un enzima digestivo dei mammiferi appartenente alla classe delle serino-proteasi
(come la tripsina, la trombina e l’elastasi).
viene secreta dal pancreas come zimogeno e riversata nell’intestino tenue dove subisce un taglio
proteolitico ad opera della tripsina, assumendo così la conformazione cataliticamente attiva per l’idrolisi
delle proteine alimentari.
È specifica per la scissione di legami peptidici sul lato carbonilico di amminoacidi con catene laterali
aromatiche come tirosina, triptofano, fenilalanina; riconosce e taglia anche legami esterei, purchè venga
mantenuta la specificità di gruppo.
Il sito catalitico si trova in una tasca idrofobica che esclude il solvente, per cui il gruppo ossidrilico
del residuo Serina 195 che si trova all’interno è altamente reattivo e consente la formazione di un
legame covalente con il substrato; il potere nucleofilo dell’ossigeno ossidrilico è inoltre esaltato da
un meccanismo a rilascio di carica ad opera dei residui Istidina 57 e Aspartato 102 che insieme alla
Serina 195 costituiscono la triade catalitica.
Studi condotti sull’idrolisi del legame estereo del p-nitrofenilacetato hanno
dimostrato che la reazione avviene in due passaggi
Nel sito attivo sono presenti tre amminoacidi (triade catalitica) responsabili
dell’attività catalitica:
-
O
O
O
-
-
O
H
N
O
OH
OH
O
+
+
+
NH3
NH3
Serina-195
NH3
N
Istidina-57
O
Acido aspartico-102
La - chimotripsina presenta una alta specificità per legami ammidici in cui sono coinvolti
amminoacidi di tipo aromatico (selettività di substrato).
COO
+
H3N
-
H
CH2
COO
+
H3N
-
H
CH2
COO
+
H3N
H
CH2
N
OH
Fenilalanina
Tirosina
-
Triptofano
Schema generale del processo idrolitico:
O
║
Enz-OH + R-C-X
O│
Enz-O-C-X
│
R
[Enz-OH · R-CO-X]
Complesso di Michaelis
-HX
O
║
Enz-OH + R-C-OH
R = Fenilalanina, Triptofano, Tirosina
X = OR’, NHR’
O│
Enz-O-C-R
│
OH
H2O
O
║
Enz-O-C-R
Acil-enzima
Catalisi covalente
Ia Ipotesi
Serina-195
H
N
N
H
Catalisi basica generale?
O
Istidina-57
IIa Ipotesi (sulla base di dati cristallografici)
Charge-relay system
Allineamento dei tre amminoacidi
Triade catalitica
O
Aspartico-102
-
O
Serina-195Serina-195
H
N
N
H
O
R
Istidina-57
X
O
Charge-relay system
Intermedio tetraedrico carico (-)
Stabilizzazione dell’intermedio tetraedrico carico (-)
tramite formazione di legami ad idrogeno
pKa His-57 > pKa Asp-102
O
Aspartico-102
Serina-195Serina-195
-
H
O
N
N
H
O
NH
Istidina-57
R1
R2
O
O
Aspartico-102
Serina-195
-
O
H
N
+
N
H
R2
Istidina-57
O
R1
NH
O
-
Intervento del legame ad H con l’azoto ammidico