DIAGNOSTICA MOLECOLARE E GENETICA MEDICA
Seconda lezione 2009:
GENOMA UMANO e sua
organizzazione
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Prof. Massimo Zollo
E-mail : [email protected]
Riceve il venerdi dalle 15:00 alle 16:00
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Libri da consultare:
Genetica in Medicina (Thompson and Thomson)- Idelson Gnocchi
Tom Strachan: Genetica Umana Molecolare UTET
Eredita’ Cummings- II edizione EdiSES
Genetica Clinica Andrew Read-Zanichelli
STUDENTS AREA:
LESSONS IN MEDICAL GENETICS
http://www.ceinge.unina.it/~zollo/zollo.webpage.htm
-Cenni di cito-genetica Poliploidie-aneuploide
Mitocondrio….
3X109 coppie di basi
22.000 geni
70.000 ncRNAs
16569 coppie di basi
e possiede 37 geni
cagtactgctagctagtcatgcgactgatgtagctagctatcgtagctgactagtgctgacgactgtcgcttttcttatcgtatg
gctagtcgatgtactagctgatcgatctagcagctgatcgtagctagtcgatatgctacgtgctagtcgtatttcgatatctagta
gtctactagtcgatcgtagctgactgatcgtagctagtcgtacgatgtagctagctagctgatcgatcgatgtgtattgctagt
gtcagtaggtcatgtacgtgctgatgctacgtgtagtttgatgttatgcttagaggctagtgatgtcgttatggcatgagtcatgt
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ggatagtgctttttaatatatatatattatttatgctagtagccgcggatttggggggcattgcagcgggcggggctgctcagtct
ggcgcatcacacagccacgatygcatgcttcgatctgctacgacgatcgatccatcgatacgtagcgactatgtcgtcgcag
ggtgtagtgatcgtagctagctagctatcgatgctagtgctgctagtcgtagctagctagctgactatttatgcatgtagtgcagt
cgagtgtctagctagctagctacgtacgtacgtagctacgtacgtacgatcgtagctactagctatattgctagatcgcgtatt
Cariotipo umano
NUMERO DI CROMOSOMI
Gorilla= 48
Cane=78
Uomo=46
Rana=26
Mosca=12
Topo=40
Texas red/CpG
Verde isotiocianato/Replicazione tardiva
Nero-sovrapposizione
NORMALE
TUMORALE
AMNIOCENTESI
Solo a 16 settimane
Prelievo cellule amniotiche
1% induce aborti spontanei
Rischio infezioniEffettuata solo per donne:
-Sopra i 35 anni nella donna
- Storia di gravidanza con aborti
-disordini associati all’X
-riarrangiamenti cromosomici
nei genitori
PRELIEVO DA VILLI CORIALI
CVS analyses (chorionic Villi sampling)
8-10 settimane
Alta sensibilità,
poche ore di saggio
DIAGNOSI PRENATALE PRECOCE
Scoperte cellule del sangue nel liquido amniotico .Lo studio è di un team di ricercatori italiani.
Speranzaper la cura di malattie genetiche su bimbi ancora in utero. 9Marzo 2009 Blood
• Poliplodie (corredo cromosomico variato
….piu’ cromosomi)
• Aneuploidie (cromosoma di una
coppia…in meno o in piu)
• ANEPLOIDIE possono essere:
• 1) legate a cromosomi sessuali
• 2) legate a cromosomi autosomici
Poliplodia avviene per:
1) errore della meiosi durante la formazione dei gameti
2) Eventi anormali al momento della fecondazione
3) Errori nelle mitosi successive alla fecondazione
Poliplodia- triploidia
Avviene principalmente al momento della fecondazione
per di-spermia, 2 spermatozoi–una cellula uovo
Incompatibilità con la vita:
Morte dal secondo al quarto mese di età
LA NON DISGIUNZIONE……..
Gli aborti hanno anomalie cromosomiche (trisomie)
Ch.16,21,22
•TRISOMIA DEL CROMOSOMA 13, sindrome di Patau
La sindrome di Patau è una malattia genetica molto rara con frequenza 1/5000, 1/20000 bambini nati, colpendo per lo più femmine.
Il cariotipo dell'individuo che ne è affetto presenta tre copie del cromosoma 13 invece delle normali due, per tale motivo questa
sindrome viene anche chiamata Trisomia 13. Le anomalie fenotipiche sono numerose: labioschisi e palatoschisi, polidattilia
(dita delle mani e dei piedi in soprannummero), occhi piccoli, ritardo psico-motorio, cardiopatia, encefalopatia, anoftalmia, criptoftalmia
o ciclopia. La maggior parte degli individui muore entro i primi tre mesi di vita. Terapia: sintomatica. Citogenetica: trisomia 13 primaria,
derivata da non disgiunzione meiotica o mitotica; trisomia 13 secondaria, da traslocazione robertsoniana.
Provoca danni al sistema nervoso centrale ed all'apparato cardiaco.
TRISOMIA CROMOSOMA 18
Sindrome di Edwards
La sindrome di Edwards è una malattia genetica rara che si manifesta con una frequenza di 1/3000, 1/8000 dei
nuovi nati, prevalentemente femmine, ed aumenta all'aumentare dell'età della madre. Viene anche chiamata
Trisomia 18 poiché il cariotipo di questi individui presenta tre cromosomi 18 invece di due. ritardo generale di
sviluppo, anche durante la gravidanza 90% dei bambini affetti muore nei primi sei mesi di vita per problemi cardiaci
Circa nel 95% dei casi, la causa di questa anomalia genetica è
la mancata disgiunzione dei cromosomi che si verifica durante
una delle divisioni meiotiche che portano alla formazione dei gameti
della madre; ne consegue che lo zigote avrà un assetto di 47
cromosomi, con un cromosoma 21 soprannumerario ……
1:800 bambini nati……alta incidenza…??
Cause:
Meiosi femminile: cellula uovo
-In profase I della prima divisione meiotica
prima della nascita. L’ovocita della donna di 40 anni
è rimasto in meiosi I, per 40 anni
-interazione embrione utero- aneuplodie rendono positivo
l’attecchimento “impianto” dell’embrione selezione positiva
a 20 anni rischio, 0,05%
a 35 anni rischio 1%
a 45 anni rischio 3-4%
ALTERAZIONI CROMOSOMICHE COMUNI
(-) delezioni di parti di cromosomi
e malattie associate!
• 5p- Sindrome Cri-du-chat, anomalie facciali e
ritardo mentale
• 11q- Tumore di Wilms, tratto renale genitourinario
• 13q- Retinoblastoma (tomore all’occhio, altri tipi
di tumore, assenza del TS-Rb
• 15q- Sindrome di Prader Willi- astenia ed
accrescimento lento, obesità, attacchi di
compulsivi di fame
TRASLOCAZIONI ROBERTSONIANE, DOWN sindrome
FREQUENZA DELL ANEUPLOIDIE
LA NON DISGIUNZIONE, LA DISOMIA UNIPARETALE
RUSULTATO: ZIGOTE MONOSOMICO
Casi di emofilia legata al cromosoma X
Prader Willi e Angelman
FMR1 - RITARDO MENTALE
(tre basi nucleotidiche ripetute (CGG)
La sindrome di Martin-Bell o del cromosoma X fragile (FRAX) è la forma più comune di ritardo mentale
dopo la sindrome di Down, in quanto interessa 1:1250 maschi e 1:2000 femmine.
Si tratta di una malattia ereditaria causata dall'alterazione di un gene situato nel cromosoma X .
Il nome "X fragile" deriva dal fatto che queste alterazioni provocano delle modificazioni nella struttura del
cromosoma, che al microscopio presenta una strozzatura in un punto preciso (quello in cui è situato il gene).
La FRAX colpisce molto più frequentemente i maschi rispetto alle femmine, dato che queste ultime possiedono
2 copie del cromosoma X.
http://www.laboratoriogenoma.it/prestazioni_sottocategoria.asp?IdCat=18&IdSubCat=87
Velocità di Riassociazione del DNA, ha determinato la presenza di regioni
di DNA nel genoma: A, B, C
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•
Cot ---Ævalore (Cot)
Co= concentrazione iniziale del DNA in moli/nucleotidi/litro
t=tempo di riassociazione in secondi ad una certa temperatura del DNA
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•
A) DNA in singola copia (60%)
B) DNA moderatamente ripetitivo (30%)
C) DNA altamente ripetitivo (10%)
MOUSE chromosome 3q
DOTPLOT-PIPMAKER analyses
HUMAN chromosome 1q21
HUMAN chromosome 1q21
DOTPLOT analyses
HUMAN chromosome 1q21
Seguirà un intervento di una mia assistente…..
Che da 3 anni sta studiando una sequenza …poi rilevatasi un Alu…
che ha potenzialità terapeutiche….ma non vi parla della ricerca…..
ma di che cosa sono le…SINES (Alu) e le LINES (KpnI)
Aldo Masullo, Il Mattino
Domenica 8 Marzo 2009
“nell’epoca della conoscenza generalizzata
……..l’UNIVERSITA’ è la cerniera tra la formazione
secondaria e la ricerca scientifica. Se la sua struttura
non è adeguata alle sue intrinseche tensioni
funzionali-tra didattica-ricerca e cultura di massa e
selezione di élite creative, incessante innovazione e
continuità da preservare, sviluppo tecnologico e
riflessione umanistica, servizio alla società e
illimitabile libertà del pensiero-, s’inceppa il circolo
virtuoso di economia e cultura da cui dipende il vivere
civile……”
IL NUMERO DI GENI, AUMENTA CON LA COMPLESSITA’
DELL’ORGANISMO?
~22,000 genes ~26,000 genes ~50,000 genes
Assenza di correlazione tra numero di geni e dimensione del
genoma negli eucarioti
Gene number
Genome size (Mb)
100000
10000
1000
100
10
1
human
mouse
chicken
xenopus
zebrafish
fugu
ciona
fly
worm
yeast
39
Compattezza di alcuni genomi eucariotici
Proprietà
del genoma
Densità genica
(numero medio di
geni per Mb)
Introni per gene
(media)
% del genoma
occupata dalle
ripetizioni
intersperse
S.cerevisiae
D.melanogaster
H. sapiens
479
79
11
0,04
3
9
3,4%
12%
44%
Le regioni non-codificanti del genoma concorrono alla complessità genotipica
e fenotipica di un organismo.
IL GENOMA UMANO
Ripetizioni Intersperse nel Genoma Umano
Gli elementi ripetuti interspersi costituiscono
cirva il 45% del genoma umano.
• LINE (Long interspersed nuclear elements)
– L1, L2, L3 LINE ( ~21% del genoma, ~100,000 copie)
• SINE (Short interspersed nuclear elements)
– Alu (~10,7% del genoma, ~1,200, 000 copie)
– MIR, MIR3 (~3% del genoma, ~500,000 copie)
• Elementi LTR (Long Terminal Repeats)
– ERV, MalR (8% del genoma, ~500,000 copie)
• Transposoni a DNA
– MER1 (Charlie), MER2 (Tigger), others (2,8% del genoma, ~350, 000
copie)
44
LINEs:long interspersed nuclear elements
promotore
Pol II
RNA binding
anche endonucleasi
ripetizioni
dirette
Lunghezza: 6-7 kb
3 Famiglie di LINEs:
-L1 (attive) possono inserirsi nel genoma ed attivare geni con conseguente insorgenza
di malattie
-L2 e L3 (inattive)
6-7kb
45
Meccanismo di trasposizione degli elementi LINEs
1. Generazione di un trascritto LINE full-length a partire dal promotore.
2. ORF1 e ORF2 vengono tradotte e legano il LINE mRNA.
orf2
5’
3’
orf1
3. Il complesso LINE mRNA/ORF1/ORF2 si sposta nel nucleo, dove l’attività
endonucleasica di ORF2 taglia il dsDNA. L’estremità libera al 3’ (sul DNA)
funge da innesco per la retrotrascrizione a partire dal 3’UTR.
5’
orf2
3’
orf1
5’
3’ 5’
3’
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SINEs: short interspersed nuclear elements
A
B
AAAA
promotore
Pol III
Sono elementi non-autonomi
Lunghezza: tra 0.1 e 0.4 kb
3 famiglie di elementi SINEs:
l’elemento Alu, ancora attivo,
MIR e Ther2/MIR3, elementi inattivi
Gli elementi SINEs non contengono alcuna ORF codificante per una trascrittasi inversa,
ma sono in grado di trasporre utilizzando la trascrittasi inversa sintetizzata da altri
retroelementi (trasposizione LINEs-dipendente).
47
SINEs: short interspersed nuclear elements
•L’elemento Alu, il più comune nei primati, è lungo 0,3kb
•è presente in circa 1.200.000 di copie nel genoma umano e rappresenta
quindi oltre il 10% di tutto il genoma
•sono localizzate a monte o a valle dei geni, negli introni, nelle regioni 5’ e 3’
non tradotte dell’mRNA.
•Sono distribuite uniformemente nel genoma, con un intervallo medio tra
100-5000bp
48
Evoluzione e classificazione degli elementi Alu
Gli elementi Alu sono classificati in sottofamiglie che si differenziano per l’epoca della loro
integrazione nel genoma, dalle più antiche (Sx, J) alle più recenti (Yc1, etc.).
49
Meccanismo di retroposizione dell’elemento Alu
Si pensa che il taglio al sito di
inserimento sia opera della L1
endonucleasi
Target-primed reverse
transcription (TPRT)
Il promotore pol III è necessario ma non
sufficiente per la trascrizione che
richiede anche sequenze fiancheggianti
appropriate. La maggior parte degli
elementi Alu integrati non è attiva in
quanto non viene integrata in un
contesto favorevole e muta rapidamente
sia nelle sequenze CpG che nella
regione ricca in A.
50
da: Batzer and Deininger, Nature Rev. Gen. 3:370380, 2002)
Danni genomici indotti da Alu
Numerose patologie sono provocate dall'integrazione casuale di Alu
(Neurofibromatosi, haemophilia, sindrome di Apert, ecc.) o da ricombinazione
disuguale (diabete di tipo II, sindrome di Lesch–Nyhan, malattia di Tay–Sachs,
ipercolesterolemia familiare, α-thalassaemia, ecc.).
51
Neurofibromatosi (OMIM 162200 162210)
-Autosomica dominante
- Prevalenza 1-5 / 10 000
-presenza di numerosi tumori benigni fibrosi (fibromi) della pelle e del tessuto nervoso.
Sindrome di Apert (OMIM:101200)
-Autosomica dominante
- Prevalenza 1/50.000 nati
-facio-craniostenosi e sindattilie ossee e cutanee alle mani e ai piedi
-Ritardo mentale
-Inserzione di un ALU nel gene FGFR2
BRCA1
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BRCA1 è un’oncosoppressore le cui mutazioni sono associate con il
cancro alla mammella
È lungo circa 80kb ed il 40% è costituito da elementi Alu
L’mRNA di BRCA1 viene prodotto in 2 isoforme che differiscono
nella 5’-UTR e nell’espressione.
Quello con la 5’-UTR più corta è espresso sia nel tessuto mammario
sano che tumorale
Quello con la 5’UTR più lunga, dovuta all’integrazione di un
elemento Alu, è espresso solo nel tessuto tumorale
Viene tradotto meno efficientemente poichè l’elemento Alu ha una
delezione di 60 nt nella left arm.
Identificazione Bioinformatica di elementi ripetuti
www.repeatmasker.org
RepBase colleziona gli elementi ripetuti noti in una serie di organismi
56
Nel genoma umano ci sono circa il doppio di elementi Alu
che nel genoma dello chimapanzee.
Ciò significa che forse nello chimpanzee questi elementi
sono stati meno attivi!!!
