La spettroscopia EPR

La spettroscopia EPR
Metodi Chimici
z
z
z
Gli intermedi radicalici nelle reazioni chimiche sono di solito così
altamente reattivi da precludere la loro individuazione o il loro
isolamento attraverso metodi fisici.
La loro momentanea esistenza può essere d’altronde accertata
intrappolandoli con dei reagenti per i quali essi hanno un’alta
affinità e con i quali essi si combinano per dare prodotti stabili che
possano poi essere isolati ed identificati.
Ad esempio l’aggiunta di toluene ad una reazione radicalica
permette al radicale intermedio di strappare ad esso un atomo di
idrogeno per formare il persistente benzil radicale, che vive nel
sistema reagente fino a quando non dimerizza per formare il
difeniletano o altri prodotti identificabili. Se tali prodotti non
vengono isolati si può ipotizzare che non ci siano intermedi radicalici
anche se la loro presenza non può comunque essere esclusa.
Metodi Chimici
z
z
z
z
Abbastanza frequentemente la natura dei prodotti di reazione ci dà un
indizio sulla presenza o meno di intermedi radicalici. Le reazioni omolitiche di
solito danno origine ad una gran varietà di prodotti che si formano per
estrazione, addizione, dimerizzazione, frammentazione, ecc. e attraverso
una attenta analisi dei prodotti i radicali coinvolti possono spesso essere
identificati.
La natura omolitica di una reazione può anche essere spesso dedotta da
evidenze di catalisi o di inibizione.
Se l’addizione di sostanze capaci di produrre radicali (ad esempio
perossidi) o l’applicazione di luce ultravioletta, che dà origine a radicali
attraverso la rottura omolitica dei legami, accelera la reazione è possibile
che un meccanismo attraverso dei radicali liberi sia operante.
Al contrario l’addizione di inibitori che riducono la concentrazione dei
radicali reagenti rallenterà o inibirà le reazioni radicaliche. Inibitori di
questo tipo sono di solito sostanze che contengono atomi di idrogeno reattivi
(come ad esempio i fenoli o le ammine aromatiche).
EPR
z
z
Uno dei metodi spettroscopici più usato e
conosciuto per l’individuazione di radicali è la
spettroscopia di risonanza di spin elettronico
(EPR o ESR)
La spettroscopia di risonanza di spin elettronico
è una tecnica che permette lo studio di radicali
liberi stabili o persistenti. Essa permette inoltre
lo studio di specie radicaliche transienti che si
formano nel corso di una reazione.
Basi teoriche
z
z
z
Come sappiamo l'elettrone è una particella
subatomica, che possiede una certa massa ed
una certa carica, dotata di un movimento di
rotazione attorno a se stessa che viene chiamato
spin (trottola).
Tale spin può essere uguale ad ½ o a -½ a
seconda del verso in cui ruota l’elettrone.
A causa della sua rotazione l'elettrone genera
un campo magnetico.
z
Nel caso in cui l’elettrone venga sottoposto ad
un campo magnetico esterno l’energia dei due
stati di spin, che in condizioni normali sono
degeneri, viene modificata a causa
dell’interazione del campo magnetico esterno
con quello generato dall’elettrone.
Splitting dei livelli di spin di un elettrone in presenza di un campo magnetico H.
z
La differenza di energia che si viene a creare tra
i due stati di spin è uguale a:
ΔE = gEβEH
z
dove:
H è il campo magnetico applicato,
z βE è una costante detta magnetone di Bohr
(9,2733 x 10-21 erg/gauss)
z gE è un numero adimensionale che per l’elettrone
libero vale 2,0023 e che per gli elettroni in atomi
o in molecole (cioè non isolati) ha un valore che
dipende dall’intorno dell’elettrone.
z
z
Quando l’elettrone è esposto ad una radiazione
elettromagnetica appropriata la cui frequenza ν soddisfa
la condizione di risonanza:
hν = gEβEH = Ea - Eb
z
sono possibili transizioni tra i due livelli energetici cioè gli
elettroni possono assorbire o emettere energia per
passare da uno stato all’altro.
z
Allo stesso modo irradiando l’elettrone con una
radiazione di frequenza ν costante, e variando la
forza H del campo magnetico applicato si può
raggiungere il valore che soddisfa la condizione
di risonanza.
z
Quando tale condizione è soddisfatta, le
transizioni degli elettroni da uno stato all’altro
possono avere luogo in entrambe le direzioni
dando luogo ad assorbimento
(Eb → Ea) o ad emissione (Ea → Eb) di energia.
z
z
z
Il sistema nel suo complesso assorbirà o
emetterà energia a seconda della direzione del
maggior numero di transizioni, e poiché le due
transizioni hanno la stessa probabilità di
avvenire, la popolazione dei due livelli a e b ha
un’importanza determinante.
Si avrà così assorbimento solo quando la
popolazione del livello più basso è più grande di
quella del livello più alto.
La legge di distribuzione di Boltzman predice un
leggero eccesso di popolazione nel livello più
basso per cui di solito si avrà assorbimento
anche se molto piccolo.
z
A causa dei bassi livelli di assorbimento che di
solito vengono ottenuti, per aumentare
l’intensità del segnale registrabile nella tecnica
EPR si usa registrare lo spettro di assorbimento
come derivata prima.
i) Segnale EPR (assorbimento) ottenuto a frequenza costante e intensità H
del campo variabile; ii) Derivata prima del segnale di assorbimento EPR.
Strumentazione
z
Uno spettrometro EPR consiste di:
z
z
z
z
z
un elettromagnete, il quale permette di variare con
continuità il campo magnetico applicato
un generatore di radiazioni elettromagnetiche che emette
microonde in un campo molto ristretto di frequenze
una cella portacampioni
un rilevatore che permette di
misurare l’entità
dell’assorbimento subito dalla
radiazione elettromagnetica.
I segnali forniti dal rilevatore
vengono registrati in funzione
dell’intensità del campo
magnetico.
Radicali organici
z
z
*
Nello stato fondamentale dei composti organici
stabili, sia gli orbitali interni che quelli di legame
sono occupati ognuno da due elettroni che
differiscono solo per il valore di Ms (gli elettroni si
dicono accoppiati e si indicano generalmente con
il simbolo ↑↓).
Lo stato di un sistema è un singoletto in quanto
ha molteplicità* 1 ed è diamagnetico.
Un singoletto è una molecola con un'unica funzione d'onda e che non ha elettroni
spaiati. Un doppietto e un tripletto hanno funzioni d'onda che possono essere scritte
in due e tre modi, rispettivamente come conseguenza della presenza di uno o due
elettroni spaiati. In generale il numero di elettroni spaiati +1 corrisponde alla
molteplicità della molecola.
Radicali organici
z
z
Nel caso in cui una molecola organica abbia un
orbitale occupato da un solo elettrone spaiato,
allora esso si troverà in uno stato di doppietto e
sarà paramagnetica dando luogo ad uno spettro
EPR.
Il paramagnetismo di tali molecole deriva quasi
esclusivamente dallo spin dell'elettrone spaiato,
cosicché i loro valori di ge (o più semplicemente
g) differiscono solo di poco da quello tipico
dell'elettrone libero (2,0023).
Radicali organici
z
z
z
Nei radicali organici l’elettrone può interagire
con il nucleo dell’atomo in cui si trova e con i
nuclei adiacenti dando origine ad un insieme di
assorbimenti.
Il segnale EPR ben risolto di un radicale organico
può contenere anche più di cento linee ed è per
questo che si parla di spettri EPR.
La complessità degli spettri dipende
dall’interazione dell'elettrone spaiato con i nuclei
con numero quantico di spin nucleare non
nullo presenti nel radicale.
Momento magnetico nucleare
z
Analogamente al caso dell'elettrone infatti,
anche i nuclei degli atomi possono possedere un
momento magnetico nucleare che dipenderà dal
numero di neutroni e di protoni che contengono.
z
Esso sarà associato al numero quantico di
spin nucleare I.
Valori di I
z
z
z
I = multipli dispari di ½ per nuclei che possiedono un numero di massa
dispari:
z
1/2 per
1
1H,
13
z
3/2 per
11
5B,
23
z
5/2 per
55
25Mn
z
7/2 per
51
23V,
6C,
19
9F,
11Na,
133
33
31
15P
16S,
39
55Cs,
19K,
63
29Cu
etc.
I = numeri interi dispari per nuclei che possiedono un numero di massa pari
e carica nucleare dispari:
z
1 per
2
1H,
14
z
3 per
10
7N
5B,
etc.
I = 0 per nuclei con numero di massa pari e carica nucleare pari poiché
hanno un numero quantico di spin nullo:
z
0 per
12
6C,
16
8O,
32
16S,
etc.
Splitting
z
L’interazione dell’elettrone spaiato con uno o più
di questi nuclei sdoppia il segnale che deriva
dall’elettrone. Il numero di linee che vengono
ottenute dall’interazione con n nuclei equivalenti
sono date dall’equazione:
numero di linee = 2 n I +1
z
dove:
n è il numero di nuclei equivalenti
interagiscono
z I è il numero quantico di spin nucleare
z
che
Esempi
Splitting di un segnale ESR originato dall'interazione
dell'elettrone spaiato con un nucleo avente numero
quantico di spin I = ½ (a sinistra ) o I = 1 (a destra).
Costante di accoppiamento
z
La separazione tra le righe si chiama costante di
accoppiamento ed è caratteristica di ogni nucleo in ogni
composto radicalico.
z
Essa ci dà una misura di quanto un particolare nucleo
interagisca con l'elettrone spaiato
z
Ad esempio nel caso di un atomo di
idrogeno l’elettrone viene splittato in due
dal nucleo dell’idrogeno: in questo caso
la distanza tra le righe è di circa 500
Gauss.
Metil Radicale
z
Nel caso del metil radicale l’elettrone interagisce con tre
nuclei di idrogeno equivalenti: il segnale viene splittato in un
quartetto con costante di accoppiamento di circa 230 Gauss.
H
C
z
Per tre nuclei equivalenti
aventi spin = ½ infatti lo
spettro consiste di quattro
righe aventi intensità
relative 1:3:3:1, tutte
ugualmente separate tra
loro.
H
H
La notevole differenza di accoppiamento riscontrata in H· e CH3· è da ricercarsi nel fatto che nel metile l'elettrone spaiato è
localizzato sull'atomo di carbonio, cioè più lontano dagli atomi di idrogeno che interagiscono quindi in minor misura con esso.
Intensità delle righe (I = ½)
N° righe e intensità relative
N° atomi eq. con I = 1/2.
0
1
2
3
4
5
Intensità delle righe (I = 1)
N° righe e intensità relative
N° atomi eq. con I = 1
0
1
2
3
4
Atomi diversi
z
z
Una situazione molto più frequente è quella in cui
si abbia la contemporanea presenza di nucleo
non equivalenti che intagiscono con l’elettrone
spaiato.
In questo caso vale la formula:
(2nA IA + 1) (2nB IB +1) etc. = No. Totale di righe.
dove nA sono il numero di nuclei equivalenti con momento magnetico nucleare IA,
nB il numero di nuclei equivalenti con momento magnetico nucleare IB, ecc.
Benzochinone radicale anione
O
O
H
O
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
.
H
O
O
(2 * 4 * 1/2 +1) = 5 righe
O
Di-tert-butilnitrossido
CH3
H3 C
C
CH3
N
CH3 O
C
CH3
CH3
(2 * 1 * 1 + 1) = 3 righe
N-tert-butil-N-(2,2-dimetil-1fenilpropil)-nitrossido
t-Bu
CH3
H3C
C
N
C
H
CH3 O
(2 * 1 * 1 + 1) * (2 * 1 * 1/2 + 1) = 6 righe
N-metil-N-tert-butil nitrossido
CH3
H3C
C
N
CH3
CH3 O
(2 * 1 * 1 + 1) * (2 * 3 * 1/2 + 1) = 12 righe
N-D3-metil-N-tert-butil nitrossido
CH3
H3C
C
N
CD3
CH3 O
(2 * 1 * 1 + 1) * (2 * 3 * 1 + 1) = 21 righe
Etil radicale
α
β
H3C CH2
.
(2 * 2 * 1/2 +1) * (2 * 3 * 1/2 +1) = 12 righe
Naftalina radicale anione
α
_
β
.
(2 * 4 * 1/2 +1) * (2 * 4 * 1/2 +1) = 25 righe
Butadiene radicale anione
.
CH2
_
CH
C
H
CH2
_
CH CH2
C
CH2
H
.
H2C
H
C
.
H
_
C
CH2
C
CH2
H
_
CH
.
CH2
H2C
H
C
.
CH
_
CH2
(2 * 4 * 1/2 +1) * (2 * 2 * 1/2 +1) = 15 righe
Nitrossido indolinonico
O
O
Ph
N
.+
CH3
N
O
.
O
Ph
Ph
+
N
O
CH3
O
O
H
Ph
CH3
.
+
N
H
O
CH3
Nitrossido indolinonico 5-sost
O
PhS
Ph
N
O
CH3
Esempio
z
Ipotizzare lo spettro EPR del propenil radicale e
del butenil radicale.
H
H
C C CH2
H
H
radicale
propenilico
C C C CH3
H H
H
radicale
butenilico
O2N
Ph N N
Ph 2 1
2'
3'
4'
6'
NO2
5'
O2N
DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl)
But
Galvinossile
3'
O
But
3
O
CH
5'
But
5
1.0
1.0
0.5
1.0
1.0
0.5
0.5
0.5
1
1
2
2
1
4
4
2
N(1)
N(2)
H(3', 5')
N(2', 6', NO2)
N(4', NO2)
H(2", 6", 2"', 6"')
H(3", 5", 3"', 5"')
H(4", 4"')
5.86
1.38
0.033
0.5
0.5
0.5
1
4
36
H(CH)
H(3, 3', 5, 5')
H(C(CH3)3)
9.64
3.07
1.03
0.13
1.0
0.5
0.5
0.5
1
2
2
3
N
H(5, 7)
H(4, 6)
H(CH3)
15.85
0.54
1.0
0.5
1
12
N
H(CH3)
5.89
4.16
1.21
0.65
0.5
0.5
0.5
0.5
3
3
3
2
H(2 CH3)
H(6 CH3)
H(5 CH3)
H(3 CH2)
But
O
Ph
2-fenil-2-metil-indolin-3-on-nitrossido
Me
N
9.09
8.45
1.46
0.38
0.53
1.84
0.69
1.64
O
TEMPO
(2,2,6,6-tetrametilpirrolidin nitrossido)
N
O
CH3 H H
HO 1
2
3
H CH3
H3C 6
5
CH3
O
H CH3
CH3
CH3
CH3
α-Tocoferolo
RISONANZA DI SPIN
ELETTRONICO IN BIOLOGIA
z
z
La spettroscopia di risonanza di spin elettronica (EPR) ha
costantemente trovato applicazioni nella problematica
biochimica e biomedica, come un mezzo potente e
sensibile per la rivelazione di specie radicaliche.
Ciò si applica tanto al rilevamento (e all’identificazione)
di intermedi radicalici in reazioni metaboliche, quanto
all’osservazione di specie paramagnetiche stabili presenti
in natura, o al rilevamento di radicali prodotti da
radiazioni esterne o, infine, all'analisi di sonde
paramagnetiche introdotte in sistemi biologici specifici
(spin labeling).
RISONANZA DI SPIN
ELETTRONICO IN BIOLOGIA
z
z
Sebbene esista una grande potenzialità per
l'osservazione diretta di specie radicaliche
associate a specifici fenomeni biochimici, il
paramagnetismo si manifesta naturalmente assai
di rado in sistemi biologici.
Tuttavia grandi vantaggi possono essere ottenuti
dalla introduzione di una qualche versatile sonda
contenente un centro paramagnetico.
RISONANZA DI SPIN
ELETTRONICO IN BIOLOGIA
z
Uno "spin label" ideale è un radicale libero stabile
(spesso organico) di struttura e/o reattività tali da
consentirne l'introduzione in una particolare zona dei
sistemi biologici e della macromolecola. Sebbene a
prima vista una tale sonda possa sembrare facilmente
ottenibile, in realtà non lo è. Infatti la maggior parte
degli "spin-labels" usati attualmente sono radicali
nitrossidi protetti la cui sintesi è stata perfezionata solo
in tempi recenti.
R
CH3
H3C
H3C
N
O
CH3
RISONANZA DI SPIN
ELETTRONICO IN BIOLOGIA
z
z
Sebbene la tecnica dello "spin-labeling" faccia
generalmente riferimento all'uso di radicali nitrossidi, si
hanno anche altri esempi in cui NO2, Mn2+, altri ioni
paramagnetici di metalli di transizione, ioni di lantanidi,
ed altri radicali organici di diversa natura sono stati usati
come sonde per lo studio di particolari sistemi.
Tuttavia, a causa della loro grande versatilità, sensibilità
e varietà di informazioni da essi ottenibili, i radicali
nitrossidi, hanno trovato un predominante impiego nella
tecnica dello “Spin-Labeling”.