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Risultati preliminari del primo piano regionale
per la prevenzione delle encefalopatie spongiformi
trasmissibili negli ovini (scrapie) in Umbria
127
O
l
L. CASTELLI1, G. GIARDINIERI2, C. SEBASTIANI3, M. BIAGETTI3
1
Associazione Regionale Allevatori, ARA, Umbria
Regione Umbria, Direzione Generale Agricoltura e Foreste
3
Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell’Umbria e delle Marche
2
RIASSUNTO
La scrapie è una encefalopatia spongiforme trasmissibile, che colpisce pecore e capre, causata dall’accumulo di una forma anomala di una glicoproteina di membrana dell’ospite presente nel sistema nervoso centrale (proteina prionica o PrP). La malattia risulta ampiamente distribuita in Europa e dal 1991 è notificabile nei Paesi dell’Unione Europea. Alcuni polimorfismi del
gene PrP delle pecore sono stati associati alla suscettibilità alla scrapie. Vista la necessità di applicare i Regolamenti e le Decisioni Europee inerenti il controllo della scrapie su base genetica, il presente lavoro descrive gli obiettivi proposti dal Progetto
Regionale di Selezione Genetica per la resistenza alle Encefalopatie Spongiformi Trasmissibili, applicata agli ovini (DGR della
Regione Umbria n. 1058 del 29/06/2005) e i risultati preliminari raggiunti. A tale scopo sono state genotipizzate 640 pecore, di
diverse razze (Sarda, Comisana, Appenninica, Bergamasca, Suffolk, Sopravissana, Fabrianese), provenienti da 25 aziende iscritte ai Libri Genealogici, che possono rappresentare un nucleo iniziale di selezione per la linea femminile, in particolare per razze quali l’Appenninica, la Fabrianese e la Sopravissana, in cui, a causa della loro ridotta numerosità e realtà locale, si poteva inizialmente ipotizzare un rischio di bassa frequenza dei genotipi resistenti.
Ogni razza analizzata ha mostrato una differente frequenza dei polimorfismi, per cui le future strategie di selezione dovranno
essere intraprese considerando le peculiarità di ognuna, non ultimo la numerosità della popolazione totale, al fine di evitare
danni alle produzioni o il rischio di estinzione.
Il progetto è stato utile anche per favorire l’acquisto di montoni resistenti alla malattia e per sensibilizzare gli allevatori al problema, grazie alla produzione di un opuscolo informativo ad essi destinato.
Visti i risultati ottenuti, sarebbe auspicabile un aumento delle aziende aderenti al progetto, al fine di conoscere esattamente le
frequenze alleliche presenti in particolare nelle razze locali, che altrimenti potrebbero essere penalizzate da un approccio territorialmente più vasto, in modo da consentire di approntare un adeguato piano di selezione genetica, ed implementare le frequenze di resistenza, dove necessario.
PAROLE CHIAVE
Scrapie, pecora, genotipizzazione, resistenza genetica.
INTRODUZIONE
La scrapie è una malattia neurodegenerativa, ad esito fatale,
del gruppo delle Encefalopatie Spongiformi Trasmissibili
(EST), che colpisce ovini e caprini. Viene riconosciuta la natura infettiva di questa malattia, che deriva dalla conversione
conformazionale della proteina prionica cellulare (PrPc) in
un’isoforma patologica, caratterizzata dalla resistenza alle
proteasi e denominata proteina prionica patologica (PrPsc)1.
È da tempo riconosciuto che la suscettibilità alla malattia
nella pecora è fortemente influenzata dai polimorfismi del
gene codificante la proteina prionica (PrP). In particolare,
attualmente le varianti geniche ritenute importanti, sono
quelle poste ai codoni 136, 154 e 171 e che si traducono nelle seguenti varianti aminoacidiche: ARR, AHQ, ARH, ARQ,
VRQ, ARK e TRQ. Tuttavia i principali alleli evidenziati in
Europa sono ARR, AHQ, ARH, ARQ e VRQ. Mentre l’allele
Autore per la corrispondenza:
Lorenzo Castelli ([email protected]).
ARR conferisce resistenza alla malattia, l’allele VRQ è stato
associato ad alta suscettibilità alla scrapie2,3,4,5. Ogni individuo possiede due alleli che derivano da due alleli parentali,
per cui ogni animale possiede un genotipo derivante dalla
combinazione degli alleli ereditati dai due genitori. Da ciò ne
consegue che, conoscendo il genotipo parentale, è possibile
prevedere quale sarà il genotipo filiale e, di conseguenza, il
grado di resistenza della prole6,7,8,9.
Sulla base di queste conoscenze, l’Unione Europea ha stabilito di poter gestire le EST degli ovini attraverso l’applicazione di piani di selezione dei soggetti portatori dei caratteri di resistenza genetica (Regolamento CE 999/2001, Decisione 2002/1003/CE, Decisione 2003/100/CE, D.M.
17/12/2004, Regolamento CE 727/2007). Successivamente,
a cascata, gli Stati Comunitari e le singole Regioni hanno
provveduto a mettere in atto, in vario modo, le diverse strategie di controllo della scrapie e di implementazione della
selezione genetica. In particolare, la genotipizzazione, ossia
l’identificazione del genotipo di un individuo, rappresenta
un aspetto chiave ai fini del controllo e della gestione della
scrapie, in quanto da una parte serve per incrementare il
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Risultati preliminari del primo piano regionale per la prevenzione delle encefalopatie spongiformi trasmissibili
patrimonio genetico ovino a favore della resistenza nei confronti della malattia, dall’altro rende possibile, ove necessario, applicare l’abbattimento selettivo dei capi eventualmente coinvolti in un focolaio. Il livello di impatto economico di queste strategie è duplice e deriva sia dall’ottenimento di un maggiore valore economico per l’allevatore,
che possiede capi con un genotipo resistente, come rilevato
negli ultimi anni nelle aste dei montoni, sia dai fondi pubblici risparmiati in seguito all’applicazione di un abbattimento selettivo di un gregge. Va da sé che tale genotipizzazione è imprescindibile da una corretta e duratura identificazione degli animali testati.
Viste le indicazioni sulla necessità di applicare i Regolamenti e le Decisioni Europee inerenti il controllo della scrapie su base genetica, scopo del presente lavoro è stato quello di descrivere l’avvio del piano di selezione regionale attuato in Umbria, analizzandone i punti critici e i primi risultati ottenuti.
MATERIALI E METODI
Descrizione del progetto e
reclutamento dei partecipanti
In seguito all’istituzione del Progetto Regionale di Selezione
Genetica per la resistenza alle Encefalopatie Spongiformi
Trasmissibili (DGR della Regione Umbria n. 1058 del
29/06/2005) e all’emanazione del bando di concorso “Piano
per la prevenzione delle Encefalopatie Spongiformi Trasmissibili negli ovini (scrapie)”, approvato con DGR della Regione Umbria n. 12637 del 27/12/2007, è stato istituito un progetto che ha visto coinvolti tre enti (Associazione Provinciale Allevatori, APA, di Perugia e di Terni, Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell’Umbria e delle Marche e Dipartimento Agricoltura della Regione Umbria) con lo scopo di:
1) concorrere all’eradicazione delle EST degli ovini sul territorio regionale;
2) implementare la creazione di greggi a basso rischio di EST;
3) contribuire alla tutela della salute umana ed animale;
4) valorizzare le produzioni ovine.
L’obiettivo di ottenere l’incremento dei caratteri di resistenza doveva essere ottenuto tramite:
a) l’eliminazione dell’allele VRQ attraverso il divieto di utilizzo di riproduttori portatori di tale allele;
b) l’incremento della frequenza dell’allele ARR negli allevamenti aderenti al progetto;
c) la costituzione di serbatoi di arieti omozigoti resistenti
(ARR/ARR), utili anche in caso di necessità di ripopolamento di allevamenti infetti;
d) la progressiva diminuzione della frequenza dell’allele
ARQ negli allevamenti aderenti al progetto.
In particolare la selezione genetica era rivolta alla linea femminile, visto che la linea maschile veniva genotipizzata in
quanto tale servizio era regolarmente erogato agli aderenti al
Piano iscritti ai Controlli Funzionali ed ai Libri Genealogici
(LLGG).
Il bando prevedeva anche la possibilità di acquisto di riproduttori precedentemente genotipizzati e resistenti alla malattia. L’adesione al progetto è stata effettuata su base volontaria e rivolta alle aziende iscritte ai LLGG e ai Controlli Funzionali della Regione Umbria, rispondenti ai requisiti richiesti dal bando.
Genotipizzazione
La matrice biologica utilizzata per la genotipizzazione è stata il bulbo pilifero. In rispondenza alle linee guida del Piano
e di comune accordo con gli allevatori aderenti, si è deciso di
prelevare i campioni biologici dai soggetti femminili della rimonta, dato che questi avrebbero avuto un tempo di permanenza più prolungato nell’allevamento e quindi avrebbero
prodotto una maggiore prole, aumentando così l’impatto
della genotipizzazione all’interno del gregge.
Il campione biologico è stato prelevato a livello della testa degli animali, dove è più facile che il bulbo pilifero rimanga attaccato al pelo della giarra, evitando le contaminazioni tra
diversi animali. Il numero dei bulbi prelevati è sempre stato
elevato per rendere possibile l’indagine genetica senza ulteriori interventi in stalla.
Estrazione del DNA
I campioni pervenuti in laboratorio sono stati osservati allo
stereomicroscopio e sono stati prelevati circa 15-20 bulbi piliferi in fase “anagen” e posti in provette tipo eppendorf.
L’estrazione del DNA è stata fatta utilizzando un kit commerciale (High pure PCR Template preparation kit - ROCHE), secondo le istruzioni della ditta.
Il DNA ottenuto è stato sottoposto ad analisi tramite un protocollo di discriminazione allelica in PCR real-time.
PCR real-time
Per l’amplificazione è stato usato un saggio di discriminazione allelica in real-time utilizzando 0,9 µM di primers per tutti
i codoni (rispettivamente 136 forward e reverse, 154 forward e
reverse, 171 forward e reverse) e concentrazioni tra 0,1 e 0,2
µM per le sonde, in un volume totale di 20 µl, a cui sono stati
aggiunti 2 µl di DNA. In ogni set di reazione sono stati inseriti un controllo negativo di estrazione, un controllo negativo di
amplificazione, entrambi costituiti da acqua bidistillata, e un
controllo positivo, costituito da DNA ovini eterozigoti a livello di ogni codone (136 A/V, 154 R/H, 171.1 R/H, 171.2 R/Q),
al fine di verificare la corretta esecuzione del test.
I campioni sono stati amplificati in un 7900 HT fast real time
PCR System (Applera), secondo il seguente profilo termico:
50 °C per 2 minuti, 95 °C per 10 minuti e 40 cicli a 95 °C per
15 secondi e 62 °C per 1 minuto.
RISULTATI
Reclutamento
Inizialmente hanno aderito al progetto 25 aziende, di cui 20
nella provincia di Perugia e 5 in quella di Terni. Successivamente 6 aziende hanno dovuto rinunciare alla partecipazione al bando a causa di sopraggiunte difficoltà economiche e
tecniche. Di conseguenza, alla fine solo 19 aziende hanno
aderito e due di queste hanno partecipato al bando per due
razze, in quanto presenti contemporaneamente in azienda.
Le razze rappresentate nelle aziende erano: Sarda (7 aziende), Comisana (5 aziende), Appenninica (3 aziende), Bergamasca (2 aziende), Suffolk (2 aziende), Sopravissana (1
azienda), Fabrianese (1 azienda). Tutte le aziende erano aderenti ai Controlli Funzionali espletati dall’APA di Perugia e
di Terni ed iscritte ai LLGG e come tali già erano sottoposte
regolarmente a genotipizzazione della linea maschile, effettuata dal personale delle APA, inviando i campioni biologici
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DISCUSSIONE
presso il Laboratorio Genetica e Servizi (LGS), dal quale poi
i dati delle analisi vengono inviati al Centro Nazionale di Referenza presso l’Istituto Zooprofilattico di Piemonte e Valle
d’Aosta a Torino.
Si è deciso di prelevare un numero di campioni pari a 50 soggetti per ogni azienda aderente per poter dare a tutti la possibilità di testare un ugual numero di soggetti, indipendentemente dalla consistenza del gregge, e, per le aziende con numero di animali inferiore a 50 (n=7), si è prelevato l’intero
gregge. Si è privilegiato comunque il prelievo sulla rimonta.
Il presente lavoro costituisce la prima genotipizzazione della
linea femminile, non effettuata su focolaio, svolta in Umbria.
Tale risultato è stato utile per iniziare a creare un nucleo di
selezione femminile di resistenza alla scrapie, che sarà utile
soprattutto per quelle razze che partono da una bassa frequenza di resistenza, anche sulla linea maschile, ossia la Fabrianese e la Sopravissana (dato Associazione Nazionale Pastorizia, comunicazione personale). La conseguenza è la valorizzazione del patrimonio genetico ovino umbro. Le frequenze alleliche registrate, inoltre, rappresenteranno un
punto di riferimento per il confronto di frequenze alleliche
ottenute negli anni successivi in Umbria. Tra l’altro la genotipizzazione di razze tipiche del Centro Italia, quali l’Appenninica, la Fabrianese e la Sopravissana, è un’azione effettuabile solo in questa Regione che, insieme alle Marche, costituisce il principale areale di distribuzione delle stesse. Tale
aspetto diventa molto più importante se si considera che,
mentre per le razze maggiormente rappresentate a livello nazionale è comunque possibile reperire capi genotipizzati resistenti alla scrapie, sia della linea maschile che della linea
femminile, per le razze locali o a limitata diffusione, un intervento locale, spesso su base regionale, può essere l’unico
metodo per salvaguardare lo stato sanitario di questi animali e selezionare nel tempo capi resistenti alla scrapie, cercando di tutelare nel contempo i caratteri tipici di razza, evitando il fenomeno dell’inbreeding per eccessiva consanguineità10,11. Probabilmente la distribuzione della percentuale di
adesione per razza riflette la diversa sensibilità che gli allevatori hanno sul problema. Infatti, ad esempio, solo una modesta quota di pecore Sopravissane è stata genotipizzata,
mentre sarebbe auspicabile raggiungere un maggior numero
di capi da sottoporre ad analisi per aumentare la resistenza di
razza, proprio perché anche la linea maschile ha una bassa
frequenza di genotipi resistenti.
Anche l’incentivo all’acquisto di soggetti geneticamente resistenti, sia maschi che femmine, ha rappresentato per molti
allevatori la possibilità di un miglioramento del gregge.
La genotipizzazione della linea femminile, effettuata col
presente programma e normalmente non considerata nei
piani di selezione approntati dai LLGG su linea maschile, è
Genotipizzazione
Il bulbo pilifero è stato raccolto da 798 soggetti. Su 158
(20,8%) di questi non è stato possibile effettuare la genotipizzazzione per motivi tecnici ed in alcuni casi è stato necessario ripetere nuovamente il prelievo. I risultati della genotipizzazione sono riportati nella Tab. 1.
Ulteriori azioni intraprese previste
dal bando
Dieci aziende hanno provveduto all’acquisto di riproduttori
resistenti alla malattia, che sono risultati fondamentali per
costituire dei gruppi di monta. In particolare 9 aziende hanno acquistato almeno un riproduttore maschio, per un totale di 16 soggetti, e due hanno provveduto all’acquisto di femmine riproduttrici per un totale di 25 soggetti. In realtà anche altre aziende avrebbero voluto usufruire di questa possibilità, ma sono ancora pochi i soggetti disponibili sul mercato, considerando che la resistenza genetica alla scrapie è solo
uno dei parametri che un allevatore considera al momento
dell’acquisto e nelle scelte selettive aziendali.
Un ulteriore strumento nell’ambito del bando è stata la redazione di un manuale a carattere divulgativo sulla scrapie,
messo a disposizione degli allevatori, aderenti al piano e non,
che è stato distribuito durante le fiere zootecniche a carattere locale e nazionale, al fine di sensibilizzare sull’importanza
della selezione dei caratteri genetici negli ovini. Non è stato
possibile misurare l’efficacia del manuale, ma sicuramente
ha costituito un mezzo per motivare gli allevatori all’adesione al piano e spiegare loro le azioni da intraprendere e l’impatto sanitario della malattia.
Tabella 1 - Risultato delle genotipizzazioni dei 640 soggetti analizzati.
Classi di suscettibilità
Sarda
(%)
Comisana
(%)
Bergamasca
(%)
Appenninica
(%)
Fabrianese
(%)
Suffolk
(%)
1° classe
(ARR/ARR)
57
(19,7)
47
(23,7)
1
(5)
15
(27,3)
2
(4,3)
8
(30,8)
0
(0)
130
(20,3)
2° classe
(ARR/ARH, ARR/AHQ,
ARQ/ARR)
133
(46,3)
98
(49,5)
6
(30)
14
(25,5)
9
(19,2)
13
(50)
4
(57,1)
277
(43,3)
3° classe
(ARQ/ARQ, ARQ/AHQ,
AHQ/AHQ, ARQ/ARH,
ARH/ARH, AHQ/ARH)
97
(33,6)
51
(25,8)
13
(65)
23
(41,8)
33
(70,2)
4
(15,4)
3
(42,9)
224
(35)
Divieto di impiego
(VRQ/VRQ, VRQ/ARQ,
VRQ/ARH, VRQ/AHQ,
VRQ/AHQ, VRQ/ARR)
0
(0)
2
(1)
0
(0)
3
(5,5)
3
(6,4)
1
(3,9)
0
(0)
9
(1,4)
287
(44,8)
198
(30,9)
20
(3,1)
55
(8,6)
47
(7,3)
26
(4)
7
(1,1)
640
(100)
Totale
(%)
Sopravissana
Numero totale di
(%)
soggetti esaminati (%)
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Risultati preliminari del primo piano regionale per la prevenzione delle encefalopatie spongiformi trasmissibili
importante per incrementare la velocità di selezione genetica, in modo tale da consentire all’allevatore di fare una selezione mirata dei capi riproduttori per la resistenza genetica alla scrapie.
Questa fase di genotipizzazione ha visto coinvolti solo capi
ovini iscritti ai LLGG, i cui allevatori probabilmente sono
più sensibili a tale problematica. Il ritorno economico dei
suddetti allevatori può essere confermato andando a valutare il “Bando Regionale per la concessione di aiuti per l’acquisto di riproduttori selezionati, interventi di miglioramento del patrimonio zootecnico” e l’articolo 69 del Piano
di Sviluppo Rurale (PSR) 2007-2013, nel quale è possibile
ottenere un premio per l’acquisto di soggetti resistenti o semiresistenti e un premio al mantenimento per 5 anni dalla
data di acquisto.
Anche altri piani regionali di genotipizzazione sono iniziati prendendo in considerazione solo i soggetti iscritti ai
LLGG, ma successivamente sono stati estesi anche a soggetti non iscritti, come per esempio è avvenuto nella Regione
Sardegna, che dal 2006 ha iniziato la genotipizzazione su
animali non iscritti ai LLGG, per arrivare al 2009 ad un’estensione del piano di selezione genetica regionale su base
obbligatoria per tutte le aziende ovine sarde12. Tale obiettivo è molto importante se si considera che gli ovini iscritti ai
LLGG rappresentano solo il 5% (circa 400.000 capi iscritti
al 2012) rispetto ai circa 8 milioni di capi effettivi presenti
nel territorio nazionale.
Infatti un obiettivo futuro sarà l’estensione del progetto ad
un numero maggiore di aziende. Nell’attuale progetto si è
cercato di sensibilizzare gli allevatori creando un opuscolo su
tale argomento al fine di spiegare quale sia l’importanza della malattia, la patogenesi sottostante, i metodi di selezione alla resistenza e i vantaggi derivanti dalla genotipizzazione, sia
a livello aziendale che di Salute Pubblica.
Tra l’altro va ricordato che sempre più lo stato di resistenza
nei confronti della scrapie acquisirà un ruolo importante nel
commercio e nello spostamento dei capi ovini e dei loro prodotti derivati, quanto più andrà avanti la selezione genetica
ed, in alcuni casi, addirittura l’eradicazione della scrapie nei
vari territori, soprattutto europei.
Il finanziamento del progetto di selezione, con alla base la genotipizzazione, presuppone anche l’uso di metodi identificativi dei singoli soggetti, quali l’identificazione elettronica tramite bolo endoruminale o marca auricolare elettronica, che
sono in grado di garantire l’identificazione univoca, certa e
duratura dei medesimi soggetti. Tale aspetto potrebbe risultare ovvio, ma il mancato riconoscimento di soggetti precedentemente genotipizzati o non correttamente identificati,
ossia, scambiati con altri soggetti, potrebbe comportarne
l’abbattimento e costituire uno sperpero economico.
Un punto critico che è emerso nel piano è stato la perdita,
per motivi tecnici, di 158 campioni (20,8%) da analizzare.
Questa performance andrà migliorata per aumentare l’efficienza del piano.
Altro aspetto auspicabile potrebbe essere l’allestimento di
una banca del DNA dei capi genotipizzati, in particolare della linea femminile, così come avviene nei piani disegnati dai
LLGG, in modo tale da poter usufruire dello stesso DNA per
ulteriori ricerche, qualora emergano nuove conoscenze che
evidenzino l’influenza di ulteriori loci utili alla resistenza alla scrapie o in funzione della nuova variante identificata della scrapie atipica13,14.
CONCLUSIONI
Il supporto economico regionale ha rappresentato uno stimolo fondamentale per gli allevatori per l’inizio della selezione genetica, sia per l’acquisto di montoni resistenti sia per
l’avvio della genotipizzazione della linea femminile, specialmente in un periodo critico come quello attuale, in cui ogni
spesa aziendale deve essere attentamente ponderata da parte
degli allevatori ed in previsione di una obbligatorietà europea per tali piani. Una prosecuzione di tale supporto sarebbe
auspicabile, almeno finché un ritorno economico derivante
dal valore aggiunto acquisito dai capi selezionati non diventi la regola. Il finanziamento di altri piani regionali sarebbe
giustificato dal fatto che l’ottenimento di uno stato di resistenza nei confronti della scrapie rappresenterebbe un obiettivo comune di Sanità Pubblica ed un incentivo al settore
zootecnico ovino.
❚ Preliminary results of the first
regional project for the prevention
of transmissible spongiform
encephalopathies in sheep (scrapie)
in Umbria region
SUMMARY
Scrapie is a transmissible spongiform encephalopathy of
sheep and goats, caused by an accumulation of an abnormal form of a host membrane glycoprotein (prion protein
or PrP) in the central nervous system. The disease is widely
distributed in Europe and has been a notifiable disease
within the European Union (EU) since 1991. Polymorphisms of the sheep PrP gene are associated with susceptibility
to scrapie. The EU decided to use genetics as a control tool
for scrapie, because genetic selection for resistance has been
deployed successfully in some countries. Accordingly, it is
very important to know the allelic frequency of the resistant genotype, especially for national and local sheep
breeds. The aim of the present work is to describe the
objectives and the preliminary results obtained by a local
project in the Umbrian Region in order to further the
knowledge of the frequency of the polymorphisms in the
local sheep breeds, to make the breeders more aware of the
disease and to improve the genetic selection strategies in
the flocks, especially on the female lineage. Six-hundred
and forty female sheep, belonging to different breeds (Sardinian, Comisana, Appenninica, Bergamasca, Suffolk, Sopravissana, Fabrianese) were genotyped and their allelic
frequencies may be used to create a genetic selection nucleus. Every breed showed a different polymorphism frequency, and this is important for the future selection programmes because they should be adopted considering the
characteristics of each breed, like the total number of the
population, to avoid production damage or a possible extinction risk.
Moreover, the purchase of resistant ram was promoted and a
popular brochure for breeders was created.
These results represent the initial nucleus for the future genetic selection of resistant genotypes, especially for local
breeds, which could be penalized by a wider approach. The
extension of this project to other flocks is recommended to
improve the selection strategy.
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KEY WORDS
Scrapie, sheep, genotyping, genetic resistence.
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