Progetti tesi San Raffaele - Corso di Laurea in Biologia

Presso il Laboratorio di Adesione cellulare diretta dal Prof. Ivan de Curtis dell’ Istituto
Scientifico San Raffaele (via Olgettina 58, 20132 Milano) sono disponibili due posti per lo
svolgimento di tesi su uno dei seguenti progetti di ricerca. I candidati interessati sono pregati di
inviare a [email protected] una e-mail di interesse, e di allegare un CV che includa il voto di
Laurea triennale; i voti degli esami sostenuti per la Laurea Specialistica e l’ elenco degli esami
da sostenere; eventuali esperienze di laboratorio già svolte.
Progetto 1: Meccanismi di regolazione dell'invasione tumorale.
Lo studio dei meccanismi molecolari coinvolti nella migrazione ed invasione da parte di cellule
tumorali durante la formazione di metastasi è essenziale per identificare nuovi marcatori
prognostici e più specifici target terapeutici per la cura dei tumori. Abbiamo recentemente
dimostrato che la proteina Liprina-alfa1 è un regolatore fondamentale della motilità cellulare
(Asperti et al, 2009. J Cell Sci, 122:3225) e dell'invasione in vitro da parte di cellule tumorali
(Astro et al, 2010. Oncogene, in press). Inoltre, abbiamo trovato che la liprina-alfa è fortemente
espressa in diversi tipi di tumori umani. Proseguendo questi studi, il progetto di tesi ha lo scopo
di approfondire i meccanismi molecolari attraverso i quali la liprin-alfa1 regola la migrazione ed
invasione tumorale, utilizzando un approccio sperimentale che include sia l'analisi in vitro con
linee cellulari tumorali per l'identificazione biochimica e la caratterizzazione funzionale di nuovi
partner richiesti nella regolazione dell'invasione, che saggi di tumorigenicità e invasività in vivo.
L'analisi funzionale comprenderà anche l'uso di sofisticate tecniche di analisi d'immagine su
cellule vive marcate con proteine fluorescenti.
Metodi utilizzati: Biologia cellulare: colture cellulari, trasfezioni, immuno-precipitazione
ed immuno-blotting; saggi funzionali di migrazione cellulare, motilità e direzionalità, e di
invasione tumorale in vitro ed in vivo. Microscopia confocale ed analisi time-lapse. Biologia
molecolare: preparazione di plasmidi per la trasfezione o il silenziamento delle proteine di
interesse; RT-PCR per l'identificazione di forme di splicing alternativo dei trascritti di interesse.
Progetto 2: Ruolo delle GTPasi Rac nello sviluppo cerebrale.
Abbiamo prodotto diverse linee di topi knockout per uno o entrambi i geni per le GTPasi Rac1 e
Rac3, co-espresse durante lo sviluppo neuronale. Utilizzando questi modelli animali abbiamo
dimostrato che entrambe le GTPasi sono necessarie per il corretto sviluppo cerebrale, e che i
topi con delezione di entrambi i geni sono epilettici (Corbetta et al, 2009. FASEB J, 23:1347).
Dati più recenti hanno messo in evidenza una forte diminuzione di una popolazione specifica di
interneuroni GABAergici nella corteccia e nell’ippocampo dei topi con doppio knockout, che
potrebbe spiegare il fenotipo epilettico osservato in questi animali. Il progetto di tesi riguarderà
una caratterizzazione più approfondita di questo fenotipo neuronale, e l’analisi dei meccanismi
molecolari e cellulari che causano la diminuzione di questi interneuroni. A questo scopo saranno
utilizzate tecniche di immunoistochimica e di ibridazione in situ, per studiare i possibili effetti
della doppia delezione di Rac1/Rac3 su morte cellulare, migrazione, e differenziamento
neuronale. Saranno anche considerate colture isolate dall’ippocampo dei topi knockout per lo
studio degli effetti della carenza di Rac sullo sviluppo degli interneuroni (dendritogenesi,
sinaptogenesi). I meccanismi analizzati sono rilevanti per comprendere l’origine di disfunzioni
cerebrali, quali epilessia e ritardo mentale.
Metodi utilizzati: Mantenimento di colonie di topi knockout. Preparazione di cervelli
murini da diversi stati di sviluppo. Immunoistochimica e ibridazione in situ su sezioni di cervello
murino. Colture primarie neuronali da ippocampo per l’analisi dello sviluppo neuronale in vitro, e
per esperimenti di trasfezione. Microscopia ad immunofluorescenza e confocale.
Progetto 3: Studio della funzione della GTPasi Rac3 nella funzionalità sinaptica.
La formazione di spine dendritiche è fondamentale per l’assemblaggio delle sinapsi e per la
funzionalità neuronale. Recentemente è stato messo in evidenza un ruolo fondamentale del
citoscheletro e del traffico di recettori nella regolazione della plasticità sinaptica. Utilizzando
colture neuronali da topi con singolo o doppio knockout per le GTPasi Rac1 e Rac3 co-espresse
nei neuroni ippocampali, abbiamo dimostrato un ruolo fondamentale di queste proteine nella
formazione delle spine dendritiche (Corbetta et al, 2009. FASEB J, 23:1347). Rimane tuttavia
ignota la funzione specifica della GTPasi neuronale Rac3. Dati preliminari ottenuti in questo
laboratorio suggeriscono che Rac3 potrebbe avere un ruolo specifico nella regolazione delle
dimensioni delle spine sinaptiche. Il progetto di tesi si propone di indagare la funzione di Rac3
nella plasticità sinaptica, utilizzando un semplice protocollo di induzione chimica di LTP (Long
Term Potentiation) per modulare la funzionalità sinaptica. Saranno utilizzate colture ippocampali
isolate da topi wildtype, e con singolo o doppio knockout per Rac1 e Rac3. Esperimenti di
ricostituzione della funzione di ognuna delle due GTPasi in questi neuroni permetteranno di
verificare l’ipotesi che Rac3 sia specificamente necessaria per l’induzione di LTP e per il
parallelo cambiamento strutturale delle spine. Questa parte è preliminare alla seguente indagine
dei meccanismi molecolari coinvolti in questi processi neuronali. Tra le proteine coinvolte è
presente un complesso molecolare identificato in questo laboratorio, che comprende alcune
proteine mutate nel ritardo mentale, caratterizzato da alterazioni nella struttura delle spine
dendritiche.
Metodi utilizzati: Mantenimento di colonie di topi knockout. Colture primarie ippocampali.
Esperimenti di trasfezione per l’espressione di proteine o il silenziamento dell’espressione di
specifiche proteine neuronali. Microscopia a fluorescenza e confocale. Analisi in time-lapse della
dinamica delle spine dendritiche. Analisi quantitativa degli effetti sulle spine e protrusioni
dendritiche.