CORSO DI GENOMICA FUNZIONALE
Corso di Laurea in Biotecnologie Sanitarie (3° anno, I semestre)
Docente di riferimento:
Prof. PAOLO BONALDO
Dipartimento di Medicina Molecolare (III° piano nord, Complesso Pluridipartimentale
di Biologia "A. Vallisneri", Viale G. Colombo 3).
E-mail: [email protected]
Docente di supporto:
Dr.ssa DIANA CORALLO
Dipartimento di Pediatria
E-mail: [email protected]>
CONTENUTI DEL CORSO
La genomica funzionale riveste una particolare importanza nell’era post-genomica. Anziché
una descrizione generale e teorica dei vari campi di studio e applicazione della genomica
funzionale, per questo corso si è scelto un percorso didattico sperimentale focalizzato a due
organismi modello fra i vertebrati: il pesce zebrafish ed il topo.
Il corso si articola in due parti distinte.
Nella parte teorica del corso verranno descritte le caratteristiche di zebrafish ed il suo uso
in applicazioni biotecnologiche, mentre sarà dato ampio risalto ai topi transgenici come
modello per lo studio della funzione dei geni in condizioni normali e patologiche. Verranno
trattati argomenti quali: principi ed applicazioni delle cellule staminali embrionali, metodi per
la generazione di topi transgenici, l’inattivazione genica mirata (“gene knockout”), la
mutagenesi su grande scala, l’RNA interference. Verranno inoltre descritte in dettaglio le
tecnologie utilizzate, anche con l’ausilio di filmati.
Nella parte sperimentale del corso verrà presentato in dettaglio un esempio di topi
knockout per lo studio topi knockout per lo studio di malattie umane.
ORGANIZZAZIONE DELL’INSEGNAMENTO
Lezioni teoriche in aula, basate su presentazioni al computer con videoproiezione.
• PROGRAMMA (parte teorica) •
Nozioni introduttive
L’era post-genomica. Gli organismi modello fra gli animali: invertebrati (Caenorhabditis
elegans, Drosophila melanogaster), pesci (Danio rerio, Fugu rubripes), anfibi (Xenopus
laevis), mammiferi (Rattus norvegicus, Mus musculus). Modelli sperimentali in biomedicina.
Gli animali transgenici.
Il topo come organismo modello
Vantaggi del topo per studi di genomica funzionale in mammifero. Caratteristiche generali del
topo: genoma, ciclo vitale, sviluppo embrionale, ceppi.
Transgenesi in topo: le diverse tecnologie per la produzione di topi transgenici. Produzione di
topi transgenici per microiniezione di DNA in ovociti fecondati: principi, metodologia,
applicazioni. Iniezione di cellule ES in blastocisti: metodologia, applicazioni. Metodi per
mutagenesi in topo: mutagenesi mirata o casuale, approccio (gene-driven, phenotype-
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driven), caratteristiche, applicabilità su grande scala o piccola scala. Applicazioni dei topi
transgenici in biomedicina.
Le cellule staminali embrionali (ES)
Alcune nozioni generali sulle cellule staminali: definizione di cellula staminale;
differenziamento e proliferazione; cellule staminali totipotenti, pluripotenti, multipotenti; cellule
staminali embrionali e adulte.
Lo sviluppo embrionale precoce del topo. Caratteristiche della blastocisti: trofoblasto e ICM.
Cell lineages e derivazione delle cellule ES dalla blastocisti.
Caratteristiche e proprietà delle cellule ES. Differenziamento programmato delle cellule ES in
vitro in vari tipi cellulari; corpi embrioidi. Campi di applicazione delle cellule ES: le
applicazioni delle cellule ES nella transgenesi; differenziamento di cellule ES ed applicazioni
terapeutiche in topo. Procedure per la produzione di topi mutanti da cellule ES.
Microiniezione di cellule ES in blastocisti: metodologia, applicazioni; i topi chimera. Altre
procedure per la produzioni di topi a partire da cellule ES.
“Gene targeting”: l’inattivazione genica mirata per lo studio della funzione genica in
vivo
Caratteristiche generali ed applicazioni del gene targeting. La mutagenesi mirata mediante
ricombinazione omologa in cellule ES. Tipi di costrutti: replacement vectors e insertion
vectors. Procedura per la produzione di topi knockout da cellule ES. Considerazioni per la
preparazione dei costrutti: isolamento di un clone genomico (il problema del DNA isogenico),
scelta del tipo di vettore, tipi di marcatori selezionabili, selezione positiva-negativa. Potenziali
problemi: knockout incompleto, fenotipi dovuti a effetti su altri geni, interferenza da parte
della cassetta. L’interpretazione del fenotipo: dipendenza dal background genetico; “assenza
di fenotipo”, ridondanza genetica e meccanismi compensatori; fenotipi letali. Metolodogie per
il recupero di fenotipi letali e loro applicazioni.
Caratteristiche ed applicazioni dei sistemi di ricombinazione sito-specifica. Il sistema Cre/lox.
Gene targeting condizionale: knockout tessuto-specifico, knockout inducibile. Procedura e
applicazioni del gene targeting condizionale. I topi Cre. Knockout condizionale inducibile:
sistemi Cre-ER, Tet-off, Tet-on. Introduzione di mutazioni fini con Cre/lox. Ingegneria
cromosomica con Cre/lox.
Recenti sviluppi e prospettive future: i progetti IKMC, KOMP, EUCOMM; i nuovi metodi per
l’ingegneria genomica: zinc-finger nucleasi, TALEN, CRISPR/Cas.
“Gene trapping”: mutagenesi casuale in grande scala in cellule ES per lo studio della
funzione genica in vivo
Caratteristiche generali ed applicazioni del gene trapping. Procedura per la produzione di topi
con gene trapping. Tipi di costrutti. Identificazione del gene mutato. La possibilità di preselezionare secondo vari criteri. Alcuni esempi applicativi in topo. Vantaggi e svantaggi del
gene trapping. Sviluppi e prospettive future.
RNA interference: un nuovo approccio per lo studio della funzione genica
Principi e campi di applicazione delle metodologie di inattivazione della funzione genica
basate sull’RNA. Meccanismo e significato biologico dell’RNA interference: passaggi ed
enzimi coinvolti. I micro RNA (miRNA): biogenesi, caratteristiche e funzioni biologiche.
Applicazioni sperimentali dell’RNA interference: siRNA e shRNA. L’utilizzo dell’RNA
interference in mammiferi; vettori per il silenziamento genico stabile. Produzione di topi
transgenici con vettori lentivirali per shRNA. Applicazioni e sviluppi futuri dell’RNA
interference.
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Il pesce zebrafish come organismo modello
Caratteristiche. Fasi dello sviluppo (dai primi stadi dello sviluppo embrionale
all’organogenesi). Vantaggi e svantaggi del suo utilizzo come organismo modello. Studi di
genomica funzionale in zebrafish (morfolino, TILLING). Mutagenesi in zebrafish con
CRISPR/Cas.
• PROGRAMMA (parte applicativa e parte sperimentale) •
Le tecnologie per la produzione di topi transgenici
• Microiniezione di DNA in ovociti fecondati: procedura, caratteristiche, commenti.
• Produzione di topi knockout da cellule ES: iniezione di cellule ES geneticamente modificate
in blastocisti; i topi chimera. Altre procedure di derivazione di topi chimera da cellule ES.
Fattori importanti per un efficiente utilizzo di cellule ES modificate geneticamente; il
problema del cariotipo e della trasmissione germinale.
L’applicazione dei topi knockout per lo studio delle malattie
• Applicazione dei topi knockout come modello di malattie ereditarie umane; l’esempio dei
topi knockout per il collagene VI, un modello di distrofie muscolari, e dei topi knockout per
EMILIN-1, un modello di ipertensione.
L’applicazione di zebrafish per lo studio della funzione genica
• Applicazione di zebrafish per lo studio dei meccanismi di funzione genica e regolazione di
signaling; l’esempio di Emilin3, una proteina extracellulare coinvolta nella regolazione di
segnali e gradienti durante lo sviluppo. Uso di zebrafish per lo studio di tumori e per drug
screening
MATERIALE DIDATTICO
Poiché il corso descrive tecnologie particolarmente avanzate, non è attualmente disponibile
alcun libro di testo sufficientemente completo. Come bibliografia di riferimento, verranno
utilizzate pubbicazioni scientifiche e rassegne (reviews).
Come sussidio didattico, verranno resi disponibile agli studenti: l’intero materiale didattico
utilizzato nel corso, il programma, ed una bibliografia esaustiva dei diversi argomenti trattati a
lezione (accessibile come files pdf).
MODALITà DI ESAME
Scritto, con domande aperte.
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