Corso di Laurea Magistrale in
Scienze Biomolecolari
Candidata: Sandri Chiara
Data sessione di laurea: Ottobre 2008
Titolo: “Ruolo della piccola GTPasi R-Ras nell’adesione cellulare mediata da
integrine”
Relatore: Taverna Daniela
Co-Relatore esterno: Serini Guido
Riassunto
Nei vertebrati, l’architettura dell’apparato cardiovascolare è controllata dall’angiogenesi
embrionale, un processo nel quale le cellule endoteliali (EC) modificano le interazioni con la
matrice extracellulare (ECM) in risposta a diversi fattori guida. Le integrine sono recettori con
conformazioni a diversa affinità per l’ECM. In vivo, una piccola GTPasi appartenente alla famiglia
delle proteine RAS è espressa primariamente dalle EC ed è nota promuovere l’adesione all’ECM
mediata dalle integrine attraverso meccanismi ancora poco caratterizzati.
Durante l’angiogenesi embrionale le semaforine di classe 3 (Sema3) forniscono al sistema
vascolare la plasticità necessaria per il suo rimodellamento inibendo le integrine. Le neuropiline
(Nrp) e le plexine di classe A sono rispettivamente la subunità legante e trasducente dei recettori
delle Sema3. La porzione intracellulare delle Plexine contiene un dominio del tipo “GTPase
activating protein” (GAP). Utilizzando costrutti di fusione della versione costitutivamente attiva
(CA) di una piccola GTPasi appartenente alla famiglia delle RAS e della PlexinaA1 normale
rispettivamente con la proteina fluorescente verde (GFP) e rossa (mRFP), abbiamo dimostrato la
colocalizzazione delle due proteine a livello di strutture vescicolari. Inoltre, co-trasfettando le
cellule con PlexinA1-mRFP normale o mutata nelle due arginine catalitiche (PlexinaA1 R2,1mRFP) e le versioni CA o dominante negativa (DN) della piccola GTPasi fusa alla proteina EGFP,
abbiamo osservato come questa piccola GTPasi stimoli la regolazione negativa della PlexinaA1
promuovendone l’endocitosi dalla membrana plasmatica. Abbiamo poi evidenziato come
l’endocitosi di PlexinaA1 sia stimolata anche da Rab5, una piccola GTPasi che promuove la
formazione degli endosomi precoci.
Tramite esperimenti di doppio ibrido in lievito abbiamo identificato una proteina che funge da
fattore di scambio della guanosina (GEF) verso Rab5, come effettore specifico della piccola GTPasi
appartenente alla famiglia delle RAS. Abbiamo per tanto voluto verificare se anche questa proteina
fosse in qualche modo coinvolta nella regolazione dei meccanismi di adesione alla ECM mediati
dalle integrine. Mediante tecniche di biologia molecolare abbiamo fuso il cDNA di questa proteina
murina al “tag” HA. Abbiamo scoperto come questa co-localizzi con vinculina e con la piccola
GTPasi RAS attiva a livello dei punti di contatto focale e con Rab5 e la forma costitutivamente
attiva della piccola GTPasi in strutture vescicolari, identificate come endosomi precoci. Sono stati
inoltre prodotti dei costrutti mutanti di delezione per alcuni dei domini funzionali della proteina
identificata con il doppio ibrido per verificare se interferissero con i processi di endocitosi coinvolti
nell’adesione cellulare. Dai saggi di adesione è emerso come questa proteina, per la sua capacità di
interagire ed attivare Rab5, svolga un ruolo essenziale nella regolazione dell’adesione cellulare
mediata dalle integrine.
