Studio di farmaci - Università degli Studi di Firenze

DIPARTIMENTO DI FARMACOLOGIA PRECLINICA E CLINICA
"MARIO AIAZZI MANCINI"
UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI FIRENZE
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50139 FIRENZE
Viale G. Pieraccini, 6
Tel. (055) 4271.288
Fax: (055) 4271.280
PROGETTO di RICERCA:
Titolo: Studio di farmaci neuroprotettivi nella tossicità da ß-amiloide
RESPONSABILE del PROGETTO:Prof.ssa Fiorella Casamenti
La neuropatologia della malattia di Alzheimer (AD) è caratterizzata da marcata perdita di neuroni
nella corteccia e nell’ippocampo, dalla presenza di grovigli neurofibrillari (NFT) costituiti da
depositi intracellulari di proteina tau iperfosforilata e dalla formazione di placche senili a
localizzazione extracellulare. Il core delle placche senili è costituito da un nucleo di proteina ßamiloide (Aß), aggregata in forma fibrillare (La Ferla et al. 2007). La proteina Aß e' un peptide di
39-42 aa. secreto per proteolisi dalla proteina APP. I meccanismi responsabili dell'accumulo di
peptidi Aß come oligomeri solubili e/o fibrille insolubili non sono ancora noti. In accordo con
l'ipotesi della cascata amiloide, l'accumulo di Aß è un fenomeno età-dipendente e svolge un ruolo
primario nella patogenesi dell’ AD. Fino ad oggi è stato possibile intervenire terapeuticamente
sull'AD solo sugli effetti degenerativi secondari, con strategie mirate al potenziamento della
funzionalità del sistema colinergico (Kafki et al. 2006). Allo scopo di favorire la ricerca di nuove
strategie terapeutiche nell’AD, risulta oggi estremamente importante la conoscenza delle relazioni
esistenti tra deposizione di Aß ed alterazioni biochimiche e comportamentali, la caratterizzazione
rigorosa degli aspetti molecolari che si associano alle placche senili, sia prima che durante la
sperimentazione clinica di un farmaco. Infatti, un fattore ostacolante lo sviluppo di nuove e più
efficaci strategie terapeutiche nell’AD potrebbe derivare dalla insufficiente caratterizzazione degli
eventi a monte e a valle della deposizione di Aß, come il danno ossidativo, i meccanismi di
degradazione proteasomale e l’autofagia nonché le vie di segnale intracellulare, responsabili della
formazione di tau filamentosa e morte neuronale. Il ruolo svolto dall’autofagia e dai meccanismi
epigenetici nell’ AD non è chiaro ma rappresentano attualmente un’importante linea di ricerca sia
negli studi di patogenesi che di terapia. Diverse linee di ricerca suggeriscono l’esistenza di una
compromissione dell’autofagia con ridotta attività autofagosoma-lisosoma e diminuita efficacia del
sistema lisosomiale (Nixon et al. 2007). Inoltre recenti ricerche descrivono che meccanismi
epigenetici contribuiscono nei disordini cognitivi associati all’AD, in particolare il blocco
dell’espressione di geni implicati nella plasticità sinaptica mediato dall’HDAC2. Questi studi
suggeriscono come l’inibizione di questo istone insieme alla riduzione della presenza di Aß
rappresentino dei potenziali bersagli per contrastare il declino cognitivo nell’AD (Gräff et al. 2012)
Descrizione del programma
Il progetto di ricerca si propone di analizzare in vivo la presenza di alterazioni nella degradazione
proteica mediata dagli autofagosomi e di valutare l’effetto del trattamento cronico con oleuropeina
aglicone nel modello murino di deposizione di β-amiloide TgCRND8. L'uso di modelli animali
nello studio dell’AD è essenziale per approfondire le conoscenze sui meccanismi patogenetici,
nonchè per lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici. Il topo transgenico TgCRND8, che esprime la
ßAPP695 umana mutata (K670/M671L e V717F), è tra i modelli animali che più fedelmente
rappresentano la patologia umana. I topi eterozigoti TgCRND8 sviluppano, già ad undici settimane,
deposizione cerebrale di A e deficit di memoria spaziale, con comparsa di patologia neuritica
all’età di 5 mesi (Janus et al. 2000). Questa linea di topi transgenici è disponibile come colonia
presso questa unità di ricerca. I topi sono stabulati (stabulario CESAL dell’Università di Firenze) in
gabbie di plexiglas con accesso libero a cibo ed acqua e sottoposti ad un ciclo luce-oscurità di 12
ore a temperatura costante di 23 °C. Tutti gli esperimenti sono eseguiti in accordo con le linee guida
dell’ European Community's Council for Animal Experiments (DL 116/92). Sarà utilizzato ogni
accorgimento per rendere minima la sofferenza degli animali. La caratterizzazione morfologica e
funzionale del suddetto modello murino di AD ha dimostrato in corteccia ed in ippocampo, aree
cerebrali che presentano il maggior numero di placche senili e di grovigli neurofibrillari nei pazienti
AD, la presenza di un’estesa deposizione di Aβ e di gliosi reattiva ad essa associata, l’induzione di
marker infiammatori, iNOS, stress nitrosativo, iperfosforilazione di tau e marcata perdita neuronale,
nonché una compromissione del sistema colinergico corticale con conseguenti deficit
comportamentali e disfunzioni della via di segnale intracellulare Wnt/ß-catenina. Questo studio è
stato oggetto di tre pubblicazioni su prestigiose riviste internazionali (Bellucci et al. 2006 e 2007;
Rosi et al 2010). Inoltre i nostri studi hanno dimostrato che il trattamento per 4-5 settimane con
Cliochinolo di topi TgCRND8 di 4 mesi di età riduce significativamente i depositi di Aß in
corteccia ed ippocampo e migliora le funzioni cognitive (Grossi et al. 2009). Considerata la
rilevanza dei sopra citati risultati per la delucidazione dei meccanismi patogenetici della malattia di
AD e per l’individuazione di nuovi target terapeutici, riteniamo di estrema importanza poter
proseguire le nostre indagini scientifiche. ci proponiamo di effettuare in vivo un’ analisi
approfondita delle relazioni esistenti tra la deposizione di Aß e gli eventi intracellulari che
conducono a morte neuronale nei topi transgenici TgCRND8 (tg) e in aree cerebrali di interesse
come la corteccia, ippocampo. A varie età degli animali, partendo dalla fase presintomatica di 2
mesi fino agli 10-12 mesi di età quando la patologia è nella sua massima espressione in termini di
deposizione di ß-amiloide, con studi di immunoistochimica e di Western blotting sarà studiato
l’effetto protettivo della somministrazione cronica di oleuropeina sulla neuropatologia e deficit
cognitivi. E noto che l’aglicone dell’oleuropeina, un polifenolo abbondante nell’olio extravergine di
oliva è in grado di eliminare la comparsa delle forme oligomeriche di Aß, dotate della massima
citotossicità, proteggendo le cellule dall’azione tossica del peptide. Pertanto, in un gruppo di topi
saranno valutati gli effetti del trattamento cronico, 8 settimane, con oleuropeina aglicone o veicolo
(somministrati attraverso la dieta, alla dose di 50 mg per kg dieta, dose che corrisponde all’apporto
giornaliero medio di questi composti nei paesi mediterranei). In particolare saranno valutati gli
effetti a carico della deposizione di Aβ mediante studi quali-quantitativi di immunoistochimica,
western blotting mediante anticorpi specifici per i diversi stadi di aggregazione del peptide
(monomeri, dimeri, oligomeri, fibrille), volti a chiare la tossicità e il possibile intervento di queste
sostanze nel processo di fibrillogenesi di Aβ. Verranno valutati mediante studi di
immunoistochimica e di western blotting marker caratteristici della neurodegenerazione neuronale e
sinaptica, della neuroinfiammazione (GFAP, IbaI) Lo stato di attivazione dell’autofagia sara
valutato con marker precoci, come Beclina 1 e LC3-I e II e tardivi come la Catepsina D lisosomiale.
A livello epigenetico con tecniche di Western Blotting e PCR sara’ valutato lo stato di acetilazione
di alcuni istoni. Gli effetti a livello delle funzioni cognitive di topi TgCRND8 e di controllo
verranno studiate mediante i test comportamentali Object Recognition Test (ORT) e Morris water
maze. Questi studi ci forniranno informazioni utili sulle proprietà neuro protettive e terapeutiche
dell’ oleuropeina aglicone.
Referenze
1.LaFerla FM et al (2007) Nat Rev Neurosci 8:499-509
2.Butterfield DA and Sultana R (2007) J Alzheimers Dis 12:61-72
3.Haass C and Selkoe DJ (2007) Nat Rev Mol Cell Biol 8:101-112
4.Selkoe DJ (1999) Nature 399:A23-A31
5.Nunomura A et al (2001) J Neuropathol Exp Neurol 60:759-767
6.Chauhan VChauhan A (2006) Pathophysiology 13:195-20
7.Klafki HW et al (2006) Brain 129:2840-2855
8.Nixon RA (2007) J Cell Sci 120:4081-4091
9.Gräff Jet al. (2012) Nature 483: 222-226
10.Janus C et al (2000) Nature 408:979-982
11.Bellucci et al. (2006) Neurobiol Dis. 23:260-72
12.Bellucci et al (2007 Neurobiol Dis. 27 :328-38
13.Rosi et al. (2010) J Neurochem. 2010 112:1539-51
14.Grossi et al. (2009) J Alzheimers Dis. 2009 17:423-40