RISOLUZIONE OIV-OENO 408-2011
STRUMENTI DI BIOLOGIA MOLECOLARE PER L'IDENTIFICAZIONE DEL LIEVITO
VINARIO SACCHAROMYCES CEREVISIAE E DI ALTRE SPECIE DI LIEVITI
RELATIVE ALLA VINIFICAZIONE
L’ASSEMBLEA GENERALE
Visto l'articolo 2 paragrafo 2, n. IV dell'Accordo del 3 aprile 2001 che istituisce
l'Organizzazione Internazionale della Vigna e del Vino,
Su proposta del gruppo di esperti di “Microbiologia”
DECIDE di adottare i seguenti strumenti di biologia molecolare per l'identificazione del
lievito vinario Saccharomyces cerevisiae e di altre specie di lieviti relative alla
vinificazione
DECIDE, inoltre, di includere le seguenti Premesse nel promuovere gli strumenti di
biologia molecolare per l'identificazione del lievito vinario Saccharomyces cerevisiae e di
altre specie di lieviti legate alla vinificazione, nonché gli strumenti di biologia molecolare
per l'identificazione dei batteri lattici [Oeno-MICRO 09-409] sull’uva e nel vino
Premessa [ad Oeno-MICRO 09-408 ed Oeno-MICRO 09-409]
L'origine, lo sviluppo, i cambiamenti e la successione delle varie specie di lievito possono
essere seguiti utilizzando specifiche tecniche molecolari che permettono la
differenziazione e la tipizzazione dei ceppi di lievito. Recentemente, nello studio della
microbiologia della vinificazione sono state impiegate diverse tecniche. Tali metodi sono
sensibili e specifici, essendo volti a rispondere alle diverse esigenze, oltre ad essere
semplici, rapidi, riproducibili, efficaci, affidabili e non costosi. L’applicazione di metodi
molecolari di identificazione può essere effettuata senza una previa coltura, oppure a
seguito di arricchimento o anche a seguito di isolamento dei microrganismi. Ciò permette
di conoscere meglio il sistema microbico che si sviluppa sulla superficie dell’uva o del
vino. La presente guida ha lo scopo di assistere i laboratori che svolgono analisi
microbiologiche nel loro approccio all’identificazione del lievito Saccharomyces cerevisiae
e di altre specie di lieviti [Oeno-MICRO 09-408] relative alla vinificazione, nonché
nell’identificazione dei batteri lattici [Oeno-MICRO 09-409] presenti sull’uva e nel vino. Le
tecniche riportate trattano i principi generali delle tecniche molecolari disponibili. Per i
metodi dettagliati si rimanda alla bibliografia.
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Secretario dell’Assemblea Generale
Federico CASTELLUCCI
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Strumenti molecolari per l'identificazione del lievito vinario Saccharomyces
cerevisiae e di altre specie di lieviti relative alla vinificazione
Per l'identificazione e la caratterizzazione dei lieviti vinari in diverse fasi della
vinificazione, dell’invecchiamento e della conservazione possono essere utilizzati metodi
coltura-dipendenti o coltura-indipendenti.
METODI COLTURA-DIPENDENTI
IDENTIFICAZIONE DI LIEVITI A LIVELLO DI SPECIE
rDNA PCR-RFLP (restriction fragments length polymorphism)
PRINCIPIO
Si tratta di un metodo coltura-dipendente, poiché richiede l'estrazione del DNA da una
coltura pura. Tale metodo si basa sull'amplificazione di regioni specifiche di unità ripetute
di rDNA (tra cui gli spaziatori interni trascritti ITS1 e ITS2 e il gene 5.8S rRNA integrato o
il gene 265 rRNA). Tali regioni hanno sequenze altamente conservate e sequenze che
mostrano un alto grado di variabilità genetica tra lieviti di specie differenti. Nella
maggioranza dei casi, i prodotti della PCR amplificati da ceppi della stessa specie e dello
stesso genere presentano dimensioni molecolari identiche, e le specie dello stesso genere
hanno dimensioni simili. Anche se della stessa dimensione, la sequenza di tali regioni
amplificate differisce secondo le specie. Pertanto, la differenza di sequenza è messa in
evidenza mediante l’ analisi di restrizione utilizzando differenti endonucleasi di restrizione
come ad esempio: CfoI HaeIII, HinfI, DdeI, MboI. I profili di restrizione differiscono
secondo le specie.
L’enzima DdeI è necessario per la differenziazione tra H. uvarum e H. Guilliermondii,
come riportato da Esteve-Zarzoso et al. (1999) e Cadez et al., 2002, mentre l'enzima
MboI è necessario per distinguere C. zemplinina da C. stellata (Sipicki, 2004).
Inoltre, per differenziare le specie del genere Saccharomyces e i relativi ibridi dovrebbero
essere utilizzati altri enzimi di restrizione (Gonzales et al., 2006).
RISULTATI
Questa metodologia è già stata utilizzata per identificare circa 145 specie di lieviti
appartenenti a 26 generi di lievito differenti e i profili di restrizione della maggior parte
delle specie identificate sono riportati da Esteve-Zarzoso et al. (1999) e Zanol et al.
(2010). Dati relativi all’ITS-5.8S sono disponibili online (http://www.yeast-id.com).
BIBLIOGRAFIA
Esteve-Zarzoso et al., (1999) Identification of yeasts by RFLP analysis of the 5.8 S rRNA
gene and the two ribosomal internal transcribed spacers. Int. J. Syst. Bacteriolo. 49, 329Esemplare certificato conforme
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337.
Fernández-Espinar et al. (2000) RFLP analysis of the ribosomal transcribed spacers and
the 5.8 S rRNA gene region of the genus Saccharomyces: a fast method for species
identification and the differentiation of flor yeasts. . Antoine Van Leeuwenhoek 78: 8797.
De Llanos et al. (2004) Identification of species of genus Candida by RFLP analysis of the
5.8 S rRNA gene and the two ribosomal internal transcribed spacers. . Antoine Van
Leeuwenhoek 85: 175-185.
Baleiras Couto et al. (2005) Partial 26S rDNA restriction analysis as a tool to characterise
non-Saccharomyces yeasts present during red wine fermentations. Int. J. Food Microbiol
102, 49-56.
Zanol G., Baleiras-Couto M.M., Duarte F.L. (2010) Restriction profiles of 26S rDNA as a
molecular approach for wine yeasts identification. Ciência e Técnica Vitivinícola 25: 7585.
Cadez N., Raspor P., de Cock A.W.A.M., Boekhout T., Smith M.Th. (2002) Molecular
identification and genetic diversity within species of the genera Hanseniaspora and
Kloeckera. FEMS Yeast Research 1, 279-289.
Sipiczki M. (2004) Species identification and comparative molecular and physiological
analysis of Candida zemplinina and Candida stellata. J. Basic Microbiol. 44 (6), 471–479.
González S.S., Barrio E., Gafner J., Querol A. (2006) Natural hybrids from
Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces bayanus and Saccharomyces kudriavzevii in
wine fermentations. FEMS Yeast Res 6, 1221–1234.
Sequenziamento della regione D1/D2 dopo amplificazione PCR
PRINCIPIO
Si tratta di un metodo coltura-dipendente, poiché richiede l’estrazione del DNA da una
coltura pura. Si basa sull’amplificazione della regione D1/D2 del gene 26S rRNA e sul
successivo sequenziamento dell’amplicone ottenuto. La sequenza della regione D1/D2
differisce più dell’1% tra specie diverse e meno dell’1% tra ceppi appartenenti alla stessa
specie.
RISULTATI
La sequenza della regione D1/D2 del gene 26S rRNA consente di compiere una
differenziazione all’interno dell’ampia varietà di specie di lieviti conosciute. La sequenza
della regione D1/D2 del gene 26S rRNA permette la classificazione e l’identificazione
filogenetica degli isolati incogniti, giacché il database esistente è di gran lunga il più
grande tra i geni dei lieviti.
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BIBLIOGRAFIA
Kurtzman e Robnett (1997) Identification of clinically important ascomycetous yeasts
based on nucleotide divergence in the 5' end of the large-subunit (26S) ribosomal DNA
gene. J Clin Microbiol. 35, 5 ::1216-23.
Kurtzman e Robnett (1998) Identification and phylogeny of ascomycetous yeasts from
analysis of nuclear large subunit (26S) ribosomal DNA partial sequences. Antonie Van
Leeuwenhoek. 73, 4,: 331-71.
Baleiras Couto et al. (2005) Partial 26S rDNA restriction analysis as a tool to characterise
non-Saccharomyces yeasts present during red wine fermentations. Int. J. Food Microbiol
102, 49-56.
IDENTIFICAZIONE DEI LIEVITI VINARI A LIVELLO DI CEPPO
RFLP (restriction fragments length polymorphism) del DNA mitocondriale
(mtDNA)
PRINCIPIO
Il DNA mitocondriale (mtDNA) del S. cerevisiae è una piccola molecola di 65-80 Kb il cui
grado di variabilità può essere osservato mediante l’analisi di restrizione. L’alto grado di
polimorfismo del mtDNA consente di analizzare la variabilità di specifici ceppi vinari di S.
cerevisiae. Si tratta di uno dei metodi più utilizzati al fine di caratterizzare i lieviti vinari
isolati durante la fermentazione alcolica. Querol et al (1992) e López et al (2001) hanno
semplificato il metodo d’analisi: è richiesta soltanto l’estrazione del DNA totale da un
isolato in coltura pura e l’analisi di restrizione con gli enzimi di restrizione Hinf I o Rsa I
(Guillamón et al., 1994, Schuller et al 2004; Lopes et al 2006).
RISULTATI
La presente tecnica permette un’alta capacità d’identificazione del ceppo in tempi brevi.
Può essere utilizzata dall’industria vinicola, poiché è una tecnica rapida, sicura e non
necessita di strumentazione PCR.
BIBLIOGRAFIA
Querol et al (1992) A comparative study of different methods of yeast strain
characterization. Syst. Appl. Microbiol. 15: 439-446.
Guillamón et al (1994) Rapid characterization of four species of the Saccharomyces sensu
stricto complex according to mitochondrial DNA patterns. Int. J. Bacteriol. 44: 708-714.
López et al (2001) A simplified procedure to analyse mtDNA from industrial yeast. Int. J.
Food Microbiology 68: 75-81.
Schuller D, Valero E., Dequin S., Casal (2004) Survey of molecular methods for the
typing of wine yeast strains. FEMS Microbiology Letters 231, 19-26.
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Lopes C.A, Lavalle T.L, Querol A., Caballero A.C. (2006) Combined use of killer biotype
and mtDNA-RFLP patterns in a Patagonian wine Saccharomyces cerevisiae diversity
study. Antonie van Leeuwenhoek 89, 147–156.
Amplificazione delle sequenze Delta (δ)
PRINCIPIO
Le sequenze Delta sono elementi di 0,3 Kb (334 bp) che affiancano i retrotrasposoni Ty1
in S. cerevisiae. All’interno del genoma del lievito sono state trovate tra 35 e 55 copie di
sequenze delta, come parte dei retrotrasposoni Ty1 o come elementi isolati. Tuttavia, tali
sequenze delta sono concentrate nelle regioni genomiche che si legano ai geni tRNA. Il
numero e l’ubicazione di questi elementi presentano una certa variabilità intraspecifica
che Ness et al (1993) hanno utilizzato per l’elaborazione di primer specifici: δ1 e δ2 utili
per la differenziazione del ceppo S. cerevisiae. Legras e Karts (2003) hanno ottimizzato
questa tecnica mediante la progettazione di due nuovi primer: δ12 e δ21 collocati accanto a
δ1 e δ2. L’utilizzo di δ12 e δ21 o di δ12 con δ2 rivela maggiori polimorfismi che si riflettono in
più bande sul gel dell’elettroforesi.
RISULTATI
Legras e Karts (2003) hanno identificato 53 ceppi commerciali utilizzando la
combinazione di δ12 e δ21 o δ12 con δ2. Shuller et al. (2004) sono stati in grado di
differenziare un gran numero di ceppi di lieviti vinari mediante l’utilizzo dei primer δ12 e
δ2.
BIBLIOGRAFIA
Ness et al, (1993) Identification of yeast strains using the polymerase chain reaction. J.
Sci. Food Agric. 62: 89-94.
Legras e Karst (2003) Optimisation of interdelta for Saccharomyces cerevisiae strain
characterization. FEMS Microbiol. Lett. 221 : 249-255.
Schuller et al, (2004) Survey of molecular methods for the typing of wine yeast strains.
FEMS Microbiol. Lett. 231: 19-26.
Genotipizzazione per mezzo di microsatelliti
PRINCIPIO
I microsatelliti sono brevi sequenze nucleotidiche ripetute in tandem lunghe da 1 a 10 pb.
Tali sequenze sono diffuse in tutto il genoma del lievito, sia nelle regioni di codificazione
sia in quelle di non codificazione ma con una percentuale più bassa nelle regioni di
codificazione. I marker microsatellitari sono dei loci polimorfi per i quali la diversità degli
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alleli permette di differenziare i ceppi di una stessa specie di lieviti . I vari loci sono noti e
possono essere usati per tipizzare ceppi di S. cerevisiae (Legras et al. 2005). I profili
ottenuti da una combinazione di almeno sei microsatelliti permettono un’efficace
differenziazione di ceppi di S. cerevisiae.
RISULTATI
I marker microsatelliti sono frequentemente usati come marker genetici in studi di
mappatura genetica e di genetica della popolazione. La combinazione di sei loci
microsatelliti è indicata come una tecnica altamente discriminante e riproducibile, in
grado di rivelare al tempo stesso relazioni geografiche e tecnologiche tra ceppi. Questi
loci polimorfici possono essere facilmente usati per determinare il profilo dei ceppi di S.
cerevisiae durante la fermentazione.
BIBLIOGRAFIA
Schuller et al. (2004) Survey of molecular methods for the typing of wine yeast strains.
FEMS Microbiol. Lett. 231: 19-26.
Legras et al. (2005) Selection of hypervariable microsatellite loci for the characterization
of Saccharomyces cerevisiae strains. Int J Food Microbiol. 102: 73– 83.
Schuller e Casal (2007) The genetic structure of fermentative vineyard-associated
Saccharomyces cerevisiae populations revealed by microsatellite analysis. Antonie van
Leeuwenhoek 91:137–150.
METODI COLTURA-INDIPENDENTI
PCR QUANTITATIVA (qPCR)
OBIETTIVO
Individuazione e quantificazione rapida dei lieviti a livello di specie nel mosto o nel vino.
PRINCIPIO
Questo metodo si basa sull’uso di primer per lieviti universali disegnati sui domini
variabili D1/D2 del gene 26S rRNA. Si tratta di una delle poche sequenze di geni
disponibili per tutte le specie di lieviti ascomiceti conosciute. La quantificazione è
possibile a partire dalla determinazione del numero di cicli di polimerizzazione necessario
per superare il segnale soglia. Più la concentrazione di DNA della specie bersaglio è
elevata nel campione, meno il numero di cicli necessari per superare il segnale soglia è
elevato. Le curve di calibrazione permettono una determinazione precisa.
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RISULTATI
La presente tecnica è stata usata per la quantificazione delle cellule di Candida stellata,
Dekkera bruxellensis, Hanseniaspora uvarum, e Saccharomyces cerevisiae in
fermentazione mista sia in un mezzo sintetico sia nel vino. L’analisi è risultata lineare su
5 ordini di grandezza e il limite di rivelazione è stato di circa 102 CFU/ml. La presenza di
altri microrganismi vinari non-target (sia lieviti sia batteri) nei campioni non ha influito
significativamente sull’analisi qPCR.
Un metodo rapido qPCR è stato sviluppato per individuare e quantificare i diversi lieviti
non Saccharomyces, utilizzando primers specie-specifici per C. zemplinina, T.delbrueckii,
I. orientalis e M. pulcherrima (Zott et al., 2010).
BIBLIOGRAFIA
Hierro, Esteve-Zarzoso, Gonzalez, Mas and Guillamon et al. (2006) Real-Time
Quantitative PCR (qPCR) and Reverse Transcription-qPCR for Detection and Enumeration
of Total Yeasts in Wine. Appl. Environ. Microbiol. 72(11): 7148–7155.
Zott K, Claisse O, Lucas P, Coulon J, Lonvaud-Funel A, Masneuf-Pomarede I (2010)
Characterization of the yeast ecosystem in grape must and wine using real-time PCR.
Food Microbiology 27:559-567.
PCR-DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis)
OBIETTIVO
Identificazione dei lieviti a livello di specie nel mosto o nel vino
PRINCIPIO
Il presente metodo si basa sull’amplificazione dei lieviti 26S rDNA utilizzando primer
universali U1 ( contenente una coda GC clamp) e U2. I frammenti di amplificazione sono
separati sulla base della lunghezza e della composizione
nucleotidica in un gel
denaturante di poliacrilammide (gradiente da 20 a 60% di urea e formammide). I
frammenti di amplificazione che presentano un certo interesse sono asportati
direttamente dal gel e sequenziati per l’identificazione delle specie microbiche facendo
riferimento alla banda di sequenza 26S rDNA dei lieviti. Uno dei vantaggi è la possibilità
di identificare lieviti vitali ma non coltivabili per i quali il DNA è amplificato.
RISULTATI
La presente tecnica è stata utilizzata per l’identificazione di popolazioni microbiche sia in
campioni di uva sia di vino ed ha portato all’identificazione di varie specie di lieviti
(Candida diversa, Candida sorboxylosa, Candida stellata, Dekkera bruxellensis,
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Hanseniaspora
occidentalis,
Hanseniaspora
uvarum,
Issatchenkia
hanoiensis,
Issatchenkia occidentalis, Issatchenkia orientalis, Issatchenkia terricola, Kluyveromyces
thermotolerans, Metschnikowia pulcherrima, Pichia kluyveri, Saccharomyces cerevisiae,
Saccharomycodes ludwigii, Torulaspora delbrueckii, Zygosaccharomyces bailii).
Popolazioni di lieviti vinari superiori a 103 cellule/ml sono state adeguatamente rivelate e
identificate mediante PCR-DGGE. La PCR-DGGE non è uno strumento quantitativo.
BIBLIOGRAFIA
Cocolin L, Heisey A, and Mills D.A. et al. (2001) Direct Identification of the Indigenous
Yeasts in Commercial Wine Fermentations. Am. J. Enol. Vitic. 52:1:49-53.
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