RISOLUZIONE OIV-OENO 412-2012 Determinazione dell’attività della endo-(1,5) arabinanasi nelle preparazioni enzimatiche pectolitiche L’ASSEMBLEA GENERALE, Visto l’Articolo 2, Paragrafo 2 IV dell’Accordo del 3 aprile 2001 che istituisce l’Organizzazione Internazionale della Vigna e del Vino, CONSIDERATE le risoluzioni OIV/OENO 13/04, 11/04, 12/04, 15/04 adottate dall’OIV nel 2004, CONSIDERATA la risoluzione preparazioni enzimatiche, OIV-OENO-365/2009 nel documento generale sulle Su proposta del gruppo di esperti "Specificazione dei prodotti enologici", DECIDE di aggiungere al Codex Enologico Internazionale la seguente monografia sull‘attività della endo-1,5--arabinanasi: Determinazione dell’attività della endo-(1,5) arabinanasi nelle preparazioni enzimatiche pectolitiche Specifiche generali Questi enzimi sono solitamente presenti, tra le altre attività, all’interno di un complesso enzimatico. Salvo indicazioni contrarie, le specifiche devono essere conformi alla risoluzione OENO 365-2009 relativa alle specifiche generali per le preparazioni enzimatiche che figurano nel Codex Enologico Internazionale. 1. Origine Si fa riferimento al paragrafo 5 “Fonti di enzimi e ambienti di fermentazione” della monografia generale sulle preparazioni enzimatiche. Le preparazioni enzimatiche contenenti tali attività sono prodotte dalla fermentazione diretta di microrganismi come ad esempio Aspergillus niger, Aspergillus Tubigensis, Aspergillus Awamori Trichoderma reesei, Penicillium funiculosum. Le arabinanasi appartengono alla famiglia delle glicoidrolasi. 2. Obiettivo/Campo di applicazione Si fa riferimento al Codice Internazionale delle Pratiche Enologiche, Oeno 11/04; 12/04; 13/04; 14/04 e 15/04. Le arabinanasi sono utili per la macerazione delle uve, la chiarifica dei mosti e dei vini, la filtrabilità dei mosti e dei vini poiché hanno delle proprietà che favoriscono l'azione di Esemplare certificato conforme Izmir, il 22 giugno 2012 Il Direttore Generale dell’OIV Secretario dell’Assemblea Generale Federico CASTELLUCCI © OIV 2012 1 altre attività enzimatiche in grado di idrolizzare i componenti della parete cellulare dell’uva. 3. Principio Il substrato utilizzato è arabinano non ramificato reticolato con azzurrina (AZCLArabinano). L’arabinano, altamente purificato proveniente da polpa di barbabietola da zucchero, viene trattato con α-L-arabinofuranosidasi per rimuovere i residui di arabinofuranosile legato mediante legami -1,3 e -1,2, mantenendo l’arabinano lineare legato attraverso legami -1,5. Questo polisaccaride contiene ancora una piccola percentuale di acido galatturonico, galattosio e ramnosio (rispettivamente 6, 4 e 2 %), ma è resistente all’attacco da parte della poligatturonasi e della endo-1,4-β-Dgalattanasi. Il polisaccaride viene quindi marcato con un colorante e reticolato. Il trattamento di questo substrato con un eccesso di α-L-arabinofuranosidasi provoca un rilascio limitato di arabinosio ma senza il rilascio di frammenti marcati con il colorante. L’AZCL-Arabinano è un substrato altamente sensibile e molto specifico per il test con endo-arabinanasi, consentendo la misurazione del surnatante a 590 nm dopo la reazione. 4. Apparecchiatura 4.1 Provette di vetro (15 mL) 4.2 Bagno d’acqua a 40 °C 4.3 Agitatore Vortex 4.4 Filtro circolare qualitativo in grado di trattenere le particelle con diametro di 11µm (in soluzione) 4.5 Cuvette con cammino ottico di 1 cm 4.6 Spettrofotometro tarato a 590 nm 4.7 Cronometro 4.8 Pipetta (500 µl, 10 ml) 4.9 pH-metro 4.10 Provette di vetro da 15 mL 4.11 Supporto metallico per provette da 15 mL 4.12 Imbuto 4.13 Matraccio tarato da 100 mL 5. Reagenti e materiali: 5.1 Arabinazyme in compresse (Megazyme, lotto 60701), ad esempio 5.2 Trizma base (N° CAS 77-86-1) 5.3 Acido acetico glaciale (N° CAS 64-19-7) 5.4 Soluzione d’idrossido di sodio (N° CAS 1310-73-2) 6. Soluzioni 6.1 Tampone di diluizione (Tampone di acetato di sodio, 50 mM, pH 4,0) Aggiungere acido acetico glaciale a 900 mL di acqua distillata. Aggiustare la soluzione a pH 4,0 mediante aggiunta di soluzione d’idrossido di sodio 1 M. Portare al volume di 1 L con acqua distillata. 6.2 Soluzione al 2% di Trizma base Diluire 2g della Trizma base in 100 mL di acqua distillata. 7. Preparazione del campione 7.1 Diluizione dell’enzima Per la maggior parte delle preparazioni commerciali di pectinasi, è necessaria una diluizione di 500 volte. Introdurre 200 mg della preparazione commerciale in un Esemplare certificato conforme Izmir, il 22 giugno 2012 Il Direttore Generale dell’OIV Secretario dell’Assemblea Generale Federico CASTELLUCCI © OIV 2012 2 matraccio tarato da 100 mL, portare a volume col tampone di diluizione (6.1), e agitare per ottenere una miscela omogenea. 8. Procedura 8.1 Reazione enzimatica Preparare le provette almeno in duplicato. Diluire 500 µL di enzima nel tampone di diluizione (7.1) e pre-equilibrare a 40 °C per 5 minuti. Avviare la reazione aggiungendo una compressa di Arabinazyme. Far partire il cronometro. La compressa s’idrata rapidamente. Non agitare la sospensione. Esattamente dopo 10 min a 40 °C, arrestare la reazione mediante aggiunta di 10 mL di soluzione di Trizma base (6.2) ed agitare. Far riposare per circa 5 minuti a temperatura ambiente, agitare nuovamente la sospensione e filtrarla con un filtro circolare qualitativo. Quindi, misurare l’assorbanza delle soluzioni di reazione a 590 nm rispetto al bianco di reazione. 8.2 Bianco di reazione Preparare un bianco di reazione aggiungendo 10 mL di soluzione Trizma base (6.2) a 500 µL di soluzione enzimatica ed agitare prima di aggiungere la compressa di Arabinazyme. 9. Calcoli L’attività della endo-arabinanasi analizzata è determinata facendo riferimento alla curva di calibrazione del kit per il test (ossia Lot. N° 60701) Esemplare certificato conforme Izmir, il 22 giugno 2012 Il Direttore Generale dell’OIV Secretario dell’Assemblea Generale Federico CASTELLUCCI © OIV 2012 3 mU/test Y = (MX + C) *2 *FV /1000 [U/g o ml] Dove: Y M X attività della endo-arabinasi (in milliUnità/test) pendenza della curva di calibrazione assorbanza della reazione a 590 nm (meno il bianco della reazione, o lettura rispetto al bianco della reazione) C intersezione sull’asse delle Y (ordinata all’origine) 2 conversione di 0,5 mL di diluizione enzimatica a 1 mL nel test FV fattore di diluizione della preparazione enzimatica originale (ossia 500 volte) 1000 conversione da milliUnità a Unità 10. Bibliografia http://secure.megazyme.com/downloads/en/data/T-ARZ200.pdf Dietrich H., Will F. (1998); Vom Phänomen der Trübung; Getränkeindustrie; 2; S. 80 – 88. Esemplare certificato conforme Izmir, il 22 giugno 2012 Il Direttore Generale dell’OIV Secretario dell’Assemblea Generale Federico CASTELLUCCI © OIV 2012 4