Determinazione dell`attività della endo

RISOLUZIONE OIV-OENO 412-2012
Determinazione dell’attività della endo-(1,5) arabinanasi nelle preparazioni
enzimatiche pectolitiche
L’ASSEMBLEA GENERALE,
Visto l’Articolo 2, Paragrafo 2 IV dell’Accordo del 3 aprile 2001 che istituisce
l’Organizzazione Internazionale della Vigna e del Vino,
CONSIDERATE le risoluzioni OIV/OENO 13/04, 11/04, 12/04, 15/04 adottate dall’OIV nel
2004,
CONSIDERATA la risoluzione
preparazioni enzimatiche,
OIV-OENO-365/2009
nel
documento
generale
sulle
Su proposta del gruppo di esperti "Specificazione dei prodotti enologici",
DECIDE di aggiungere al Codex Enologico Internazionale la seguente monografia
sull‘attività della endo-1,5--arabinanasi:
Determinazione dell’attività della endo-(1,5) arabinanasi nelle preparazioni
enzimatiche pectolitiche
Specifiche generali
Questi enzimi sono solitamente presenti, tra le altre attività, all’interno di un complesso
enzimatico. Salvo indicazioni contrarie, le specifiche devono essere conformi alla
risoluzione OENO 365-2009 relativa alle specifiche generali per le preparazioni
enzimatiche che figurano nel Codex Enologico Internazionale.
1. Origine
Si fa riferimento al paragrafo 5 “Fonti di enzimi e ambienti di fermentazione” della
monografia generale sulle preparazioni enzimatiche.
Le preparazioni enzimatiche contenenti tali attività sono prodotte dalla fermentazione
diretta di microrganismi come ad esempio Aspergillus niger, Aspergillus Tubigensis,
Aspergillus Awamori Trichoderma reesei, Penicillium funiculosum. Le arabinanasi
appartengono alla famiglia delle glicoidrolasi.
2. Obiettivo/Campo di applicazione
Si fa riferimento al Codice Internazionale delle Pratiche Enologiche, Oeno 11/04; 12/04;
13/04; 14/04 e 15/04.
Le arabinanasi sono utili per la macerazione delle uve, la chiarifica dei mosti e dei vini, la
filtrabilità dei mosti e dei vini poiché hanno delle proprietà che favoriscono l'azione di
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Izmir, il 22 giugno 2012
Il Direttore Generale dell’OIV
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Federico CASTELLUCCI
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altre attività enzimatiche in grado di idrolizzare i componenti della parete cellulare
dell’uva.
3. Principio
Il substrato utilizzato è arabinano non ramificato reticolato con azzurrina (AZCLArabinano). L’arabinano, altamente purificato proveniente da polpa di barbabietola da
zucchero, viene trattato con α-L-arabinofuranosidasi per rimuovere i residui di
arabinofuranosile legato mediante legami -1,3 e -1,2, mantenendo l’arabinano lineare
legato attraverso legami -1,5. Questo polisaccaride contiene ancora una piccola
percentuale di acido galatturonico, galattosio e ramnosio (rispettivamente 6, 4 e 2 %),
ma è resistente all’attacco da parte della poligatturonasi e della endo-1,4-β-Dgalattanasi. Il polisaccaride viene quindi marcato con un colorante e reticolato. Il
trattamento di questo substrato con un eccesso di α-L-arabinofuranosidasi provoca un
rilascio limitato di arabinosio ma senza il rilascio di frammenti marcati con il colorante.
L’AZCL-Arabinano è un substrato altamente sensibile e molto specifico per il test con
endo-arabinanasi, consentendo la misurazione del surnatante a 590 nm dopo la reazione.
4. Apparecchiatura
4.1 Provette di vetro (15 mL)
4.2 Bagno d’acqua a 40 °C
4.3 Agitatore Vortex
4.4 Filtro circolare qualitativo in grado di trattenere le particelle con diametro di 11µm (in
soluzione)
4.5 Cuvette con cammino ottico di 1 cm
4.6 Spettrofotometro tarato a 590 nm
4.7 Cronometro
4.8 Pipetta (500 µl, 10 ml)
4.9 pH-metro
4.10 Provette di vetro da 15 mL
4.11 Supporto metallico per provette da 15 mL
4.12 Imbuto
4.13 Matraccio tarato da 100 mL
5. Reagenti e materiali:
5.1 Arabinazyme in compresse (Megazyme, lotto 60701), ad esempio
5.2 Trizma base (N° CAS 77-86-1)
5.3 Acido acetico glaciale (N° CAS 64-19-7)
5.4 Soluzione d’idrossido di sodio (N° CAS 1310-73-2)
6. Soluzioni
6.1
Tampone di diluizione
(Tampone di acetato di sodio, 50 mM, pH 4,0)
Aggiungere acido acetico glaciale a 900 mL di acqua distillata. Aggiustare la soluzione a
pH 4,0 mediante aggiunta di soluzione d’idrossido di sodio 1 M. Portare al volume di 1 L
con acqua distillata.
6.2
Soluzione al 2% di Trizma base
Diluire 2g della Trizma base in 100 mL di acqua distillata.
7. Preparazione del campione
7.1
Diluizione dell’enzima
Per la maggior parte delle preparazioni commerciali di pectinasi, è necessaria una
diluizione di 500 volte. Introdurre 200 mg della preparazione commerciale in un
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matraccio tarato da 100 mL, portare a volume col tampone di diluizione (6.1), e agitare
per ottenere una miscela omogenea.
8. Procedura
8.1 Reazione enzimatica
Preparare le provette almeno in duplicato.
Diluire 500 µL di enzima nel tampone di diluizione (7.1) e pre-equilibrare a 40 °C per 5
minuti.
Avviare la reazione aggiungendo una compressa di Arabinazyme. Far partire il
cronometro.
La compressa s’idrata rapidamente. Non agitare la sospensione.
Esattamente dopo 10 min a 40 °C, arrestare la reazione mediante aggiunta di 10 mL di
soluzione di Trizma base (6.2) ed agitare.
Far riposare per circa 5 minuti a temperatura ambiente, agitare nuovamente la
sospensione e filtrarla con un filtro circolare qualitativo.
Quindi, misurare l’assorbanza delle soluzioni di reazione a 590 nm rispetto al bianco di
reazione.
8.2 Bianco di reazione
Preparare un bianco di reazione aggiungendo 10 mL di soluzione Trizma base (6.2) a 500
µL di soluzione enzimatica ed agitare prima di aggiungere la compressa di Arabinazyme.
9. Calcoli
L’attività della endo-arabinanasi analizzata è determinata facendo riferimento alla curva
di calibrazione del kit per il test (ossia Lot. N° 60701)
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mU/test
Y = (MX + C) *2 *FV /1000
[U/g o ml]
Dove:
Y
M
X
attività della endo-arabinasi (in milliUnità/test)
pendenza della curva di calibrazione
assorbanza della reazione a 590 nm (meno il bianco della reazione, o
lettura rispetto al bianco della reazione)
C
intersezione sull’asse delle Y (ordinata all’origine)
2
conversione di 0,5 mL di diluizione enzimatica a 1 mL nel test
FV
fattore di diluizione della preparazione enzimatica originale (ossia 500
volte)
1000 conversione da milliUnità a Unità
10. Bibliografia
http://secure.megazyme.com/downloads/en/data/T-ARZ200.pdf
Dietrich H., Will F. (1998); Vom Phänomen der Trübung; Getränkeindustrie; 2; S. 80 –
88.
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