Purificazione
della
GFP
LLC Bologna - 2007
Proteina Fluorescente Verde
La GFP è una proteina di media grandezza
formata da 238 amminoacidi e con un peso
molecolare intorno a 26 kDa. Essa venne
estratta e purificata per la prima volta dalla
medusa Aequorea Victoria nel 1962
La medusa contiene una proteina bioluminescente,
detta aequorina, che emette luce blu. La proteina fluorescente
verde converte questa luce in luce verde che è quella che davvero
vediamo quando la medusa si illumina. Una soluzione di proteina
GFP purificata appare gialla alla normale luce da interni ad
incandescenza, ma quando viene osservata alla luce ultravioletta,
questa soluzione emette un brillante colore verde.
La proteina assorbe infatti le radiazioni UV, e poi le emette
come luce verde di minore energia.
Struttura Tridimensionale Delle Proteine Verdi Fluorescenti
Questa proteina possiede una struttura tridimensionale
molto particolare, che ricorda un cilindro cavo o un
barilotto (in inglese, b-barrel), con un diametro di 24 Å
ed una altezza di 42 Å .
Le pareti del cilindro sono formate da 11 ß-foglietti
intrecciati a coppie e collegati tra loro mediante delle
corte a-eliche che chiudono le due basi della struttura.
All’interno di questa struttura estremamente
stabile (T. stab 76 °C) è contenuta
un’ulteriore a-elica che comprende il
cromoforo
della proteina.
Il corretto ripiegamento della proteina è
necessario per ottenere un ambiente rigido e
strutturato intorno al cromoforo e per
schermare il cromoforo da agenti esterni in
grado di deprimere la resa di fluorescenza
Utilizzi
Utilizzi proteina
proteina GFP
GFP
LLC Bologna 2009
Trasformazione Batterica
I batteri vengono sottoposti ai seguenti passaggi:
Trattamento con CaCl2 per rendere i
batteri
competenti
Shock termico - Inserimento del plasmide
Aggiunta di terreno di coltura liquido ed
incubazione
Semina in piastre con terreni selettivi
Incubazione overnight
Osservazione espressione
fenotipica
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Finalità
Separare la Green Fluorescent Protein dal contesto
cellulare e dal pool molecolare in cui si trova in soluzione
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Lisi della cellula batterica
lisi
lisozima
LLC Bologna - 2007
Centrifugazione
Centrifugazione
UV
surnatante
pellet
LLC Bologna - 2007
Cromatografia
Tecnica che consente la separazione
dei singoli componenti di una miscela
in
base
alle
loro
chimico-fisiche
LLC Bologna - 2007
caratteristiche
GFP
Atomi apolari
706
Atomi polari
1011
LLC Bologna - 2007
Idrofilo-idrofobo
+
+
+
+
+
+
+
+
GFP in soluzione
acquosa
GFP in soluzione salina
+
+
Ione ammonio
+
+
LLC Bologna - 2007
Ione solfato
Modello della struttura della GFP in
soluzione acquosa
Residuo aminoacidico
idrofilo
Residuo aminoacidico
idrofobo
Molecola H2O
Modello della struttura della GFP in
soluzione salina
+
+
+
Residuo aminoacidico
idrofilo
Residuo aminoacidico
idrofobo
Molecola H2O
+
Ione ammonio
Ione solfato
+
Colonna cromatografica ad
interazione idrofobica
(HIC)
LLC Bologna - 2007
