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Purificazione della GFP LLC Bologna - 2007 Proteina Fluorescente Verde La GFP è una proteina di media grandezza formata da 238 amminoacidi e con un peso molecolare intorno a 26 kDa. Essa venne estratta e purificata per la prima volta dalla medusa Aequorea Victoria nel 1962 La medusa contiene una proteina bioluminescente, detta aequorina, che emette luce blu. La proteina fluorescente verde converte questa luce in luce verde che è quella che davvero vediamo quando la medusa si illumina. Una soluzione di proteina GFP purificata appare gialla alla normale luce da interni ad incandescenza, ma quando viene osservata alla luce ultravioletta, questa soluzione emette un brillante colore verde. La proteina assorbe infatti le radiazioni UV, e poi le emette come luce verde di minore energia. Struttura Tridimensionale Delle Proteine Verdi Fluorescenti Questa proteina possiede una struttura tridimensionale molto particolare, che ricorda un cilindro cavo o un barilotto (in inglese, b-barrel), con un diametro di 24 Å ed una altezza di 42 Å . Le pareti del cilindro sono formate da 11 ß-foglietti intrecciati a coppie e collegati tra loro mediante delle corte a-eliche che chiudono le due basi della struttura. All’interno di questa struttura estremamente stabile (T. stab 76 °C) è contenuta un’ulteriore a-elica che comprende il cromoforo della proteina. Il corretto ripiegamento della proteina è necessario per ottenere un ambiente rigido e strutturato intorno al cromoforo e per schermare il cromoforo da agenti esterni in grado di deprimere la resa di fluorescenza Utilizzi Utilizzi proteina proteina GFP GFP LLC Bologna 2009 Trasformazione Batterica I batteri vengono sottoposti ai seguenti passaggi: Trattamento con CaCl2 per rendere i batteri competenti Shock termico - Inserimento del plasmide Aggiunta di terreno di coltura liquido ed incubazione Semina in piastre con terreni selettivi Incubazione overnight Osservazione espressione fenotipica LLC Bologna - 2007 Finalità Separare la Green Fluorescent Protein dal contesto cellulare e dal pool molecolare in cui si trova in soluzione LLC Bologna - 2007 Lisi della cellula batterica lisi lisozima LLC Bologna - 2007 Centrifugazione Centrifugazione UV surnatante pellet LLC Bologna - 2007 Cromatografia Tecnica che consente la separazione dei singoli componenti di una miscela in base alle loro chimico-fisiche LLC Bologna - 2007 caratteristiche GFP Atomi apolari 706 Atomi polari 1011 LLC Bologna - 2007 Idrofilo-idrofobo + + + + + + + + GFP in soluzione acquosa GFP in soluzione salina + + Ione ammonio + + LLC Bologna - 2007 Ione solfato Modello della struttura della GFP in soluzione acquosa Residuo aminoacidico idrofilo Residuo aminoacidico idrofobo Molecola H2O Modello della struttura della GFP in soluzione salina + + + Residuo aminoacidico idrofilo Residuo aminoacidico idrofobo Molecola H2O + Ione ammonio Ione solfato + Colonna cromatografica ad interazione idrofobica (HIC) LLC Bologna - 2007
