Fragment-based approaches in cristallogafia di proteine

XXI ciclo Scuola di Dottorato di Ricerca in Scienze Chimiche
Relazione II anno Dott. Lucia Cesari
Tutor: Prof. Stefano Mangani Fragment­based approaches in cristallogafia di proteine
Gli approcci al drug design che partono dallo studio dell’interazione tra una molecola molto semplice (frammento) con la proteina di interesse hanno avuto una rapida evoluzione negli ultimi anni (1) e si stanno ampiamente diffondendo per il valore aggiunto che portano all’ intero processo di drug discovery. Attraverso l’ utilizzo di metodi strutturali (NMR, X­ray) e tecniche biofisiche (isothermal titration calorimetry, mass spectrometry), la complementarità tra il sito attivo di una proteina e una piccola molecola può essere rapidamente ed efficacemente esplorata(2).
Nel caso dello screening tramite cristallografia a raggi X è necessario che il processo che va dalla produzione della proteina alla cristallizzazione sia ottimizzato in modo tale da generare in modo riproducibile cristalli di dimensioni e qualità opportune per la diffrazione.
Le proteine che abbiamo preso in considerazione (timidilato sintasi umana, S100 beta umana) si prestano molto bene ad un approccio di questo genere. La timidilato sintasi è un enzima che catalizza la reazione di metilazione del dUMP a dTMP nell’ ambito della sintesi degli acidi nucleici; per questo motivo è tra i target più interessanti nella chemioterapia antitumorale. E’ inoltre una proteina che abbiamo ampiamente trattato all’interno del nostro laboratorio e le cui condizioni di cristallizzazione sono note e ben riproducibili. In questo caso lo scopo del lavoro è quello, più ambizioso, di riuscire a trovare piccole molecole che riescano a legarsi all’ interfaccia del dimero e ad interagire con la sua formazione.
Questo lavoro, svolto in collaborazione con l' Universita' di Modena e Reggio Emilia nell'ambito del progetto europeo LIGHTS (http://www.lights­eu.org/), si e' articolato su due attivita' principali:

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l'ottenimento di cristalli della proteina complessata con un peptide per il quale ci sono evidenze sperimentali di interazione con la formazione del dimero. Al momento il problema maggiore riscontrato e' la scarsissima solubilita' del peptide in mezzo acquoso, che ostacola il processo di co­cristallizzazione;
lo studio dell' interfaccia fra i due monomeri, l'analisi delle tasche presenti sulla loro superficie e la loro eventuale accessibilita' tramite mappatura con probes molecolari, utilizzando il software GRID. Il passo successivo sara' quello di selezionare tramite esperimenti di docking e pharmacophore screening, delle piccole molecole (virtual hits) che abbiano le caratteristiche necessarie per interagire con il sito identificato nella proteina.
S100 beta è una proteina coinvolta nell’inattivazione delle funzioni di p53, un promotore della trascrizione che modula il segnale per l’apoptosi cellulare. La distruzione o la prevenzione della formazione del complesso S100b­p53 rappresenta un possibile approccio per lo sviluppo di farmaci anticancro.
I frammenti sono stati selezionati secondo la “Rule of three” (3)(AlogP < 3, Peso molecolare < 300, donatori di legami a idrogeno < 3, accettori di legami a idrogeno < 3, legami rotabili < 3), effettuando la ricerca su un database contenente oltre 7 milioni di molecole commercialmente disponibili.
La collezione cosi' ottenuta e' stata utilizzata per gli esperimenti di virtual screening, utilizzando le strutture di S100 beta in soluzione disponibili nel Protein Data Bank. Tramite docking e structure­
based pharmacophore sono stati selezionati 250 frammenti, che sono poi stati testati in un saggio NMR­based presso il CERM a Firenze. Per i composti che hanno mostrato una forte interazione con la proteina sono al momento in corso prove di co­cristallizazione per la determinazione via X­ray del modo di binding.
1. Hajduk PJ, Greer J, Nat Rev Drug Discov 2007, 6: 211­219.
2. Erlason DA, McDowellRS, O'Brien T, J Med Chem 2004, 47: 3463­3482.
3. Congreve M, Carr R, Murray C, Jhoti H, Drug Discov Today 2003, 8: 876­877.