Vettori a cassetta PRODUZIONE DI PROTEINE DA GENI CLONATI
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PRODUZIONE DI PROTEINE DA GENI CLONATI IN PROCARIOTI fermentatore PRODUZIONE DI PROTEINE DA GENI CLONATI IN PROCARIOTI Vettori a cassetta PRODUZIONE DI PROTEINE A PARTIRE DA GENI CLONATI Espressione di geni esogeni in procarioti Riconosciuto dalla subunità sigma RNA pol E. coli Sequenze promotore in procarioti e eucarioti riconosciute da RNA polimerasi specifiche Monitoraggio della proteina esogena con possibili effetti dannosi sul procariote promotore tac: ibrido tra trp e lac Ceppo speciale di E. coli lisogeno per T7 (fago T7 integrato e alterato: gene per RNA pol T7 a valle del promotore lac, indotto dall’IPTG ) SVANTAGGI PER LA PRODUZIONE DI PROTEINE ETEROLOGHE IN BATTERI - Non vengono rimossi eventuali introni - Possibile formazione di strutture secondarie della porzione iniziale trascritto (fig) - Possibile presenza di segnali di terminazione per il batterio (fig) - Propensione per alcuni codoni (fig) - Mancanza di modificazioni post-traduzionali (glicosilazioni, fosforilazioni, etc.) - Limite della lunghezza amminoacidica - Mancato ripiegamento della struttura terziaria e sovraespressione determinano i corpi di inclusione Formazione di strutture secondarie all’inizio del trascritto quali possibili conseguenze per inserimento sequenza esogena Vettori a cassetta per la fusione di geni in E. coli Fusione con parte iniziale di gene batterico Aumento resa e solubilità proteina eterologa Vantaggi di una proteina di fusione in frame: - presenza seq. nucleotidica di E. coli per legame ribosoma - peptide batterico iniziale stabilizzante - peptide batterico iniziale da utilizzare come segnale localizzazione cellulare (esportata nel mezzo di coltura o tra membrana esterna ed interna Fusione con la proteina di E. coli Glutatione-S-transferasi (GST) e purificazione con cromatografia per affinità al substrato (glutatione) Vettore: componente N-terminale della GST, componente C-terminale proteina da purificare. Promotore Lac inducibile libero Glutatione: tripeptide (cisteina, glicina, ac. glutammico) Rimozione della proteina di fusione es: con bromuro di cianogeno (se alla giunzione c’è metionina), con trombina (taglia adiacente a residui di arginina). Non deve essere tagliata all’interno la proteina di interesse! Proteina priva di struttura terziaria precipita e forma corpi di inclusione. Aggregati recuperati in forti condizioni denaturanti che non permettono corretto ripiegamento in vitro della proteina che quindi sarà inattiva! Screening cloni batterici trasformati con vettori di espressione Screening cloni batterici trasformati con vettori di espressione Produzione di proteina - studi biochimici e funzionali, cristallografici - produzione anticorpi specifici SVANTAGGI PER LA PRODUZIONE DI PROTEINE ETEROLOGHE IN BATTERI - Non vengono rimossi eventuali introni - Possibile formazione di strutture secondarie della porzione iniziale del trascritto - Possibile presenza di segnali di terminazione per il batterio - Propensione per alcuni codoni Mancanza di modificazioni post-traduzionali (ponti disolfuro, glicosilazioni, fosforilazioni, acetilazione, carbossilazione, etc.) - Limite della lunghezza amminoacidica - Mancato ripiegamento della struttura terziaria e sovraespressione determinano i corpi di inclusione PRODUZIONE INDUSTRIALE DI PROTEINE DA COLTURE DI CELLULE EUCARIOTICHE (LIEVITI E FUNGHI) COMPOSTO Antibiotici Penicilline Cefalosporine Cloramfenicolo, streptomicina MICRORGANISMO Penicillium spp. Cephalosporium spp Streptomyces spp. Enzimi Proteasi, amilasi Bacillus ssp. (batterio), Aspergillus spp. Alcool Aceto Acetone S. cerevisiae S. cerevisiae Clostridium ssp. ac. Acetico BIOTECNOLOGIE: USO DEI PROCESSI BIOLOGICI NELL’INDUSTRIA E NELLA TECNOLOGIA VETTORI DI CLONAGGIO PER GLI EUCARIOTI Lieviti e funghi filamentosi: produzione di proteine eterologhe anche a scopi biotecnologici con sintesi di prodotti medicinali o alimentari Saccharomyces cerevisiae Fungo unicellulare Ruolo fondamentale per produzione di birra e pane Vantaggi: conoscenza genetica e biochimica, facilità di coltura, alta resa Possibile utilizzo per clonaggio del plasmide naturale 2 µm Svantaggi: iperglicosilazione, difficoltà di secrezione delle proteine prodotte nel terreno di coltura, propensione per un codone PROMOTORI UTILIZZATI IN VETTORI DI ESPRESSIONE PER EUCARIOTI MICROBICI Galattosio epimerasi Esempio di glicosilazione dell’asparagina. L’iperglicosilazione di alcuni funghi può provocare reazione antigenica se la proteina è iniettata Saccharomyces cerevisiae 2 µm: plasmide naturale 6,3 kb, tra 70-200 copie risiede nel nucleo, si replica autonomamente, segrega sia in meiosi che in mitosi REP1 e REP2 (per replicazione) FLP (proteina che riconosce siti specifici nel DNA del lievito: integrazione per ricombinazione ) Ori D = funzione ignota Saccharomyces cerevisiae Vettori basati sul plasmide 2 µm: plasmidi episomici di lievito = YEp Procedura - clonaggio in seq. di pBR322 -selezione dei ricombinanti in E. coli (resistenze antibiotici) - inserimento in lievito e selezione (LEU2) Saccharomyces cerevisiae Vettori basati sul plasmide 2 µm: plasmidi episomici di lievito = YEp Saccharomyces cerevisiae Vettori basati sul plasmide 2 µm: plasmidi episomici di lievito = YEp Solo occasionalmente si integra Ricombinazione omologa tra geni LEU 2 Solo una copia di LEU2 funziona Saccharomyces cerevisiae Plasmide integrativo di lievito: YIp = plasmidi batterici (pBR322) con resistenza antibiotici per selezione in batteri + URA3 (gene di lievito per la selezione) Non contiene i geni di 2 µm (REP e ori) e non si può replicare se non si integra nel DNA dei cromosomi di lievito, stesso meccanismo di YEp Saccharomyces cerevisiae Criteri di scelta: efficienza di trasformazione, numero di copie, stabilità YIp: ideale per stabilità in coltura a lungo termine Saccharomyces cerevisiae Caratteristiche del clonaggio in YEp: - Frequenza di trasformazione molto alta: da 10000 a 100000 cellule trasformate per microgrammo di DNA plasmidico - Alto numero di copie: tra 20 e 50 per cellula - Svantaggi: nel processo di gemmazione spesso copie YEp non segregano nella cellula figlia QUINDI ALTA PRODUZIONE PROTEINA DEL GENE CLONATO MA INSTABILITA’ DELLA TRASFORMAZIONE Caratteristiche del clonaggio in YIp: -Frequenza di trasformazione bassa: 1000 cellule trasformate per microgrammo di DNA plasmidico per bassa efficienza di integrazione cromosomica - E’ presente in una sola copia per cellula QUINDI BASSA PRODUZIONE PROTEINA DEL GENE CLONATO MA GRANDE STABILITA’ DELLA TRASFORMAZIONE PER LUNGHI PERIODI DI COLTURA
