relazione primo anno

CLONAGGIO ED ESPRESSIONE DELLA PROTEINA ZNUA
Lo Zinco è un nutriente essenziale per la crescita di tutti gli organismi ed è un
cofattore strutturale o catalitico in numerose metallo proteine, l’eccessiva
concentazione di zinco interferisce con le funzioni vitali della cellula, per questo la
sua concentrazione intracellulare deve essere altamente regolata.
In questi ultimi anni sono stati scoperti sistemi di trasporto di zinco in diverse specie
batteriche, il mio lavoro consiste nello studio del trasportatore di zinco ZnuA di
Escherichia Coli per determinare la sua struttura e la sua importanza nella virulenza
batterica.
Il gene codificante per la proteina ZnuA è stato amplificato mediante una reazione di
PCR con l’utilizzo della Taq Expande High Fidelity e con i primers ZnuA Lumio Fw
e ZnuA Lumio Rev così disegnati:
ZnuA Lumio Fw : ctctgccgttgtcgcttcg
ZnuA Lumio Rev : ggagatctttaatctcctttcaggcagc
Il primo primer permette la formazione di un sito blunt nella sequenza genica da
amplificare, il secondo invece introduce il sito di restrizione per l’enzima Bgl II ,per
consentire il clonaggio nel vettore di espressione pET160 modificato.
Il vettore pET 160 appartiene alla famiglia dei vettori di espressione pET e contiene
un'origine di replicazione, un promotore ed un terminatore di trascrizione, che sono
specifici per la RNA polimerasi del fago T7, separati da un "polylinker" contenente
siti unici di restrizione per il clonaggio delle sequenze eterologhe da esprimere. A
valle del promotore è presente anche una sequenza consensus "Shine-Dalgarno",
ossia una sequenza d'attacco al ribosoma che ottimizza la traduzione dei trascritti.
Inoltre il plasmide porta il gene per la resistenza all'antibiotico Kanamicina che serve
per selezionare le cellule che avranno acquisito il plasmide dopo la trasformazione.
La modifica consiste nell’introduzione della sequenza target HIS-tag,di una sequenza
codificante un peptide luminescente di 18 aminoacidi (LUMIOTM) e una sequenza di
taglio per la proteasi TEV.
Per il clonaggio del prodotto di amplificazione, il vettore precedentemente modificato
è stato digerito con gli enzimi di restrizione Bam-HI e StuI. Il prodotto di
amplificazione è stato digerito con il solo enzima Bgl II. Dopo la ligazione dei due
frammenti con l’enzima T4 DNA-ligasi, si è proceduto alla trasformazione per
elettroporazione del costrutto nel ceppo di E.Coli DH5α.
L’analisi dei profili di restrizione, effettuata sui plasmidi ricombinanti ottenuti, è stata
effettuata tramite l’utillizzo degli enzimi di restrizione Sac I e EcoR I. Una volta
analizzato il costrutto ricombinante, si è proceduto alla sua trasformazione nel ceppo
di E.coli BL21- DE3, per lo svolgimento delle prove di espressione della proteina
ZnuA.
Singole colonie sono state inoculate in 50 ml ZYP autoindotto con Kanamicina 50
µg/ml.
Sono state prese aliquote di 1 ml dalla coltura a distanza di 2, 4, 6 e 24 h; dopo
centrifugazione a 13000 x g per 3 min, si separa il sovranatante, che viene rilasciato
nel terreno di coltura, dal pellet batterico, il quale viene risospeso in un isovolume di
PBS 0.2 M pH 6.5. Il pellet batterico viene sonicato (5 cicli da 20 sec a 45 W, 4 °C;)
per rompere le cellule e separare così la frazione solubile dai corpi di inclusione
rappresentati dal pellet che viene risospeso in PBS 0.2 M pH 6.5.
I campioni così ottenuti, sovranatante, frazione solubile e corpi di inclusione sono
stati trattati con i reagenti del LUMIO e caricati su un gel di proteine. Quando la
proteina è espressa il LUMIO in presenza dei suoi reagenti si accende ed è visibile se
sottoposto a radiazioni UV.
A questo punto il gel di acrilamide è stato esposto su di un transilluminatore, e la
banda corrispondente alla mia proteina si è accesa nella frazione dei corpi di
inclusione.
Ora quello che mi propongo di fare è scrivere un protocollo di purificazione per
ottenere la proteina pura da cristallizzare.