CLONAGGIO ED ESPRESSIONE DELLA PROTEINA ZNUA Lo Zinco è un nutriente essenziale per la crescita di tutti gli organismi ed è un cofattore strutturale o catalitico in numerose metallo proteine, l’eccessiva concentazione di zinco interferisce con le funzioni vitali della cellula, per questo la sua concentrazione intracellulare deve essere altamente regolata. In questi ultimi anni sono stati scoperti sistemi di trasporto di zinco in diverse specie batteriche, il mio lavoro consiste nello studio del trasportatore di zinco ZnuA di Escherichia Coli per determinare la sua struttura e la sua importanza nella virulenza batterica. Il gene codificante per la proteina ZnuA è stato amplificato mediante una reazione di PCR con l’utilizzo della Taq Expande High Fidelity e con i primers ZnuA Lumio Fw e ZnuA Lumio Rev così disegnati: ZnuA Lumio Fw : ctctgccgttgtcgcttcg ZnuA Lumio Rev : ggagatctttaatctcctttcaggcagc Il primo primer permette la formazione di un sito blunt nella sequenza genica da amplificare, il secondo invece introduce il sito di restrizione per l’enzima Bgl II ,per consentire il clonaggio nel vettore di espressione pET160 modificato. Il vettore pET 160 appartiene alla famiglia dei vettori di espressione pET e contiene un'origine di replicazione, un promotore ed un terminatore di trascrizione, che sono specifici per la RNA polimerasi del fago T7, separati da un "polylinker" contenente siti unici di restrizione per il clonaggio delle sequenze eterologhe da esprimere. A valle del promotore è presente anche una sequenza consensus "Shine-Dalgarno", ossia una sequenza d'attacco al ribosoma che ottimizza la traduzione dei trascritti. Inoltre il plasmide porta il gene per la resistenza all'antibiotico Kanamicina che serve per selezionare le cellule che avranno acquisito il plasmide dopo la trasformazione. La modifica consiste nell’introduzione della sequenza target HIS-tag,di una sequenza codificante un peptide luminescente di 18 aminoacidi (LUMIOTM) e una sequenza di taglio per la proteasi TEV. Per il clonaggio del prodotto di amplificazione, il vettore precedentemente modificato è stato digerito con gli enzimi di restrizione Bam-HI e StuI. Il prodotto di amplificazione è stato digerito con il solo enzima Bgl II. Dopo la ligazione dei due frammenti con l’enzima T4 DNA-ligasi, si è proceduto alla trasformazione per elettroporazione del costrutto nel ceppo di E.Coli DH5α. L’analisi dei profili di restrizione, effettuata sui plasmidi ricombinanti ottenuti, è stata effettuata tramite l’utillizzo degli enzimi di restrizione Sac I e EcoR I. Una volta analizzato il costrutto ricombinante, si è proceduto alla sua trasformazione nel ceppo di E.coli BL21- DE3, per lo svolgimento delle prove di espressione della proteina ZnuA. Singole colonie sono state inoculate in 50 ml ZYP autoindotto con Kanamicina 50 µg/ml. Sono state prese aliquote di 1 ml dalla coltura a distanza di 2, 4, 6 e 24 h; dopo centrifugazione a 13000 x g per 3 min, si separa il sovranatante, che viene rilasciato nel terreno di coltura, dal pellet batterico, il quale viene risospeso in un isovolume di PBS 0.2 M pH 6.5. Il pellet batterico viene sonicato (5 cicli da 20 sec a 45 W, 4 °C;) per rompere le cellule e separare così la frazione solubile dai corpi di inclusione rappresentati dal pellet che viene risospeso in PBS 0.2 M pH 6.5. I campioni così ottenuti, sovranatante, frazione solubile e corpi di inclusione sono stati trattati con i reagenti del LUMIO e caricati su un gel di proteine. Quando la proteina è espressa il LUMIO in presenza dei suoi reagenti si accende ed è visibile se sottoposto a radiazioni UV. A questo punto il gel di acrilamide è stato esposto su di un transilluminatore, e la banda corrispondente alla mia proteina si è accesa nella frazione dei corpi di inclusione. Ora quello che mi propongo di fare è scrivere un protocollo di purificazione per ottenere la proteina pura da cristallizzare.